姜黃素對(duì)H2O2致H9c2心肌細(xì)胞損傷的抗凋亡作用及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用研究

顧長(zhǎng)海 李忠 陳冬玲

摘 要 目的：探討姜黃素對(duì)H2O2致H9c2心肌細(xì)胞損傷的抗凋亡作用及對(duì)核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。方法：將大鼠H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、損傷模型組和姜黃素低、中、高劑量組（25、50、100 μmol/L）。正常對(duì)照組不作任何干預(yù);損傷模型組細(xì)胞以50 μmol/L H2O2誘導(dǎo)12 h以建立損傷模型;姜黃素各劑量組經(jīng)相應(yīng)濃度藥物預(yù)處理24 h后，再以50 μmol/L H2O2誘導(dǎo)12 h。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用MTT法和TUNEL法分別檢測(cè)細(xì)胞的存活率和凋亡率;采用WTS-8法和顯色法分別檢測(cè)細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量;采用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）陽(yáng)性表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度;采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平;采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，損傷模型組細(xì)胞的存活率和SOD活性均顯著降低，細(xì)胞凋亡率、MDA含量、LC3陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)熒光強(qiáng)度以及NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平以及p-NF-κB/NF-κB比值均顯著升高（P<0.05）。與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細(xì)胞存活率和SOD活性均顯著升高，細(xì)胞凋亡率、MDA含量、LC3陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)熒光強(qiáng)度以及NF-κB p65 mRNA和NF-κB/p65、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：姜黃素能夠提高H2O2致?lián)p傷H9c2心肌細(xì)胞的存活率、降低其凋亡率，提高心肌細(xì)胞中SOD活性并降低MDA含量;上述作用可能與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 姜黃素;H9c2細(xì)胞;心肌細(xì)胞損傷;抗凋亡作用;核因子κB信號(hào)通路

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the anti-apoptotic effect of curcumin on H2O2-induced H9c2 cardiomyocyte injury and the regulation of NF-κB signaling pathway. METHODS： H9c2 cardiomyocyte were randomly divided into normal control group， injury model group， curcumin low-dose， medium-dose and high-dose groups （25， 50， 100 μmol/L）. Normal control group didnt received any intervention. The cells in injury model group were induced with 50 μmol/L H2O2 for 12 h to establish the injury model. The cells in curcumin groups were treated with relevant concentration of drugs for 24 h， and then induced with 50 μmol/L H2O2 for 12 h. After cultured for 24 h， survival rate and apoptotic rate of cells were measured by MTT method and TUNEL method; SOD activity and MDA content were determined by WTS-8 assay and color test; relative fluorescence intensity of LC3 positive expression was detected by immunofluorescence method; mRNA expression of NF-κB p65 in cells was detected by real-time PCR; Western blotting assay was used to detect the protein expression of NF-κB p65 and p-NF-κB p65 in cells. RESULTS： Compared with normal control group， survival rate and SOD activity were decreased significantly in injury model group， while apoptotic rate， MDA content， relative fluorescence intensity of LC3 positive expression， mRNA expression of NF-κB， protein expression of NF-κB p65 and p-NF-κB p65 as well as p-NF-κB/NF-κB were increased significantly （P<0.05）. Compared with injury model group， survival rates and SOD activities were increased significantly in curcumin groups， while apoptotic rates， MDA contents， relative fluorescence intensities of LC3 positive expression， mRNA expression of LC3 positive cells， protein expression of NF-κB p65 and p-NF-κB p65 as well as p-NF-κB p65/NF-κB p65 were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Curcumin can increase the survival rate of H2O2-induced H9c2 cardiomyocyte injury， decrease its apoptotic rate， increase SOD activity and decrease MDA content in cardiomyocytes. Above effects may be related to the regulation of NF-κB signaling pathway.

KEYWORDS ? Curcumin; H9c2 cells; Cardiomyocyte injury; Anti-apoptotic effect; NF-κB signaling pathway

心血管疾病嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，是目前病死率最高的疾病[1]。心血管疾病發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，心肌細(xì)胞損傷是各種心血管疾病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[2]。有研究指出，氧化應(yīng)激可引起心肌細(xì)胞凋亡，損傷心肌細(xì)胞功能并引發(fā)心力衰竭等心血管系統(tǒng)疾病[2]。核因子κB（NF- ?κB）信號(hào)通路是調(diào)節(jié)體內(nèi)多種組織細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要信號(hào)通路。已有研究證實(shí)，NF-κB信號(hào)通路的異常激活與心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。姜黃素是從姜科、天南星科植物的根莖中提取得到的化合物，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種藥理作用[5]。近年來(lái)研究表明，該化合物對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有顯著的改善和修復(fù)作用[6]，但其對(duì)受損心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及NF-κB信號(hào)通路的影響目前尚未見(jiàn)明確報(bào)道。為此，本研究擬初步探討姜黃素對(duì)H2O2致心肌細(xì)胞損傷的抗凋亡作用以及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，旨在為該化合物的臨床應(yīng)用及心肌細(xì)胞損傷的藥理作用研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Gallios型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）;Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;HERAcell型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan Sky型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司];ECO 48型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（英國(guó)PCRmax公司）;MP4型垂直電泳儀、ChemiDocTouch型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）;XSP-12CAC型光學(xué)顯微鏡（上海締倫光學(xué)儀器有限公司）;TCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司）;QL-9001型振蕩器（海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠(chǎng)）。

1.2 藥品與試劑

姜黃素對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：20191022，純度：≥96%）;MTT檢測(cè)試劑盒（北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：YS171211A）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：180223CC）;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（南京威特曼生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：180115001）;細(xì)胞裂解液（南京碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：180221A）;胰酶細(xì)胞消化液（批號(hào)：C0201）、免疫染色洗滌液（批號(hào)：P0106）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0012）、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C1088）、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒（WST-8法）（批號(hào)：S0101）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0131S）、NF-κB p65兔單克隆抗體（批號(hào)：AF1234）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）兔單克隆抗體（批號(hào)：AF5881）和GAPDH兔單克隆抗體（批號(hào)：AF1186）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：A0208）、Alexa Fluor 350標(biāo)記的山羊抗兔免疫熒光染色試劑盒（含熒光標(biāo)記的IgG二抗，批號(hào)：P0175）、青霉素-鏈霉素混合溶液（批號(hào)：C0222）、二甲亞砜（DMSO，批號(hào)：ST038）、胎牛血清（批號(hào)：C0227）、封閉液（批號(hào)：P0260）、抗熒光猝滅劑（批號(hào)：P0126）、TritonX-100試劑（批號(hào)：P0096）、TdT酶（批號(hào)：D3106）、熒光標(biāo)記液配制檢測(cè)液、Trizol試劑（批號(hào)：R0016）、RNA酶水（批號(hào)：R0022）、Western blotting顯色液（批號(hào)：P0018M）均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）兔單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：14600-1-AP）;DMEM/F12培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：31600）;4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染料（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：AF30A5123）;上、下游引物均由賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司設(shè)計(jì)、合成;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為雙蒸水。

1.3 細(xì)胞

大鼠H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，于-80 ℃凍存。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

取凍存的H9c2細(xì)胞，于37 ℃溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL無(wú)菌離心管中，加至適量含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“完全培養(yǎng)基”）中，以800 r/min離心5 min。棄去上清液，細(xì)胞加入適量完全培養(yǎng)基重懸后，接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），定期更換新鮮的完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 分組、造模與給藥

參照文獻(xiàn)方法[7]，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、損傷模型組[50 μmol/L H2O2（以不含血清和青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋?zhuān)和姜黃素低、中、高劑量組[25、50、100 μmol/L（以適量DMSO溶解后，再以不含血清和青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?劑量參照本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置]。其中，正常對(duì)照組細(xì)胞不作任何干預(yù)，常規(guī)培養(yǎng);損傷模型組細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h以復(fù)制細(xì)胞損傷模型;姜黃素各劑量組經(jīng)相應(yīng)濃度藥物預(yù)處理24 h后，再以50 μmol/L H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。

2.3 細(xì)胞存活率的檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥，并另設(shè)調(diào)零組（只加入不含血清和青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，不加細(xì)胞懸液），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，于避光條件下加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱中室溫避光孵育4 h后，棄去上清液，然后每孔加入DMSO 150 μL，置于振蕩器上振蕩5 min。使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（試驗(yàn)組細(xì)胞平均OD值-調(diào)零組細(xì)胞平均OD值）/（正常對(duì)照組細(xì)胞平均OD值-調(diào)零組細(xì)胞平均OD值）×100%。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

采用TUNEL法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的H9c2細(xì)胞，按5×104個(gè)/孔接種于放有細(xì)胞爬片的6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，取出細(xì)胞爬片，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗2次后，置于4%多聚甲醛溶液中于室溫固定30 min;用PBS清洗2次，用含0.3%TritonX-100試劑的PBS室溫孵育5 min;每孔加入TdT酶5 μL和熒光標(biāo)記液配制檢測(cè)液45 μL，于37 ℃避光孵育1 h，滴加DAPI熒光染料避光孵育5 min;用PBST溶液清洗5 min×4次以除去多余的染料，再以PBS清洗3次，經(jīng)中性樹(shù)脂封片。采用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)樹(shù)脂片進(jìn)行成像分析，對(duì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（即鏡下細(xì)胞核呈綠色熒光的凋亡細(xì)胞）進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞中SOD活性及MDA含量的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液適量，于冰上裂解30 min后，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液。經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，分別按WTS-8法和顯色法以酶標(biāo)儀檢測(cè)SOD活性和MDA含量，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞中LC3陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)

采用免疫熒光法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的H9c2細(xì)胞，按5×104個(gè)/孔接種于放有細(xì)胞爬片的6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，取出細(xì)胞爬片，于4%多聚甲醛溶液中固定15 min，用PBS清洗5 min×3次;用封閉液室溫封閉60 min，加入LC3一抗（稀釋度為1 ∶ 500），于4 ℃孵育過(guò)夜;用PBST溶液清洗后，加入Alexa Fluor 350標(biāo)記的IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 2 000），室溫避光孵育1 h;滴加DAPI熒光染料，避光孵育5 min;用PBST溶液清洗5 min×4次以除去多余的染料，加入抗熒光猝滅劑適量終止反應(yīng)。使用熒光顯微鏡觀察并拍照，采用Image J 1.6.0軟件分析試驗(yàn)組與正常對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度（LC3表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞染色后呈綠色熒光）。上述試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.7 細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的H9c2細(xì)胞，按1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中，加入Trizol試劑1 mL，靜置30 min，加入氯仿適量（約為離心管中試劑總體積的1/5），渦旋振蕩15 s后，以12 000 r/min離心15 min。取上清液，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻后冰浴10 min;以12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀加入70%乙醇1 mL，混勻;以12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀風(fēng)干后加入無(wú)RNA酶水溶解，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（共100 ?L）：10×擴(kuò)增緩沖液10 ?L，4×dNTPs 8 ?L，上、下游引物各1 ?L，模板cDNA 1 ?L，Taq DNA聚合酶 1 ?L，加水至100 ?L。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。NF-κB p65上游引物為5′-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCT-3′，下游引物為5′-GCCAAATCCGTTCACACCGACCT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為79 bp;β-actin上游引物為5′-TGGAGTCGGATAACTGCTCAGGAG-3′，下游引物為5′-AGACTGGAGTTCACCTGTGGATGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為102 bp。采用Applied Biosystems 7500 2.0.6熒光分析軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法計(jì)算NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 細(xì)胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blotting法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，按1×104個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白50 μg，于100 ℃變性5 min后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用封閉液室溫封閉1 h;加入NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 500），4 ℃孵育過(guò)夜;用PBST溶液清洗后，加入HRP標(biāo)記的二抗（稀釋度為 ?1 ∶ 2 000），室溫孵育1 h;用PBST溶液清洗后，以顯色液顯影。利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像并使用Image J 1.6.0軟件分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（GAPDH）的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，以p-NF-κB p65與NF-κB p65蛋白的灰度值比值表示NF-κB p65的磷酸化水平。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Graphpadprism 5軟件作圖。計(jì)量資料以x±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞存活率和凋亡率比較

與正常對(duì)照組比較，損傷模型組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，細(xì)胞存活率顯著降低，而凋亡率顯著升高（P<0.05）;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞存活率均顯著升高，而凋亡率均顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素劑量的增加，有細(xì)胞存活率逐漸升高、凋亡率逐漸降低的趨勢(shì)。各組細(xì)胞存活率和凋亡率的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，TUNEL法顯微圖見(jiàn)圖1（圖中，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，TUNEL表示凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，Merge表示兩者疊加）。

3.2 各組細(xì)胞中SOD活性和MDA含量比較

與正常對(duì)照組比較，損傷模型組細(xì)胞中SOD活性顯著降低，而MDA含量顯著升高（P<0.05）;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細(xì)胞中SOD活性顯著升高，而MDA含量顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素劑量的增加，有細(xì)胞中SOD活性逐漸升高、MDA含量逐漸降低的趨勢(shì)。各組細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 各組細(xì)胞中LC3陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)熒光強(qiáng)度比較

與正常對(duì)照組比較，損傷模型組細(xì)胞中LC3陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，其相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著升高（P<0.05）;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細(xì)胞中LC3陽(yáng)性表達(dá)有所減少，其相對(duì)熒光強(qiáng)度均顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素劑量的增加，LC3陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)熒光強(qiáng)度有逐漸減弱的趨勢(shì)。各組細(xì)胞中LC3陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3、圖2（圖中，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，LC3表示LC3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，Merge為兩者疊加）。

3.4 各組細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA以及NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較，損傷模型組細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著升高（P<0.05）;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細(xì)胞中上述指標(biāo)的表達(dá)水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素劑量的增加，上述指標(biāo)水平均有逐漸降低的趨勢(shì)。各組細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖3。

4 討論

隨著心血管疾病發(fā)病率的逐年升高，心肌細(xì)胞損傷與冠心病、心力衰竭、高血壓等多種心血管疾病的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)。有研究指出，長(zhǎng)期的氧化損傷狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致心肌組織細(xì)胞大量死亡，若不及時(shí)干預(yù)，可能會(huì)導(dǎo)致心肌功能喪失，引發(fā)心力衰竭等疾病;同時(shí)，心肌細(xì)胞的大量凋亡會(huì)釋放多種炎癥介質(zhì)，可進(jìn)一步加重心肌組織的氧化應(yīng)激損傷[8]。此外，心肌功能異?？赡軙?huì)導(dǎo)致腦等多個(gè)組織、器官發(fā)生供血不足，進(jìn)而引起其缺血性損傷，導(dǎo)致患者病死率升高[8]。

姜黃素是從姜科植物郁金Curcuma aromatica Salisb.的塊根、姜黃C. longa L.的根莖、莪術(shù)C. zedoaria （Berg.） Rosc.的根莖和天南星科植物菖蒲Acorus calamus L.的根莖中提取分離得到的單體化合物[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、調(diào)脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理作用[6，9]。近年來(lái)研究報(bào)道，姜黃素對(duì)膿毒癥、心肌缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激損傷等多種原因引起的心肌細(xì)胞損傷有明顯的改善作用[10-12]，提示姜黃素對(duì)心肌細(xì)胞損傷的藥理作用及機(jī)制值得進(jìn)一步深入探討。

H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷是目前實(shí)驗(yàn)室常用的一種心肌細(xì)胞損傷造模方法。H2O2作為易穿透細(xì)胞膜的活性氧成分，由于其性質(zhì)穩(wěn)定且易得，是細(xì)胞損傷模型常用的誘導(dǎo)劑[13]。H2O2誘導(dǎo)的損傷模型是研究體外細(xì)胞損傷最常用的模型，可最大程度地模擬體內(nèi)細(xì)胞損傷的病理生理過(guò)程[14]。本研究選用來(lái)源于胚胎期大鼠心臟組織的H9c2細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討姜黃素對(duì)H2O2致心肌細(xì)胞損傷的抗凋亡作用。SOD活性和MDA含量可反映細(xì)胞氧化損傷水平及對(duì)氧化應(yīng)激的自我調(diào)節(jié)能力，SOD活性降低、MDA含量升高，則表示心肌細(xì)胞自我修復(fù)能力降低[15]。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，損傷模型組細(xì)胞存活率和SOD活性均顯著降低，細(xì)胞凋亡率和MDA含量均顯著升高;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細(xì)胞存活率和SOD活性均顯著升高，細(xì)胞凋亡率和MDA含量均顯著降低。這提示姜黃素能夠改善H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，提高其存活率。

有研究指出，細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡之間存有復(fù)雜的交互調(diào)控關(guān)系，自噬作為一種程序性細(xì)胞死亡模式，也參與了心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生、發(fā)展[16]。在正常的生理狀態(tài)下，細(xì)胞維持低自噬狀態(tài)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，自噬增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境紊亂并促使細(xì)胞死亡，而細(xì)胞自噬主要依賴(lài)于自噬相關(guān)基因編碼的蛋白調(diào)控[17]。LC3是自噬膜表面標(biāo)記分子，其水平的改變能在一定程度上反映細(xì)胞的自噬狀態(tài)及水平[16-17]。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，損傷模型組細(xì)胞中LC3陽(yáng)性表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著升高;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細(xì)胞中LC3陽(yáng)性表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著降低，并有一定的劑量依賴(lài)趨勢(shì)。這提示H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡可能與細(xì)胞自噬密切相關(guān);姜黃素能夠抑制這種自噬，進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡。

NF-κB信號(hào)通路存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多種組織細(xì)胞中，能夠選擇性地與B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)[18]。NF-κB信號(hào)通路的激活與細(xì)胞外多種信號(hào)因子的變化有關(guān)，而細(xì)胞外信號(hào)因子則與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，開(kāi)啟了一連串下游的反應(yīng)，即在細(xì)胞因子、輻射、重金屬、病毒等多種外界因子的刺激下，NF-κB信號(hào)通路會(huì)被激活，進(jìn)而調(diào)控其上下游相關(guān)細(xì)胞通路及蛋白的表達(dá)[19]。然而，NF-κB信號(hào)通路的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)會(huì)引發(fā)自身免疫性疾病、慢性炎癥等的發(fā)生，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎的發(fā)生機(jī)制就與NF-κB信號(hào)通路激活及相關(guān)蛋白水平異常升高有關(guān)[20-21]。NF-κB信號(hào)通路的異常激活與心肌細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，例如韓笑等[22]的研究表明，缺血再灌注損傷模型大鼠心肌NF-κB信號(hào)通路被激活，加重了大鼠心肌組織的炎癥反應(yīng)及病理?yè)p傷，而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活則能減輕其心肌細(xì)胞的損傷;宋光蘭等[23]報(bào)道了花旗松素能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)改善缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷。由此可見(jiàn)，NF-κB信號(hào)通路在心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。有研究指出，NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平均能夠直接反映NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)狀態(tài)，p-NF-κB p65/NF-κB p65比值則能夠表示NF-κB p65的磷酸化水平，上述指標(biāo)的異常升高均能直接反映出NF-κB信號(hào)通路的異常激活[24]。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，損傷模型組細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著升高;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組上述指標(biāo)均顯著降低。這表明姜黃素改善H2O2致心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。

綜上所述，姜黃素能夠提高H2O2致?lián)p傷H9c2心肌細(xì)胞的存活率，降低其凋亡率，并提高SOD活性、降低MDA含量，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。目前，臨床上還沒(méi)有療效及機(jī)制確切的用于治療心肌細(xì)胞損傷的NF-κB信號(hào)通路抑制劑，故本研究暫未設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組。同時(shí)，由于研究時(shí)間及資金有限，本研究未能考察姜黃素對(duì)H9c2心肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路上下游其他相關(guān)蛋白及基因表達(dá)水平的影響，故在未來(lái)的研究中將對(duì)姜黃素靶向調(diào)節(jié)NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的作用進(jìn)行深入研究。

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（收稿日期：2020-05-21 修回日期：2020-09-28）

（編輯：張?jiān)拢?/p>