氣相色譜正構(gòu)烷烴和直鏈脂肪酸甲酯兩種線性保留指數(shù)之間的轉(zhuǎn)換方法

李 勇,逄 濤,師君麗,鄧小鵬,孔光輝,盧秀萍

(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院,云南 玉溪 653100)

保留指數(shù)是氣相色譜中用于化合物結(jié)構(gòu)鑒定的重要手段,其對于區(qū)分質(zhì)譜譜圖類似的同系物和同分異構(gòu)體具有重要意義。與保留時間不同,化合物的保留指數(shù)值在氣相色譜柱固定相相同的情況下相對穩(wěn)定[1,2],不同實驗室得到的保留指數(shù)值具有可比性,而通過建立化合物的保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫,可以對質(zhì)譜初步定性的化合物進行進一步驗證。

Ervin Kováts最早提出恒溫保留指數(shù)的概念,即Kováts保留指數(shù)[1]。但由于Kováts保留指數(shù)公式計算較復雜,且只適合于恒溫分析,其應用范圍受到限制。Van Den Dool等在Kováts保留指數(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)出線性保留指數(shù)[3]。該指數(shù)計算公式簡單,且適應于線性程序升溫,因此在復雜體系分離分析中得到廣泛應用。保留指數(shù)概念從提出開始就一直成為化合物結(jié)構(gòu)鑒定的重要工具[4-9],隨著代謝組學和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的發(fā)展,保留指數(shù)作為輔助定性工具進一步得到廣泛的應用[10-12]。

線性保留指數(shù)主要有基于正構(gòu)烷烴[1,3]、直鏈脂肪酸甲酯[13]、多環(huán)芳烴等[14]3種計算方式,其中基于正構(gòu)烷烴的線性保留指數(shù)是使用范圍最廣的保留指數(shù)。但正構(gòu)烷烴保留指數(shù)在分析極性混合物[15]和包含大量烷烴的混合物[16]時效果較差。因此在代謝組學研究和生物燃料分析時,基于直鏈脂肪酸甲酯的保留指數(shù)得到廣泛應用[16]。多環(huán)芳烴保留指數(shù)在分析多環(huán)芳烴時應用較多,而在其他方面應用較少。在實際應用中,正構(gòu)烷烴保留指數(shù)和直鏈脂肪酸甲酯保留指數(shù)通常不同時出現(xiàn)在同一數(shù)據(jù)庫中。例如,NIST數(shù)據(jù)庫收錄了大量的正構(gòu)烷烴保留指數(shù)和少量lee保留指數(shù)[14],但未收錄脂肪酸甲酯保留指數(shù),而Fiehn代謝組學數(shù)據(jù)庫則只列出了代謝物的脂肪酸甲酯保留指數(shù)[16]。因此如果兩種保留指數(shù)之間存在確定的轉(zhuǎn)換關(guān)系,就可在獲得一種保留指數(shù)的同時得到另一種保留指數(shù),從而確?；衔锒ㄐ詴r不同保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫均可進行比對,增加化合物定性的可靠性。

本研究針對氣相色譜常用的弱極性色譜柱和極性色譜柱開展正構(gòu)烷烴保留指數(shù)和脂肪酸甲酯保留指數(shù)之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系研究,以期獲得這兩種保留指數(shù)之間的穩(wěn)定轉(zhuǎn)換關(guān)系。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 7890B氣相色譜儀配5975質(zhì)譜儀(美國Agilent公司),渦旋混勻器(荷蘭Breda公司),CP2245分析天平(感量0.000 1 g,德國Sartorious公司)。弱極性色譜柱DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm,固定液為5%苯基和95%的甲基聚硅氧烷)和極性色譜柱DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm,固定液為聚乙二醇)購自美國Agilent公司。

0#柴油(含C8～C26正構(gòu)烷烴)購于玉溪紅塔區(qū)某加油站,C27～C32正構(gòu)烷烴、C5～C24直鏈脂肪酸甲酯、二氯甲烷等標準物質(zhì)和試劑購于百靈威試劑公司。

用于驗證極性柱條件下正構(gòu)烷烴保留指數(shù)和直鏈脂肪酸甲酯保留指數(shù)之間轉(zhuǎn)換關(guān)系的第1至第24種化合物依次為丁酸甲酯、戊酸甲酯、己酸甲酯、庚酸甲酯、辛酸甲酯、壬酸甲酯、癸酸甲酯、十一烷酸甲酯、十二烷酸甲酯、十三烷酸甲酯、十四烷酸甲酯、十四碳烯酸甲酯(順-9)、十五烷酸甲酯、十六烷酸甲酯、十六碳烯酸甲酯(順-9)、十七烷酸甲酯、十八碳酸甲酯、十八碳烯酸甲酯(反-9)、十八碳二烯酸甲酯(順-9,12)、十九烷酸甲酯、二十烷酸甲酯、二十二烷酸甲酯、二十二碳烯酸甲酯(順-13)、二十四烷酸甲酯。

1.2 樣品前處理

將C27～C32正構(gòu)烷烴和C5～C24直鏈脂肪酸甲酯用二氯甲烷稀釋至1 mg/L。取10 μL 0#柴油和1 mL 1 mg/L C27～C32混合標樣,置于1.5 mL色譜進樣小瓶,均勻混合,以備GC-MS分析。

1.3 GC-MS分析條件

GC條件 在色譜柱固定相確定的情況下,柱溫是影響保留指數(shù)的主要因素[17],因此本實驗中DB-5MS和DB-WAX兩種色譜柱均設(shè)置4種程序升溫條件。程序1:60 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;程序2:60 ℃保持1 min,以20 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;程序3:60 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至140 ℃,保持10 min,再以5 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;程序4:60 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至100 ℃,保持10 min,以5 ℃/min升至180 ℃,保持10 min,再以5 ℃/min升至280 ℃,保持10 min。載氣為氦氣;柱流量為1.1 mL/min;分流比為20∶1,進樣量為1 μL。

MS條件 溶劑延時為1.8 min。采用EI離子源;離子源溫度為250 ℃;質(zhì)量掃描范圍為m/z35～450;質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集頻率為2 Hz。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

化合物的質(zhì)譜圖提取和結(jié)構(gòu)鑒定:采用AMDIS V 2.7進行色譜圖去卷積和峰識別;化合物定性采用NIST MS Search 2.0配NIST 2017數(shù)據(jù)庫。對正構(gòu)烷烴序列,采用m/z43、57、71等離子以及化合物的分子離子輔助定性。對直鏈脂肪酸序列,采用m/z74、87離子以及化合物的分子離子輔助定性。文獻保留指數(shù)來自NIST 2017數(shù)據(jù)庫、Fiehn代謝組學數(shù)據(jù)庫和GOLM代謝組學數(shù)據(jù)庫,凡是固定相類型相同的線性文獻保留指數(shù)均納入文獻保留指數(shù)統(tǒng)計范圍。

表1 弱極性柱上不同程序升溫條件下直鏈脂肪酸甲酯系列化合物的烷烴保留指數(shù)Table 1 n-Alkane-based retention indices (RIs)of n-fatty acid methyl esters acquired using a semi-standard non-polar column with different temperature programs

Four different temperature programs were set to demonstrate the correlation.Program 1 was set as 60 ℃,held for 1 min,5 ℃/min to 280 ℃,held for 10 min.Program 2 was set as 60 ℃,held for 1 min,20 ℃/min to 280 ℃,held for 10 min.Program 3 was set as 60 ℃,held for 1 min,5 ℃/min to 140 ℃,held for 10 min,5 ℃/min to 280 ℃,held for 10 min.Program 4 was set as 60 ℃,held for 1 min,5 ℃/min to 100 ℃,held for 10 min,5 ℃/min to 180 ℃,held for 10 min,5 ℃/min to 280 ℃,held for 10 min.

化合物保留指數(shù)按照線性保留指數(shù)計算方法[3]計算得到。即,保留時間介于碳數(shù)為n和n+1的正構(gòu)烷烴之間的化合物x的線性保留指數(shù)計算公式如下:

(1)

其中,LRIx代表化合物x的烷烴線性保留指數(shù),tR(x)、tR(n)、tR(n+1)分別代表化合物x、第n個碳正構(gòu)烷烴和第n+1個碳正構(gòu)烷烴的保留時間。保留時間介于碳數(shù)為n和n+1的直鏈脂肪酸甲酯化物的脂肪酸甲酯線性保留指數(shù)的計算公式與公式(1)相同,只是式中LRIx代表化合物x的脂肪酸甲酯化線性保留指數(shù),tR(x)、tR(n)、tR(n+1)分別代表化合物x、第n個碳直鏈脂肪酸甲酯和第n+1個碳脂肪酸甲酯的保留時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 復雜程序升溫條件下保留指數(shù)計算公式的選擇

Van Den Dool等定義了線性程序升溫條件下保留指數(shù)的計算公式(公式(1))[3]。而在復雜體系分離分析過程中,線性程序升溫條件通常無法達到最佳分離效果,因此使用復雜程序升溫條件(通常由恒溫步驟和不同或相同速率升溫步驟組成)成為常態(tài)。復雜程序升溫條件下保留指數(shù)的計算公式目前并未形成研究共識,因此NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫[18]、Fiehn代謝組學數(shù)據(jù)庫[16,19]、Golm代謝組學數(shù)據(jù)庫[20]等在數(shù)據(jù)采集時雖均采用了復雜程序升溫條件,但在計算保留指數(shù)時均直接使用了Van Den Dool等的線性保留指數(shù)計算公式。本實驗采用公式(1)計算了4種不同程序升溫條件下的保留指數(shù),發(fā)現(xiàn)在不同的程序升溫條件下,采用該公式計算的保留指數(shù)確實存在區(qū)別,弱極性柱條件下獲得的保留指數(shù)最大極差為5.9(見表1),而極性柱條件下最大極差為14.2(見表2)。由于在當前尚無成熟的用于復雜程序升溫條件下的保留指數(shù)計算公式,且主流保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫均采用了公式(1)計算復雜程序升溫條件下的保留指數(shù),本研究也同樣采用公式(1)用于所涉及的保留指數(shù)計算。

表2 極性柱上不同程序升溫條件下直鏈脂肪酸甲酯系列化合物的烷烴保留指數(shù)Table 2 n-Alkane-based RIs of n-fatty acid methyl esters acquired using a standard polar column with different temperature programs

The temperature programs were the same as those in Table 1.

2.2 弱極性柱上兩種保留指數(shù)之間的關(guān)系

將C8～C32正構(gòu)烷烴和C5～C24直鏈脂肪酸甲酯混合并上樣至弱極性色譜柱,在不同的程序升溫條件下分別記錄烷烴序列和脂肪酸甲酯序列的保留時間,采用公式(1)計算甲酯序列的烷烴線性保留指數(shù)。將計算得到的脂肪酸甲酯的烷烴保留指數(shù)和其對應的甲酯化保留指數(shù)(根據(jù)公式(1),其值為碳數(shù)乘以100)進行線性擬合,結(jié)果見表1。從表1可以看出,不同溫度程序下計算得到的保留指數(shù)變化很小,所得數(shù)據(jù)的相對標準偏差(RSD)在0.02%～0.20%之間,保留指數(shù)的極差在1.1～5.9之間,說明程序升溫條件的變化對保留指數(shù)影響很小,不同程序升溫條件下得到的保留指數(shù)之間具有可比性。將不同程序升溫條件下得到的C5～C24系列脂肪酸甲酯化合物的烷烴保留指數(shù)求均值并將其與甲酯化保留指數(shù)進行一階線性擬合,得到y(tǒng)=1.005 1x+318.51(r2=1,式中y和x分別代表烷烴保留指數(shù)和脂肪酸甲酯保留指數(shù))。線性相關(guān)系數(shù)等于1說明這兩種保留指數(shù)之間具有極強的相關(guān)性,因此在該弱極性柱上,只要得到某種化合物的烷烴保留指數(shù),就可以根據(jù)y=1.005 1x+318.51公式計算得到該化合物的甲酯化保留指數(shù),反之亦然。

2.3 極性柱上兩種保留指數(shù)之間的關(guān)系

采用2.1節(jié)所述方法計算極性柱上直鏈脂肪酸甲酯序列的烷烴線性保留指數(shù)(見表2)并與其甲酯化保留指數(shù)進行線性擬合。從表2可以看出,不同溫度程序下計算得到的保留指數(shù)變化很小,RSD在0.06%～0.29%之間,保留指數(shù)的極差在3.0～14.2之間,說明程序升溫條件的變化對保留指數(shù)影響較小,不同程序升溫條件下得到的保留指數(shù)之間具有可比性。將不同程序升溫條件下得到的C5～C24系列脂肪酸甲酯化合物的烷烴保留指數(shù)求均值并將其與甲酯化保留指數(shù)進行一階線性擬合,得到y(tǒng)=1.036 2x+562.519(r2=1,式中y和x分別代表烷烴保留指數(shù)和脂肪酸甲酯保留指數(shù))。

2.4 轉(zhuǎn)化效果驗證

2.4.1弱極性色譜柱

Fiehn代謝組學數(shù)據(jù)庫中收錄了弱極性色譜柱(固定液為5%苯基和95%的甲基聚硅氧烷)上代謝物的甲酯化保留指數(shù),但未采集正構(gòu)烷烴保留指數(shù)。本實驗對Fiehn代謝組學數(shù)據(jù)庫中1 043個代謝物的甲酯化保留指數(shù)采用本實驗所獲得的轉(zhuǎn)化公式y(tǒng)=1.005 1x+318.51進行計算,得到相應的正構(gòu)烷烴保留指數(shù)。以質(zhì)譜譜圖為依據(jù)搜索NIST 2017主數(shù)據(jù)庫和GOLM代謝組學數(shù)據(jù)庫,得到300個代謝物及相應文獻保留指數(shù)(其余代謝物在NIST 2017和GOLM數(shù)據(jù)庫中不存在相應的質(zhì)譜譜圖或烷烴保留指數(shù))。對得到的300個代謝物的計算烷烴保留指數(shù)和文獻保留指數(shù)進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別有139個(46.3%)和245個(81.7%)個代謝物的計算保留指數(shù)與文獻(最接近的)保留指數(shù)相差值小于5和10。另外有55個代謝物的計算保留指數(shù)與文獻保留指數(shù)相差值大于10(見附表1,http://www.chrom-China.com)。

圖1 弱極性柱下正十六烷酸甲酯的烷烴文獻保留指數(shù)分布Fig.1 Distribution of n-alkane-based reference RIs acquired using semi-standard non-polar columns Shadow in the figure stands for average±standard deviation of the reference RIs listed in the NIST 2017 MS database.

雖然絕大部分(81.7%)被統(tǒng)計代謝物的計算保留指數(shù)與文獻保留指數(shù)十分接近,但仍有部分計算保留指數(shù)與文獻保留指數(shù)相差較大。其原因在于影響線性保留指數(shù)的因素較多。在固定相組成相同的情況下,載氣流速、固定液厚度、程序升溫條件、載氣流量控制方式(恒流或恒壓)、色譜柱尺寸等都可能對線性保留指數(shù)計算值產(chǎn)生一定的影響[2,21],雖然這些影響因素相對固定相組成的影響而言很小。因此,線性保留指數(shù)的文獻記錄不是一個確定值,而是一個分布范圍。當文獻保留指數(shù)記錄較多時,本實驗通過公式轉(zhuǎn)換得到的保留指數(shù)與文獻保留指數(shù)能較好地匹配,而當文獻保留指數(shù)記錄較少時,本實驗獲得的保留指數(shù)就有可能與文獻值相差較大。例如,正十六烷酸甲酯在NIST 2017數(shù)據(jù)庫中有137條弱極性柱(固定液為5%苯基和95%的甲基聚硅氧烷)文獻保留指數(shù)記錄(見圖1),其均值為1 924.2,而本實驗測定的該化合物的保留指數(shù)為1 925.6,采用Fiehn代謝組學數(shù)據(jù)庫中該化合物的甲酯化保留指數(shù)通過本實驗獲得的轉(zhuǎn)化公式計算得到的烷烴保留指數(shù)為1 922.4,三者十分接近。但在這137條文獻保留指數(shù)記錄中也有部分記錄遠離均值,如最小值1 894和最大值1 964。因此,當文獻保留指數(shù)記錄較少(例如只有1條)時,就有可能出現(xiàn)計算值與文獻值相差較遠的情況。本實驗中,計算保留指數(shù)和文獻保留指數(shù)差值大于10的55個代謝物中有43個僅有1條文獻保留指數(shù)記錄,其余12個代謝物的計算保留指數(shù)僅3條超出了文獻保留指數(shù)分布范圍(見附表1,http://www.chrom-China.com)。

圖2 極性柱條件下脂肪酸甲酯系列化合物的烷烴文獻保留指數(shù)和通過公式計算的保留指數(shù)Fig.2 Distribution of n-alkane-based RIs acquired from references and n-fatty acid methyl ester-based RIs using standard polar columns n-Fatty acid methyl ester-based RIs were converted to n-alkane-based RIs using the following equation:y=1.0362x+562.519,where x and y stand for n-fatty acid methyl ester-based and n-alkane-based RIs,respectively.Compounds 1 to 24 stand for methyl esters of n-fatty acids C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14,C14∶1 (cis 9),C15,C16,C16∶1(cis 9),C17,C18,C18∶1 (trans 9),C18∶2 (cis 9,12),C19,C20,C22,C22∶1 (cis 13),and C24,respectively.

2.4.2極性色譜柱

由于很多極性化合物可以在衍生化(例如硅烷化、甲酯化)后采用弱極性色譜柱進行分析,極性色譜柱的使用頻率從總體上說小于弱極性柱。因此,基于極性色譜柱的文獻保留指數(shù)記錄也遠小于基于弱極性柱的保留指數(shù)。本研究未找到一組化合物在極性柱分析條件下同時存在甲酯化保留指數(shù)和烷烴保留指數(shù)的文獻保留指數(shù)。為了驗證本實驗獲得的轉(zhuǎn)化公式的正確性,將實驗獲得的脂肪酸甲酯系列化合物的甲酯化保留指數(shù)采用獲得的轉(zhuǎn)化公式(y=1.036 2x+562.519)進行轉(zhuǎn)化,計算得到相應的烷烴線性保留指數(shù),并將其與NIST 2017質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中相應的烷烴文獻保留指數(shù)進行比較(見圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),公式計算得到的保留指數(shù)與相應的文獻保留指數(shù)的均值十分接近,所有計算保留指數(shù)均處于文獻保留指數(shù)均值加減方差范圍內(nèi),且未發(fā)現(xiàn)計算保留指數(shù)超出文獻保留指數(shù)分布范圍的情況,說明采用此公式轉(zhuǎn)化獲得的保留指數(shù)具有很好的參考性。

3 結(jié)論

本研究獲得了弱極性柱和極性柱條件下正構(gòu)烷烴保留指數(shù)和脂肪酸甲酯保留指數(shù)之間的轉(zhuǎn)換公式,利用文獻保留指數(shù)對所獲得的轉(zhuǎn)換關(guān)系進行驗證,發(fā)現(xiàn)弱極性柱和極性柱條件下獲得的保留指數(shù)轉(zhuǎn)換公式均能達到較好的轉(zhuǎn)換效果。正構(gòu)烷烴保留指數(shù)和脂肪酸甲酯保留指數(shù)之間轉(zhuǎn)換公式的獲得對利用化合物保留指數(shù)定性時擴大索庫范圍、減少保留指數(shù)采集實驗具有重要意義。