超高效液相色譜-三重四極桿質譜法檢測油脂和油炸食品中7種雜環(huán)胺類物質

張晨霞,馬宇翔,趙天培,席 俊,李 潘,郭 慶,史莉莉,汪學德

(河南工業(yè)大學糧油食品學院,河南 鄭州 450001)

雜環(huán)胺(heterocyclic aromatic amines,HCAs)是高溫加工蛋白質豐富的食品時形成的一類致癌性、致突變性化合物[1-3],主要存在于油炸燒烤食品。HCAs在代謝過程中環(huán)外氨基經(jīng)酶催化形成N-羥基衍生物,并進一步與DNA共價結合形成加合物。鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗表明,HCAs有較強的致突變性[4-7]。長期動物實驗證明,HCAs有致癌性,可以引起嚙齒動物體內多種器官產(chǎn)生腫瘤,包括肝臟[4,8]、結腸[9]、乳腺[9,10]、大小腸[11]和胃[12]等。目前為止,分離和鑒定出超過25種HCAs。HCAs可以分為極性和非極性兩類。極性雜環(huán)胺是碳水化合物、氨基酸和肌酸酐(肌酐)在150～250 ℃下形成的氨基喹喔啉類、氨基喹啉類和氨基吡啶類等化合物,而非極性HCAs是氨基酸在250 ℃下高溫分解產(chǎn)生的咔啉類和苯基吡啶類化合物[13,14]。

目前還沒有充足證據(jù)證明HCAs在人體器官中能誘導腫瘤細胞生成,但流行病學研究表明,高HCAs含量肉制品的食用與不同癌癥之間有直接的相關性[15,16]。Wolk[17]強調50 g/d的加工肉制品的攝入可以增加患癌的可能性,患前列腺癌、結腸癌、乳腺癌和胰腺癌的風險分別增加4%、18%、9%和19%,其與加工肉制品中雜環(huán)胺類物質有關。雖然HCAs還沒有標準限量的規(guī)定,但是國內外學者對HCAs的研究日益增多,主要集中在加工肉制品中HCAs的生成規(guī)律[18]和抑制作用研究[1,19]。

油脂和油炸食品的安全性備受關注,但目前針對油脂和油炸食品中HCAs的研究較少[18-23]?，F(xiàn)在國外對油脂和油炸食品中極性組分、多環(huán)芳烴和雜環(huán)胺等有害物質的重視程度極高,并在HCAs生成的模擬體系中發(fā)現(xiàn)油脂氧化產(chǎn)物可以促進HCAs生成[20,24],因此,在油脂及油炸食品中HCAs的研究十分必要。

HCAs是弱堿性化合物,具有低揮發(fā)性、高水溶性,部分HCAs缺乏紫外生色團結構,還有部分HCAs沒有熒光特性[25],故HCAs的檢測方法一直是研究的難點。隨著液相色譜-質譜法在食品中的應用,大多研究者采用該方法對HCAs進行檢測[26-29]。GB 5009.243-2016標準適用于烤魚、烤肉及其制品中HCAs的檢測,采用氫氧化鈉的甲醇溶液提取,苯乙烯二乙烯基苯共聚物固相萃取柱凈化,其回收率為63.3%～124%,精密度為6.26%～18.2%。但目前還未有油脂和油炸食品中HCAs的檢測標準[25]。油炸食品基質復雜,HCAs種類多,含量低[11],關于油炸食品中HCAs的檢測方法一直是研究的重點和難點。目前油炸食品中HCAs的檢測方法較少,油脂中HCAs的檢測方法還未見報道。因此,本文通過堿性有機溶劑萃取,建立了超高效液相色譜-三重四極桿質譜測定油脂和油炸食品中HCAs含量的方法,為市場上油脂和油炸食品的含量水平檢測提供方法依托,同時也為評價油脂和油炸食品的安全性提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Acquity UPLC CLASS超高效液相色譜儀、Xevo TQD三重四極桿質譜儀,配電噴霧電離(ESI)源(美國Waters公司);ME204E電子天平(感量0.1 mg)、XPE26DR電子天平(感量0.01 mg)(瑞士Mettler Toledo公司);Multipette E3x電動移液器(德國Eppendorf公司);FM 200間歇式高剪切均質機(德國Fluko公司);MTN-2800W氮吹濃縮儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);Visiprep DL真空固相萃取裝置(美國Supelco公司);摩爾細胞型超純水器(電阻18.25 MΩ·cm)(重慶Molecular水處理設備有限公司)。

HCAs標準品(純度>98%):2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(IQ)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(MeIQ)、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,7,8-TriMeIQx)(內標物)、2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Harman)、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Norharman)購自上海源葉生物科技有限公司;乙腈、甲醇、正己烷(色譜純,美國Sigma公司);甲酸銨(LC-MS級,美國Thermo Fisher公司);氨水(純度25.0%～28.0%)、濃鹽酸(純度36.0%～38.0%)(天津科密歐試劑有限公司);超純水為實驗室自制。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取8種HCAs的標準品(精確至0.01 mg),置于10 mL棕色瓶中,用甲醇配制質量濃度為100 mg/L的單標準儲備液,于-40 ℃儲存。根據(jù)檢測樣品中HCAs的測定要求,用甲醇分別稀釋成含20 μg/L內標物4,7,8-TriMeIQx的系列混合標準工作液,其中IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx稀釋梯度為0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg/L,PhIP、Harman、Norharman為1、2、5、10、25、50、100 μg/L,于-20 ℃棕色瓶中保存。

內標工作液:取4,7,8-TriMeIQx單標準儲備液,用甲醇配制成500 μg/L的內標工作液,于-20 ℃棕色瓶中保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

油炸食品:稱取2 g試樣(精確至0.01 g),置于50 mL聚丙烯離心管中,加入80 μL內標工作液、10 mL含1% (體積分數(shù))氨水的乙腈溶液,以10 000 r/min均質提取1 min,以3 500 r/min離心5 min,收集上清液于另一個離心管中,再加入10 mL含1%(體積分數(shù))濃氨水的乙腈溶液重復提取一次,合并兩次上清液,加入10 mL乙腈飽和的正己烷脫脂,取10 mL提取液待凈化。

油脂:稱取1 g試樣(精確至0.01 g),置于50 mL聚丙烯離心管中,加入80 μL內標工作液、10 mL含1% (體積分數(shù))氨水的乙腈溶液,渦旋混合5 min,超聲10 min,以3 500 r/min離心5 min,收集上清液于另一個離心管中,再加入10 mL含1%(體積分數(shù))氨水的乙腈溶液重復提取一次,合并兩次上清液,加入10 mL乙腈飽和的正己烷脫脂,取10 mL脫脂后的提取液待凈化。

1.3.2凈化

將10 mL提取液,上樣于預先用3 mL甲醇、3 mL超純水活化的PCX固相萃取柱,上樣速度為1 mL/min,然后用3 mL 0.1 mol/L鹽酸和3 mL甲醇淋洗,淋洗后抽干1 min,用3 mL甲醇-氨水(95∶5,v/v)洗脫,收集全部洗脫液,于45 ℃氮吹至近干,用500 μL甲醇復溶,過0.22 μm有機濾膜,待測定。

1.4 UPLC-ESI-MS/MS分析

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:20 ℃;流動相:A為10 mmol/L甲酸銨溶液(pH=6.80),B為乙腈;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.2 min,10%B;0.2～1.0 min,10%B～30%B;1.0～3.0 min,30%B～60%B;3.0～3.5 min,60%B～90%B;3.5～5.0 min,90%B。進樣體積:1 μL。

離子源:ESI源,正離子模式;離子源溫度:110 ℃;毛細管電壓:0.5 kV;脫溶劑溫度:650 ℃;脫溶劑氣(N2,純度99.9%)流速:1 000 L/h;錐孔氣(N2,純度99.9%)流速:50 L/h;碰撞氣:氬氣,純度99.9%。采用多反應監(jiān)測模式進行檢測,其他質譜參數(shù)見表1。

表1 7種HCAs的質譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the seven heterocyclic aromatic amines (HCAs)

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

首先將質量濃度為500 μg/L的雜環(huán)胺化合物標準溶液在正離子模式下進行母離子全掃描,然后根據(jù)Masslynx 4.1自動調諧功能進行調諧,在MRM模式下優(yōu)化各種質譜參數(shù),得到最佳質譜條件,7種HCAs的質譜參數(shù)見表1。

2.2 流動相條件的優(yōu)化

流動相的選擇顯著影響HCAs在色譜柱上的分離和保留行為。8種HCAs均為弱堿性化合物,其在流動相中的解離能力和溶解性隨著流動相的變化而變化。有文獻[30,31]報道，在流動相中添加有機酸鹽，如甲酸銨和乙酸銨等可以提高HCAs的離子化效率，改善峰形，提高靈敏度。本研究考察了在流動相中添加甲酸銨對HCAs分離效果的影響。結果發(fā)現(xiàn)，10 mmol/L甲酸銨溶液能使 7 種HCAs的響應值增加，得到的色譜峰峰形較窄，峰對稱性良好。

有文獻[25]表明，有機酸，如甲酸、乙酸等的添加可以增加HCAs的離子化效率，同時影響色譜柱填料與HCAs之間的作用力，使得HCAs的保留時間縮短。為了進一步縮短分析時間，本實驗考察在流動相中添加甲酸對HCAs分離效果的影響。結果發(fā)現(xiàn)，IQ、MeIQx的色譜峰峰形較寬，色譜峰發(fā)生重疊，其原因可能是甲酸的添加使得色譜柱對IQ、MeIQx兩種物質的保留能力較弱。

綜合考慮，最終選擇10 mmol/L甲酸銨溶液作為流動相中的水相，得到的色譜峰峰形尖銳，對稱性好，在5 min內可實現(xiàn)對HCAs的快速分離。

2.3 提取和凈化條件的優(yōu)化

油脂和油炸食品成分復雜,其中HCAs的含量較低,在對HCAs分析時,通常需對樣品進行萃取、富集和凈化等前處理操作。

固相萃取方法被廣泛應用于樣品凈化操作。為了達到較佳的凈化效果,Gross和Grüter[14]使用丙基磺酸陽離子固相萃取柱和C18小柱串聯(lián)對提取液富集凈化,可以完成對極性和非極性HCAs的分離,但兩個固相萃取柱串聯(lián)的凈化操作成本較高,過程繁瑣,且溶液轉移時易造成損失,對操作要求嚴格?；旌详栯x子交換小柱,填料為改性的苯乙烯-二乙烯苯共聚物,對堿性和中性化合物有著很好的選擇性,廣泛應用于食品基質中目標產(chǎn)物的檢測。本實驗分別考察了PCX (60 mg/3 mL)、MCX (60 mg/3 mL)和Lichrolut EN?(60 mg/3 mL)固相萃取柱對HCAs回收率的影響。Lichrolut EN?屬于苯乙烯二乙烯基苯共聚物固相萃取柱,對極性有機物有較強的吸附能力,但是對7種HCAs的回收率較低,可能與所選洗脫溶劑關。PCX和MCX小柱屬于混合陽離子交換柱,吸附目標性較強,對7種HCAs的回收率分別為80.40%～99.60%和74.01%～89.36%,相對來說,采用PCX小柱時HCAs的回收率更高。因此,實驗最終確定PCX柱對樣品溶液進行凈化,可以較好去除極性和非極性物質,達到凈化要求的同時可獲得較高的回收率。

HCAs易溶于水和有機溶劑。常用的提取溶液有NaOH、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等[32,33]。油脂及油炸食品中脂肪含量較高,提取溶液的選擇極其重要。選擇的提取溶液既要對HCAs有較高的提取效率,又要在提取過程中易與基質分離,有利于后續(xù)固相萃取操作。乙腈被認為是一種極性中等偏強的有機溶劑(極性系數(shù)為5.8),乙腈與甘三酯類物質不互溶或者微溶,常用于油脂中有害物質的提取,如多環(huán)芳烴和雜環(huán)胺[34,35],同時具有較低的黏度和密度,更加有利于樣品中固體雜質與提取溶液的分層,便于分離操作。Yan等[34]用乙腈提取HCAs時,加標回收率僅為42.5%～99.0%,需要進行優(yōu)化。雜環(huán)胺為堿性物質,其回收率取決于提取溶液的pH值。隨著提取溶液pH值的增加,雜環(huán)胺的去離子化程度增大,疏水性加強,其在有機溶劑中的溶解度增大,從而提高雜環(huán)胺的回收率[27]。郭海濤等[27]研究了提取溶液NaOH溶液的濃度變化對HCAs的影響,發(fā)現(xiàn)隨著NaOH濃度的增加，極性和非極性雜環(huán)胺的回收率呈上升趨勢。Zhang等[31]表明IQ、MeIQ、MeIQx和4,8-DiMeIQx在提取溶液偏堿性(pH值為7.0～8.5)時的回收率高。

圖1 提取溶劑對HCAs回收率的影響(n=3)Fig.1 Effect of extraction solvents on the recoveries of the HCAs (n=3) ACN:acetonitrile;alkalized ACN:ACN containing 1% (v/v)ammonia water;oil:soybean oil;food:fried chicken breast.

本文考察了乙腈和含1%(體積分數(shù))氨水的乙腈溶液作為提取溶液時油脂和油炸食品中HCAs的提取效率(見圖1)。結果顯示,采用乙腈溶劑提取時HCAs的回收率為51.57%～94.42%;采用含1%(體積分數(shù))氨水的乙腈溶液為提取溶液時,IQ、4,8-DiMeIQx、PhIP、Harman、Norharman的回收率的均在70%以上,而MeIQ和MeIQx的回收率有所降低，但均大于68%。氨水可以改變乙腈的pH值,使HCAs更容易溶解于有機溶劑中,從而使得回收率提高。因此,本研究采用含1% (體積分數(shù))氨水的乙腈溶液作為提取溶液。需要注意的是,乙腈和氨水均有刺鼻氣味,因此前處理操作最好在通風櫥中進行。

圖2 (a)甲醇、(b)大豆油提取液、(c)油炸雞胸肉提取液和(d)混合標準溶液(20 μg/L)中7種HCAs的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of the seven HCAs in (a)methanol,(b)soybean oil extracted solution,(c)fried chicken breast extracted solution and (d)mixed standard solution (20 μg/L)1.IQ;2.MeIQ;3.MeIQx;4.4,8-DiMeIQx;5.4,7,8-TriMeIQx (IS);6.PhIP;7.Harman;8.Norharman.

2.4 樣品基質效應的消除

ESI源在質譜分析過程中容易受到樣品基質的影響,樣品基質對離子化有非常強的抑制或促進作用,直接影響分析結果。液相色譜-質譜法開發(fā)和確證過程中需要對基質效應做出評價[36]。一般認為,基質匹配校正曲線斜率與標準曲線斜率的比值在0.85～1.15之間不存在基質效應[37]。為了評估基質效應對定量結果的影響,以甲醇、大豆油提取液和油炸雞胸肉提取液為對象,比較了純溶劑、油脂基質和油炸食品基質對HCAs測定的影響(見圖2)。在油脂基質中,MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、Harman和Norharman的斜率比值為0.72～0.97,IQ和PhIP的斜率比值為1.01～1.06。在油炸食品基質中,IQ、MeIQ、Harman和Norharman的斜率比值為0.84～0.95,MeIQx、4,8-DiMeIQx、PhIP的斜率比值為1.02～1.16。因此,本文用相對應的基質匹配標準曲線定量。從而確保研究結果的準確性和可靠性。

2.5 方法學考察

在最優(yōu)的分析條件下,以甲醇、大豆油提取液和油炸雞胸肉提取液稀釋標準混合工作液,按照1.2節(jié)描述配制7種HCAs系列混合基質標準溶液(含內標20 μg/L),所得結果經(jīng)過SPSS 21軟件處理,以標準溶液中目標組分的峰面積對內標物的峰面積之比為縱坐標(y),相應的質量濃度之比為橫坐標(x),建立基質匹配標準曲線。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。不同基質下,7種HCAs的線性關系、相關系數(shù)(R2)、檢出限和定量限的結果見表2。結果表明,在不同的基質下,7種HCAs均有較好的線性關系,其相關系數(shù)均大于0.999。7種HCAs的LOD和LOQ分別為0.01～0.14 ng/g和0.09～0.38 ng/g。

表2 不同基質下7種HCAs的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (R2),limits of detection (LODs)and limits of quantification (LOQs)of the seven HCAs in different matrices

y:the ratio of the peak area of the target component to the peak area of the internal standard;x:the ratio of the mass concentration of the target component to the mass concentration of the internal standard.

2.6 加標回收率和相對標準偏差

選用不含7種待測組分的大豆油和油炸雞胸肉為空白樣品,進行低、中、高3個水平的加標回收試驗,每個水平重復5次。按最優(yōu)條件分析測定加標回收率和RSD值(見表3)。結果顯示,油脂體系中,7種HCAs的平均加標回收率為69.30%～108.4%,RSD為0.97%～9.26%;油炸食品體系中,7種不同HCAs的回收率為64.31%～113.8%,RSD為0.18%～7.89%。Yan等[34]采用乙腈溶液對肉制品中17種HCAs進行測定,其加標回收率為42.5%～99.0%。本研究中7種HCAs的加標回收率均高于64%,其精密度滿足油脂和油炸食品中HCAs的含量檢測要求。

表3 大豆油和油炸雞胸肉樣品中7種HCAs的加標回收率和精密度(n=5)Table 3 Spiked recoveries and precisions of the seven HCAs in soybean oil and fried chicken breast samples (n=5)

2.7 實際樣品檢測

應用所建立的超高效液相色譜-三重四極桿質譜法對油脂和油炸食品樣品中HCAs含量進行測定(見圖3)，用基質匹配校正曲線進行定量,其具體含量見表4。

圖3 油脂和油炸食品樣品中7種HCAs的色譜圖Fig.3 Chromatograms of the seven HCAs in oil and fried food samplesPeaks 1-8 were the same as that in Fig.2.

測定的油脂樣品包括大豆油、花生油、芝麻油、亞麻籽油和葵花籽油。結果顯示,油脂樣品中均能檢出HCAs,主要為Harman和Norharman。由表4可知,HCAs污染水平順序為芝麻油>亞麻籽油>葵花籽油>花生油>大豆油。究其原因,可能是濃香油脂生產(chǎn)過程中,油籽高溫焙炒,焙炒過程中發(fā)生美拉德反應,使得油脂中HCAs的含量增加。同時,由于不同油料的油脂生產(chǎn)工藝不同,油脂中HCAs分布情況不同。

檢測的油炸食品包括油炸雞肉丸、豆腐、油條和土豆。在油炸雞肉丸中檢出MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、PhIP、Harman和Norharman等6種雜環(huán)胺類物質,其含量順序為PhIP>MeIQx>Norharman>Harman>4,8-DiMeIQx>MeIQ。此外,油炸豆腐、油炸油條和油炸土豆中檢出PhIP、Harman和Norharman 3種雜環(huán)胺類物質,其中以Norharman含量最高,這可能與油炸食品的種類和加工條件等有關。

表4 油脂和油炸食品樣品中7種HCAs的含量Table 4 Contents of the seven HCAs in oil samples and fried food samples ng/g

ND:not detected.

3 結論

本文建立了一種堿性有機溶劑萃取,PCX固相萃取柱凈化,超高效液相色譜-三重四極桿質譜測定油脂和油炸食品中7種HCAs的檢測方法。該方法采用一步式溶劑萃取,操作簡便,分析速度快,能夠滿足HCAs的檢測要求,適用于油脂和油炸食品中HCAs的檢測,為油脂和油炸食品中HCAs的生成與抑制分析提供了分析手段。