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    芍藥湯對(duì)胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜核因子—κB DNA結(jié)合活性的影響

    2015-03-11 01:09:53羅敏李帥軍胡響當(dāng)
    關(guān)鍵詞:核因子潰瘍性結(jié)腸炎

    羅敏++++++李帥軍++++++胡響當(dāng)++++++王曉艷++++++林仁敬++++++楊周雨

    [摘要] 目的 研究芍藥湯對(duì)胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠核因子-κB(NF-κB)DNA結(jié)合活性的影響。 方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組:正常組,模型組,芍藥湯組,柳氮磺胺吡啶(SASP)組。制備胃腸濕熱型模型,然后采用三硝基苯磺酸(TNBS)制備灌腸法潰瘍性結(jié)腸炎模型,灌胃治療10 d后處死大鼠,取新鮮結(jié)腸黏膜標(biāo)本提取核蛋白,利用以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)為基礎(chǔ)的Trans AMTM NF-κB P65試劑盒檢測(cè)各組NF-κB相對(duì)活性。 結(jié)果 與正常組比較[(0.263±0.041)],模型組大鼠NF-κB相對(duì)活性明顯增高[(0.467±0.083)],差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01);與模型組比較,芍藥湯組大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB相對(duì)活性明顯降低[(0.271±0.089)],差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。 結(jié)論 芍藥湯能明顯降低胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型結(jié)腸黏膜NF-κB相對(duì)活性,可能是其治潰瘍性結(jié)腸炎作用的機(jī)制之一。

    [關(guān)鍵詞] 芍藥湯;胃腸濕熱;潰瘍性結(jié)腸炎;核因子-κB

    [中圖分類(lèi)號(hào)] R574.62;R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2015)01(c)-0004-03

    潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚未明確,其中免疫因素在此病中所起的作用越來(lái)越受重視,研究已深入到細(xì)胞分子水平,特別是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)調(diào)控著UC患者中細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子(cell adhesionmolecules,CAM)的釋放,從而參與了UC腸道的炎癥和免疫反應(yīng)。芍藥湯出自《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》,具有清熱燥濕、調(diào)氣和血的功效,根據(jù)多年的臨床研究,對(duì)于胃腸濕熱型UC,具有良好的療效,為求進(jìn)一步明確芍藥湯干預(yù)UC調(diào)節(jié)作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性,從基因水平探討芍藥湯干預(yù)UC的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    清潔級(jí)SD大鼠40只,體重180~220 g,購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[合格證號(hào):SCXK(湘)2011~0003],動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

    1.2 實(shí)驗(yàn)器材

    核蛋白提取試劑盒(武漢博士德生物公司);BCA-100蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒(西安晶彩生物科技有限公司);Tarns AMTM NF-κB酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海齊一生物物技有限公司);ZFMQ050PE型超純水器(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司);3K-30Z型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照藥物與試劑

    柳氮磺胺吡啶(SASP)(上海福達(dá)制藥有限公司,批號(hào):201310001,每片0.25 g),三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司),藥物用蒸餾水配成50 g/L。

    1.4 實(shí)驗(yàn)用藥的制備

    芍藥湯超微顆粒由芍藥、當(dāng)歸、黃連、檳榔、木香、黃芩、大黃、肉桂、甘草9味藥組成。組方超微顆粒由湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司提供,然后在湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑科,將藥物用蒸餾水制成含生藥1.32 g/mL水劑。

    1.5 實(shí)驗(yàn)方法

    1.5.1 造模及分組 將40只大鼠隨機(jī)分為4組,每組各10只,正常組、模型組、芍藥湯組、SASP組。除正常組外,其余3組首先參考文獻(xiàn)[1-2]復(fù)制胃腸濕熱模型:以高脂高糖飲食飼養(yǎng)大鼠,即在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上,加用200 g/L蜂蜜水自由飲用,每隔1 d按大鼠體重灌服油脂10 g/kg,并與油脂一起灌服10 mL/kg白酒,共10 d。然后再放入溫度(32±2)℃,相對(duì)濕度為95%的人工氣候箱中,共5 d。待胃腸濕熱型模型造模成功后,再予以TNBS灌腸法制作UC大鼠模型。造UC模型前予禁食24 h,除正常組,其余各組大鼠先用乙醚麻醉,然后從肛門(mén)將大鼠灌胃針頭輕輕插入,避免損傷腸道,深度約為8 cm,推入TNBS溶液(含25 mL/L TNBS和500 mL/L乙醇)4 mL/kg體重,捏緊肛門(mén)平放5 min即可,術(shù)后予以常規(guī)飼養(yǎng)。待造模4 d后,隨機(jī)從每組中抽出1只處死并解剖,游離其結(jié)腸組織,用生理鹽水洗凈后,觀察距肛門(mén)7~8 cm處見(jiàn)肉眼可辨潰瘍面,病理檢查發(fā)現(xiàn)充血、水腫、隱窩膿腫和典型的潰瘍等形成,確定造模成功。

    1.5.2 給藥方法與標(biāo)本留取 確定造模成功后第2天,將大鼠按體表面積折算成成人等效劑量給藥,芍藥湯組折算后為含生藥13.2 g/(kg·d),同理,SASP組折算后為0.5 g/(kg·d)。正常組和模型組大鼠用等體積量生理鹽水經(jīng)胃灌入。每組同時(shí)開(kāi)始按上述劑量給藥,1次/d,連續(xù)10 d。末次給藥24 h后,以脫頸椎法將大鼠處死,提取距肛門(mén)8 cm結(jié)腸組織,并沿縱軸剪開(kāi),在結(jié)腸病變最明顯處取0.5 cm結(jié)腸,以10%甲醛液固定、石蠟包埋,制成病理切片,HE染色后光鏡下查看;余下部分刮取結(jié)腸黏膜組織,每只大鼠刮取50 mg新鮮結(jié)腸黏膜,立即提取核蛋白。利用以ELISA為基礎(chǔ)的Trans AMTM NF-κB P65試劑盒檢測(cè)各組NF-κB相對(duì)活性。

    1.6 觀察指標(biāo)

    ①觀察大鼠的體重、大便、食欲、活動(dòng)度、精神狀態(tài)等;②結(jié)腸大體病理及組織學(xué)改變:觀察大鼠結(jié)腸黏膜的色澤、潰瘍、糜爛、等情況,觀察黏膜有無(wú)水腫、糜爛、潰瘍、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)等改變;③利用以ELISA為基礎(chǔ)的Trans AMTM NF-κB P65試劑盒檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    應(yīng)用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠一般情況

    正常組大鼠體重、大便、飲食、活動(dòng)均正常。其余3組大鼠在造模后3 d內(nèi)均逐漸出現(xiàn)蜷縮、倦怠懶動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、拱背、便軟、便溏等癥狀,有的黏液便甚至可見(jiàn)肉眼血便。造模第4天每組隨機(jī)抽出一只處死后取結(jié)腸,除正常組外剩下各組結(jié)腸組織肉眼可見(jiàn)潰瘍面。芍藥湯組和陽(yáng)性對(duì)照組在用藥4 d以后,上述情況開(kāi)始逐漸改善,進(jìn)食量明顯增加,伴隨體重增加明顯,到用藥后期時(shí),大便多呈顆粒狀,黏液便、血便等基本消失。模型組后期血便等癥狀有所改善,但大便仍不成形并大便臭穢。

    2.2 結(jié)腸大體病理及組織學(xué)改變

    正常組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊,腺體結(jié)構(gòu)規(guī)則,各層次構(gòu)造清楚,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞及潰瘍(圖1 a,封三)。其余組所取結(jié)腸組織可見(jiàn)黏膜充血、水腫、糜爛、潰瘍,有的出現(xiàn)瘢痕形成,部分結(jié)腸擴(kuò)張、黏膜皺襞變淺,以模型組最為嚴(yán)重(圖1 b,封三)。SASP組和芍藥湯組病變明顯減輕,可見(jiàn)充血、水腫、糜爛和紅色瘢痕(圖1 c~d,封三)。

    2.3 NF-κB 活性

    與正常組比較,模型組大鼠NF-κB相對(duì)活性明顯增高,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01);與模型組比較,芍藥湯組大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB相對(duì)活性明顯降低,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。見(jiàn)表1。

    3 討論

    UC臨床上主要以腹瀉為主,排出含有血、膿和黏液的糞便,同時(shí)常伴有陣發(fā)性結(jié)腸痙攣性疼痛,并里急后重,排便后可獲緩解。本實(shí)驗(yàn)中的大鼠在采用TNBS造模成功后均出現(xiàn)腹瀉、黏液膿血便等癥狀,腸道主要表現(xiàn)為水腫、充血、糜爛,鏡下可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn),在病理學(xué)和免疫學(xué)特征上與潰瘍性結(jié)腸炎病患者相似[3-6]。潰瘍性結(jié)腸炎是多種因素、多種機(jī)制相互作用的結(jié)果。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn),各種細(xì)胞因子能夠相互作用形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),加重炎性反應(yīng),從而導(dǎo)致黏膜損傷,這在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用[6-7]。

    有研究表明,許多與炎癥和免疫反應(yīng)關(guān)系密切的趨化因子、黏附因子等重要因子均含有κB位點(diǎn),活化的NF-κB能與特定的κB位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)調(diào)節(jié)參與機(jī)體的炎癥和免疫有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄,在機(jī)體的炎癥、免疫方面發(fā)揮重要作用[9-13]。NF-κB是可跟γ-球蛋白輕鏈基因的增強(qiáng)子GGGACTTTCC(B序列)結(jié)合的一種核蛋白,它在基因表達(dá)的先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖及分化中有重大作用,其中作為誘導(dǎo)UC發(fā)病的促炎因子如腫瘤壞死因子α、白介素6等,已被證實(shí)由核因子κB調(diào)節(jié)控制他們的轉(zhuǎn)錄水平,核因子κB的活化可以控制多種促炎因子的基因轉(zhuǎn)錄,這證明它在UC發(fā)病中的作用重大,UC發(fā)病時(shí)NF-κB呈過(guò)激活狀,放大炎性反應(yīng)[13-18]。

    芍藥湯出自《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》,具有清熱燥濕、調(diào)氣和血的功效。在臨床運(yùn)用中,針對(duì)胃腸濕熱型的UC能取得很好的治療效果。方中黃芩、黃連性味苦寒,入大腸經(jīng),具有清熱燥濕解毒的功效,以除致病之因,為君藥。方中重用芍藥養(yǎng)血和營(yíng)、緩急止痛,再配以當(dāng)歸養(yǎng)血活血,體現(xiàn)了“行血?jiǎng)t便膿自愈”之義,且可兼顧濕熱邪毒熏灼腸絡(luò),傷耗陰血之慮;木香、檳榔行氣導(dǎo)滯,“調(diào)氣則后重自除”,四藥相配,調(diào)和氣血,是為臣藥。大黃苦寒沉降,合芩連則清熱燥濕之功著,合歸、芍則活血行氣之力彰,其瀉下通腑作用可通導(dǎo)濕熱積滯從大便而去,體現(xiàn)“通因通用”之法。方以少量肉桂,其辛熱溫通之性,既可助歸、芍行血和營(yíng),又可防嘔逆拒藥,屬佐助兼反佐之用。炙甘草和中調(diào)藥,與芍藥相配,又能緩急止痛,亦為佐使。諸藥合用,濕去熱清,氣血調(diào)和,故下痢可愈。

    本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)芍藥湯治療過(guò)的胃腸濕熱型UC大鼠,其結(jié)腸NF-κB的表達(dá)顯著降低,可能是芍藥湯阻斷NF-κB的激活,減少NF-κB的活化誘導(dǎo)因素從而降低了NF-κB p65的表達(dá),起到治療UC的作用。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2014-10-19 本文編輯:蘇 暢)

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