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    姜黃素干預(yù)耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及相關(guān)機(jī)制的研究

    2017-03-02 18:56:39陳灝詹建偉王利民陳清勇葉健
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2016年32期
    關(guān)鍵詞:肺腺癌姜黃素生物學(xué)特性

    陳灝 詹建偉 王利民 陳清勇 葉健

    [摘要] 目的 探討姜黃素對(duì)耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞的生物學(xué)特性影響以及干預(yù)其上皮間質(zhì)化過(guò)程(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的相關(guān)機(jī)制。 方法 采用體外姜黃素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞;分別通過(guò)形態(tài)學(xué)、MTT法、transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)姜黃素干預(yù)的耐藥細(xì)胞株的形態(tài)特征、藥物敏感性和侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化;通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波形蛋白、上皮鈣粘附分子在藥物作用后的表達(dá)差異以及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中相關(guān)蛋白 AKT、mTOR的變化情況。 結(jié)果 與人肺腺癌PC9細(xì)胞比較,PC9/ZD耐藥細(xì)胞株呈間質(zhì)樣細(xì)胞表型;與親代PC9/ZD細(xì)胞比較,經(jīng)姜黃素作用后的PC9/ZD細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性明顯增強(qiáng),轉(zhuǎn)移能力減弱(75.67±8.82 vs 103.67±13.67);侵襲能力減弱(17.22±3.63 vs 59.89±8.19);波形蛋白表達(dá)下調(diào)(1.07±0.23 vs 1.28±0.28),上皮鈣粘附分子表達(dá)上調(diào)(0.82±0.27 vs 0.29±0.11);AKT、mTOR磷酸化減弱(0.20±0.05 vs 0.63±0.17,0.72±0.25 vs 1.10±0.19)。 結(jié)論 姜黃素可以通過(guò)阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路而明顯干預(yù)耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。

    [關(guān)鍵詞] 肺腺癌;吉非替尼耐藥;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;生物學(xué)特性;姜黃素

    [中圖分類(lèi)號(hào)] R285.5;R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2016)32-0001-04

    吉非替尼作為一種常規(guī)治療肺癌的化療藥物,在臨床上有著不錯(cuò)的療效,但還有很多肺癌患者會(huì)出現(xiàn)原發(fā)性耐藥或繼發(fā)性耐藥的現(xiàn)象。已有研究表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是其獲得耐藥能力的重要因素之一[1,2]。目前,姜黃素公認(rèn)為是姜黃中最有效和最豐富的活性成分之一。一方面,姜黃素的抗炎、抗凝、抗氧化等作用不斷被人們所證實(shí)[3];另一方面,姜黃素的抗腫瘤機(jī)制也成為熱點(diǎn)[4]。本研究通過(guò)體外姜黃素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)特性的檢測(cè),分析其干預(yù)EMT過(guò)程的相關(guān)機(jī)制,旨在為進(jìn)一步研究姜黃素干預(yù)肺腺癌耐藥細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)所涉及的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或相關(guān)通路打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑和材料

    ①吉非替尼(Gefitinib)(阿斯利康制藥有限公司產(chǎn)品);②DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Thermo公司產(chǎn)品);③胰酶、PBS溶液(Hyclone公司產(chǎn)品);④人結(jié)腸癌PC9細(xì)胞株(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);⑤人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供);⑥甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、山羊抗兔IgG二抗、β-actin(biosharp公司產(chǎn)品);⑦M(jìn)atrigel膠、transwell小室、培養(yǎng)瓶、離心管(美國(guó)CORNING公司);⑧E-cadherin、Vimentin、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、GAPDH一抗(Abcam公司)。

    1.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

    采用倒置相差顯微鏡(OLYMPUS 200×)觀察人肺腺癌PC9細(xì)胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株。

    1.3 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

    將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株接種至5 cm×5 cm大小的培養(yǎng)瓶,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶80%左右進(jìn)行傳代??蓪⒓?xì)胞凍存在-80℃的超低溫冰箱中,解凍后細(xì)胞活力正常。

    1.4 吉非替尼對(duì)細(xì)胞抑制率的測(cè)定

    消化離心正常生長(zhǎng)的耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株,并調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL,在96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)平均分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,均加入用稀鹽酸溶解過(guò)濾后濃度為10 μg/mL的吉非替尼藥物溶液,調(diào)整每孔吉非替尼濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL,并在實(shí)驗(yàn)組的小孔中加入姜黃素(Cur),并調(diào)整每孔Cur含量為60 μmol/L。設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL;置于培養(yǎng)箱4 h后吸去上清液,每孔加DMSO 150 μL,振蕩3 min;采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tex)檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm的吸光度(OD值)。計(jì)算抑制率,公式為=(1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%。

    1.5 transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力

    ①轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):消化離心正常生長(zhǎng)的耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL,該組為對(duì)照組;向細(xì)胞懸液加入Cur,使Cur含量為60 μmol/L,細(xì)胞濃度也為5×104個(gè)/mL,該組為實(shí)驗(yàn)組;然后在每個(gè)transwell小室的上室中加入200 μL兩組細(xì)胞懸液,同時(shí)下室中加入含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基500 μL;放置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后小心吸去上下小室中的液體,并倒扣于濾紙上2 min;除去上室中未穿出的細(xì)胞;室溫固定15 min(4%多聚甲醛);染色20 min(0.1%結(jié)晶紫染色液);風(fēng)干后觀察、200倍鏡下拍照和計(jì)數(shù)(每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野)。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。②侵襲實(shí)驗(yàn):先在每個(gè)transwell小室的上室加入事先4℃過(guò)夜解凍并用DEME培養(yǎng)基稀釋6倍的Matrigel膠60 μL。細(xì)胞懸液密度變?yōu)?×104,其余步驟同轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。

    1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)

    常規(guī)培養(yǎng)的PC9/ZD細(xì)胞為對(duì)照組。預(yù)用含Cur含量為60 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的PC9/ZD細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。采用裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100)提取細(xì)胞總蛋白。蛋白濃度是由RIPA裂解液調(diào)整為5 μg/μL,然后使蛋白高溫下變性。配制分離和濃縮膠濃度為5%和10%,然后用恒壓100 V進(jìn)行電泳1 h,待電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜條件為冰浴、恒流2 h。封閉將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜在4℃過(guò)夜條件下進(jìn)行一抗處理。次日洗膜3次,進(jìn)行二抗處理,37℃、1 h。再次洗膜3次用ECL顯色后采用Quantity One軟件(Bio-Rad)進(jìn)行半定量比較分析。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,并進(jìn)行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞株形態(tài)

    倒置相差顯微鏡(OLYMPUS 200×)直接觀察人肺腺癌PC9細(xì)胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株。在200倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn),PC9細(xì)胞表現(xiàn)為上皮樣形態(tài),細(xì)胞大小均勻,為立方形或圓形;而PC9/ZD細(xì)胞株表現(xiàn)為間質(zhì)樣形態(tài),細(xì)胞大小不一,甚至為多邊形,細(xì)胞間距增大,并且有明顯的偽足(封三圖1)。

    2.2 吉非替尼對(duì)兩組細(xì)胞的抑制率比較

    吉非替尼對(duì)兩組細(xì)胞抑制效果見(jiàn)表1,并以吉非替尼濃度為橫坐標(biāo),細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo),繪制圖表(封三圖2)。結(jié)果顯示隨著吉非替尼濃度增加,吉非替尼對(duì)兩組細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng);并且在同樣藥物濃度作用下,實(shí)驗(yàn)組抑制率明顯高于對(duì)照組(除1.0 μg/mL)(P<0.05)。

    2.3 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力比較

    轉(zhuǎn)移和侵襲實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)分別為(103.67±13.67)和(59.89±8.19)。實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)分別為(75.67±8.82)和(17.22±3.63),表明姜黃素可以明顯干擾人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株轉(zhuǎn)移(t=2.77,P=0.011)和侵襲能力(t=2.41,P=0.016),見(jiàn)封三圖3。

    2.4 兩組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路p-AKT、p-mTOR比較

    Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較[蛋白相對(duì)含量E-cadherin和Vimentin分別為(0.29±0.11)和(1.28±0.28)],實(shí)驗(yàn)組的E-cadherin表達(dá)上調(diào)[蛋白相對(duì)含量為(0.82±0.27)],Vimentin表達(dá)下調(diào)[蛋白相對(duì)含量為(1.07±0.23)](圖1),表明姜黃素干預(yù)上皮間質(zhì)化的過(guò)程,使得上皮標(biāo)志蛋白表達(dá)上調(diào),間質(zhì)標(biāo)志蛋白表達(dá)下調(diào)。另一方面,相比于對(duì)照組[蛋白相對(duì)含量p-AKT和p-mTOR分別為(0.63±0.17)和(1.10±0.19)],實(shí)驗(yàn)組的p-AKT[蛋白相對(duì)含量為(0.20±0.05)]、p-mTOR[蛋白相對(duì)含量為(0.72±0.25)]也呈現(xiàn)低表達(dá)的狀態(tài)(圖2),說(shuō)明姜黃素阻斷PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路,進(jìn)而改變上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程。

    3討論

    肺腺癌的治療是一個(gè)多學(xué)科綜合治療的過(guò)程,包括手術(shù)、化療和靶向治療等。吉非替尼作為治療肺腺癌的臨床一線化療藥物應(yīng)用十分廣泛,主要從三個(gè)方面發(fā)揮藥理作用:①競(jìng)爭(zhēng)EGFR-TK催化區(qū)域上Mg-ATP結(jié)合位點(diǎn),阻斷其信號(hào)傳遞;②抑制有絲分裂原活化蛋白激酶的活化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;③抑制腫瘤血管[5]。但臨床上常發(fā)生腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象從而導(dǎo)致化療失敗和預(yù)后不良[6]。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥(MDR)可分為原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥兩種類(lèi)型[7]。

    目前,普遍認(rèn)為肺腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程以及獲得耐藥能力的過(guò)程中均可能與EMT有關(guān)。李優(yōu)等[8]研究表明,通過(guò)干預(yù)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可以使EMT相關(guān)的E-鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)發(fā)生改變,從而減弱經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí),一些經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路已經(jīng)被證實(shí),如HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄因子Snail家族、β-連環(huán)蛋白通路、β-連環(huán)蛋白與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途徑等[9-11]。此外還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲與其發(fā)生EMT時(shí)腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)上調(diào)、改變細(xì)胞微環(huán)境有關(guān)[12]。由此可見(jiàn),通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生能夠成為治療癌癥的新方向。

    姜黃素可以通過(guò)多種途徑干預(yù)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,如 Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)通路、PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB) 和STAT-3 信號(hào)通路等[8,13,14]。龐慧芳等[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的胰腺癌 PANC-1 細(xì)胞的EMT過(guò)程,降低胰腺癌的惡性程度從而達(dá)到治療的目的。姜黃素的抗腫瘤作用越來(lái)越被重視。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所已經(jīng)將其列為第三代抗癌預(yù)防藥,因?yàn)槠渲委熜Ч@著、不良反應(yīng)少、安全性高等特點(diǎn),在日本廣泛應(yīng)用[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于親代耐藥細(xì)胞,經(jīng)姜黃素處理的耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性明顯改善;轉(zhuǎn)移和侵襲能力也相應(yīng)地減弱;上皮間質(zhì)化標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)下調(diào),E-cadherin表達(dá)上調(diào)。上述結(jié)果均說(shuō)明姜黃素對(duì)耐吉非替尼肺腺癌生物學(xué)行為的改變甚至逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)化的過(guò)程。

    在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中,PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路扮演著重要角色[17]。在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均能發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路處于異常激活狀態(tài),與惡性腫瘤的各種生物學(xué)行為密切相關(guān)[18]。因此,針對(duì)該信號(hào)通路的研究和靶向藥物的應(yīng)用成為熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)使PI3K/AKT/ARK5信號(hào)通路處于活化狀態(tài)促進(jìn)Snail蛋白進(jìn)細(xì)胞核從而使細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化[19,20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于親代耐藥細(xì)胞,姜黃素改變耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞的AKT、mTOR蛋白磷酸化。上述結(jié)果同時(shí)與Vimentin表達(dá)下調(diào)、E-cadherin表達(dá)上調(diào)相吻合,共同說(shuō)明經(jīng)姜黃素處理后,耐吉非替尼肺腺癌上皮間質(zhì)化的過(guò)程被阻斷甚至逆轉(zhuǎn)。

    結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示姜黃素對(duì)耐吉非替尼肺腺癌上皮間質(zhì)化有明顯作用,為下一步實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ),進(jìn)一步研究分子機(jī)制,通過(guò)基因檢測(cè)等其他手段明確姜黃素藥理作用與EMT的內(nèi)在聯(lián)系,為逆轉(zhuǎn)EMT以及抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展提供新的證據(jù)。

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    [20] 任志濤. 小檗堿對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和MRC-5細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響[D]. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,清華大學(xué)醫(yī)學(xué)部,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2015.

    (收稿日期:2016-07-09)

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