基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的心肌缺血大鼠血清和心肌組織代謝組學(xué)

尹春園,孫明謙,金 龍,林 力,苗 蘭,劉建勛*

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100091;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

心肌缺血(myocardial isochemia)是由于心臟的血液灌注量降低,導(dǎo)致心臟的供氧減少,心肌能量代謝異常,不能支持心臟正常工作的病理狀態(tài)[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的轉(zhuǎn)變,我國(guó)心血管疾病患者人數(shù)逐年增加。目前,心血管病是城鄉(xiāng)居民死亡原因的首位,且農(nóng)村居民心血管病的死亡率逐年增加[2]。如何應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)對(duì)心肌缺血的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行闡釋,是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要任務(wù)之一。

代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的新興組學(xué)技術(shù),是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,它通過(guò)檢測(cè)來(lái)自體液或組織中的小分子代謝物,來(lái)實(shí)現(xiàn)在疾病的早期診斷和治療檢測(cè)過(guò)程中的重要作用[3,4]。代謝物作為基因的下游產(chǎn)物,能夠最直接反映不同組之間的表型差異,從代謝層面上放大表達(dá)基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)層面的差異[5]。

本文利用液相色譜-四極桿軌道離子肼質(zhì)譜對(duì)異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠進(jìn)行心肌組織和血清的靶向代謝組學(xué)研究和生物標(biāo)志物的分析,揭示與心肌缺血有關(guān)的代謝通路,探索其發(fā)病機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

賽默飛UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司);Q ExactiveTM組合型四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司);22 R高速離心機(jī)(德國(guó)Mikro公司);低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司);Mix-3000振蕩混勻器(杭州米歐儀器有限公司);Mikro 220R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)。

異丙腎上腺素鹽酸鹽(C11H17NO3·HCl,相對(duì)分子質(zhì)量247.72,純度高于99.0%,梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)。甲醇、乙腈、甲酸(HPLC級(jí),美國(guó)Fisher Scientific公司,純度99%)。

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠16只,體質(zhì)量200～220 g,購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002,合格證號(hào)11401500048859。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,室內(nèi)溫度20～23 ℃,濕度40%～60%,晝夜循環(huán)12 h。

1.2 心肌缺血大鼠模型的建立及分組

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后隨機(jī)分成兩組:正常對(duì)照組(8只)和模型組(8只)。模型組背部皮下注射ISO造成心肌缺血,給藥劑量為85 mg/kg,1次/天,兩次注射給藥時(shí)間間隔為24 h。

1.3 血清樣本采集與處理

第二次注射ISO后,大鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血,常溫下靜置0.5 h于4 ℃以3 000 r/min離心10 min后取上層血清存放于-80 ℃冰箱以備后續(xù)血清指標(biāo)檢測(cè)和代謝組學(xué)進(jìn)樣處理。

取100 μL血清,加300 μL乙腈,混勻振搖1 min,于4 ℃以13 200 r/min離心10 min后取上清液檢測(cè)。

1.4 組織樣本采集與處理

按1.3節(jié)所述取血完畢后剪下大鼠心臟,分取100 mg缺血明顯的心肌組織,轉(zhuǎn)移至勻漿管中,加入鋼珠、陶瓷珠高速振蕩30 min制備勻漿液,勻漿后,向心肌組織中加入1 mL乙腈,混勻提取1 h,所有樣本離心,離心條件為4 ℃、13 200 r/min、10 min,離心后取上清液檢測(cè)。

1.5 模型藥理指標(biāo)

取1.3節(jié)中離心后的血清進(jìn)行肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB,CK-MB)的測(cè)定。

各組大鼠血清CK活力按照CK測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,采用日本臨床化學(xué)委員會(huì)(JSCC)標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)應(yīng)/國(guó)際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)轉(zhuǎn)化法對(duì)應(yīng)計(jì)算大鼠血清CK的活性。各組大鼠血清的LDH活性按照LDH測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,用IFCC法檢測(cè)大鼠血清的LDH活性。

各組大鼠血清中CK-MB活性按照CK-MB測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,采用免疫抑制法檢測(cè)CK-MB含量。

1.6 色譜條件

BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相的組成:A為含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的乙腈,B為含0.1%甲酸的水。梯度洗脫程序:0～6 min,20%B～50%B;6～9.5 min,50%B～20%B;9.5～12 min,20%B。柱溫:50 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL。

1.7 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式檢測(cè),質(zhì)量掃描范圍m/z70～1 050,噴霧電壓+3.7 kV,鞘氣壓力206 kPa (30 psi),輔助氣壓力69 kPa (10 psi),毛細(xì)管加熱溫度320 ℃,容積加熱蒸發(fā)溫度300 ℃。鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?。碰撞氣為氮?dú)?壓力為1.5 mTorr。

1.8 數(shù)據(jù)采集與預(yù)處理

采用ThermoFisher Corporation Xcalibur 2.2 SP1.48 (Waltham,MA)軟件執(zhí)行親水作用色譜(HILIC)-MS系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集,使用Skyline (64-bit,3.5.0.9319,MacCoss Lab,UW)軟件對(duì)MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)識(shí)別氨基酸和相關(guān)化合物,建立了40余種極性小分子成分靶向分析方法[6]。通過(guò)Skyline軟件對(duì)各組樣本進(jìn)行定量分析,再將數(shù)據(jù)輸入到MetaboAnalyst網(wǎng)站(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/)進(jìn)行歸一化預(yù)處理,所得數(shù)據(jù)最后應(yīng)用SIMICAP+12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥理指標(biāo)評(píng)價(jià)

CK-MB與CK常被用作心肌損傷診斷的兩項(xiàng)生化指標(biāo),可間接反映心肌細(xì)胞遭受ISO損傷的程度。如表1所示:與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠血清中CK-MB活力極顯著上升(p<0.01),表明大鼠心肌細(xì)胞明顯受損;與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠血清中CK活力極顯著上升,LDH活力有上升趨勢(shì),但無(wú)顯著差異。

表1 異丙腎上腺素致心肌缺血大鼠的CK、LDH、CK-MB活性Table 1 CK,LDH,and CK-MB activity in rats with ISO-induced myocardial ischemia n=8)

CK:creatine kinase;LDH:lactate dehydrogenase;CK-MB:creatine kinase isoenzyme MB.

** Compared with control group,p<0.01.

圖1 正離子模式下心肌缺血模型大鼠的(a)血清和(b)心肌組織樣本的LC-MS基峰圖Fig.1 LC-MS base peak chromatograms (BPC)of (a)a serum sample and (b)a heart tissue sample of rats with myocardial ischemia in positive ion mode

2.2 LC-MS分析結(jié)果

正離子模式下心肌缺血模型大鼠血清樣本及心肌組織的基峰圖見(jiàn)圖1a和見(jiàn)圖1b。對(duì)于LC-MS代謝組學(xué)研究,QC樣本由等量的所有樣本混合而成,所有樣本均取20 μL,混合成為均一的QC樣本。在代謝組學(xué)檢測(cè)過(guò)程中,每進(jìn)6個(gè)樣本后進(jìn)1個(gè)QC樣本。從QC樣本中選5個(gè)代表性的特征峰來(lái)評(píng)價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中,tR的波動(dòng)<0.2 min,m/z的偏差<10×10-6(10 ppm),離子強(qiáng)度變化的RSD<20%。結(jié)果顯示儀器的精密度良好,運(yùn)行穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的重復(fù)性,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由儀器系統(tǒng)誤差引起的偏差較小,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏差小,結(jié)果穩(wěn)定可靠。因此,本研究中所發(fā)現(xiàn)的代謝標(biāo)志物含量差異能夠真實(shí)反映樣本組間本身的生物學(xué)狀態(tài)差異。

2.3 模式識(shí)別分析

分別采用PCA和PLS-DA對(duì)正常對(duì)照組和模型組心肌組織勻漿液和血清中的代謝物譜進(jìn)行分析,得到相應(yīng)的散點(diǎn)分布圖,見(jiàn)圖2。各組樣本呈現(xiàn)明顯的分離效果,表明二者的代謝物譜存在明顯差異。其中心肌組織的PLS-DA得分:R2(建模所用的主成分對(duì)原始數(shù)據(jù)的解釋度)=0.988,Q2(模型的可預(yù)測(cè)度)=0.949;血清的PLS-DA得分:R2=0.968,Q2=0.873。

圖2 大鼠心肌組織、血清樣本的PCA、PLS-DA模式識(shí)別圖Fig.2 PCA and PLS-DA pattern recognition of heart tissue and serum samples of ratsPCA:principal component analysis;PLS-DA:differentiation analysis of supervised partial least squares.

2.4 代謝通路分析

利用MetaboAnalyst平臺(tái)對(duì)差異性代謝物進(jìn)行代謝通路分析,心肌組織和血清樣本的代謝通路見(jiàn)圖3a和圖3b。

圖3 (a)心肌組織和(b)血清樣本差異性代謝物的代謝通路Fig.3 Summary of (a)heart tissue and (b)serum pathway analysis with metabolomics

2.5 差異性代謝物的篩選

根據(jù)PLS-DA模型第一主成分變量重要性值(VIP)結(jié)果,并結(jié)合單因素方差分析的p值,以VIP>1.2,p<0.05為條件篩選具有差異表達(dá)的代謝物,最終得到18種組間差異代謝物,見(jiàn)表2。

2.6 差異代謝物相關(guān)代謝途徑

與正常對(duì)照組比較,血清中鑒定出12個(gè)代謝差異性生物標(biāo)志物,心肌組織中鑒定出12個(gè)代謝差異性生物標(biāo)志物,二者共同含有的生物標(biāo)志物為谷氨酰胺(glutamine)、羥脯氨酸(hydroxyproline)、鳥(niǎo)氨酸(ornithine)、甜菜堿(betaine)、核黃素(riboflavin)和牛磺酸(taurine)。

精氨酸(arginine)代謝相關(guān):瓜氨酸(citrulline)和鳥(niǎo)氨酸是精氨酸代謝中的關(guān)鍵成分,它們的含量上升提示L-精氨酸-一氧化氮途徑出現(xiàn)異常。肌酸酐(creatinine)與羥脯氨酸也間接參與了該途徑的代謝。精氨酸是體內(nèi)合成一氧化氮(NO)的前體,在本研究中的含量也出現(xiàn)了下降(p<0.05)。精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的催化下,生成NO與瓜氨酸,同時(shí)精氨酸還是內(nèi)生性NO的唯一前體,該過(guò)程即L-精氨酸-一氧化氮途徑[7]。值得注意的是,NO的作用具有雙向性,能夠維持血管張力、增強(qiáng)心肌的舒張功能并對(duì)心臟收縮功能有利,但在病理?xiàng)l件下,其亦可對(duì)心肌組織造成危害。例如iNOS(inducible NOS,iNOS)在正常條件下不存在,在心肌缺血條件下被誘導(dǎo)生成,產(chǎn)生大量NO,它可與超氧陰離子生成具有細(xì)胞毒性的過(guò)氧化亞硝基(ONOO-),對(duì)心肌造成損傷[8,9]?？傊?精氨酸代謝途徑的異?？赡芴崾綨O生成的異常及可能導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷,而這些損傷導(dǎo)致相關(guān)的內(nèi)源性成分在心肌組織和血液中都呈現(xiàn)出不同程度的變化。

表2 大鼠心肌組織和血清的代謝差異性生物標(biāo)志物Table 2 Differential metabolites in rat serum and heart tissue

* Change trend compared with control group.

能量代謝相關(guān):在心肌缺血的過(guò)程中,能量代謝障礙是導(dǎo)致其進(jìn)一步損傷的原因,纈氨酸(valine)為支鏈氨基酸,與能量代謝密切相關(guān)。纈氨酸為生糖氨基酸,其氧化產(chǎn)生的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的速率高于其他類(lèi)型的氨基酸[10]。在心肌缺血的情況下,心肌能量的供給大幅下降。而纈氨酸等支鏈氨基酸可以為心肌提供能量補(bǔ)償,這可能是纈氨酸下降的原因。血液中丙氨酸(alanine)的含量出現(xiàn)上升,而丙氨酸可通過(guò)糖異生的途徑轉(zhuǎn)化為葡萄糖,其含量上升提示丙氨酸-丙酮酸-葡萄糖循環(huán)的紊亂,機(jī)體氧化功能障礙進(jìn)一步加重[11]。在心肌缺血模型中肉堿(L-carnitine)的含量出現(xiàn)上升,肉堿穿梭系統(tǒng)將脂肪酸轉(zhuǎn)移到線粒體中,發(fā)生β-氧化,從而實(shí)現(xiàn)心臟的供能[12]。正常心肌能量供給60%～70%來(lái)自游離脂肪酸(FFA)氧化[13],而肉堿含量的變化提示這一系統(tǒng)出現(xiàn)了問(wèn)題,正常心肌主要能量來(lái)源脂肪酸氧化受到了干擾。

作為高耗能的器官,心臟的能量代謝主要包括直接供能和磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)儲(chǔ)能兩種方式。直接供能是指心肌細(xì)胞攝取脂肪酸及葡萄糖在線粒體中通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生大量的ATP來(lái)直接供能[14]。磷酸肌酸儲(chǔ)能是指磷酸肌酶穿梭系統(tǒng)調(diào)控ATP和PCr之間的能量轉(zhuǎn)換,在以下反應(yīng)中形成磷酸肌酸:肌酸(creatine)+ATP←→PCr+二磷酸腺苷(ADP),即ATP的能量可被轉(zhuǎn)移并存儲(chǔ)于PCr中;當(dāng)ATP需求增加時(shí),CK同工酶可以快速地催化PCr與ADP的反應(yīng)進(jìn)而生成ATP和肌酸以供利用[15]。心肌缺血后能量的改變與PCr有關(guān),它在高能量需求期間提供快速水解的ATP以供利用。研究表明,在心肌缺血的動(dòng)物和患者中,不論心肌缺血的病因如何,PCr水平下降高達(dá)70%[16]。肌酐是肌肉中磷酸肌酸的分解產(chǎn)物,模型組中肌酐含量下降提示磷酸肌酸含量下降,符合心肌缺血能量代謝的物質(zhì)特點(diǎn)。

?；撬崾且环N存在于心肌細(xì)胞中的含硫氨基酸,屬于細(xì)胞保護(hù)劑。它通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道和交換系統(tǒng)來(lái)降低Ca2+的超載,進(jìn)而達(dá)到保護(hù)心肌的作用[17]。大劑量ISO可引起心率加快、心肌收縮力增強(qiáng),心肌耗氧高于供氧,進(jìn)而引發(fā)心肌缺血[18]。研究表明,經(jīng)ISO誘導(dǎo)后的心肌缺血缺氧損傷與氧自由基有密切關(guān)系,心肌缺血時(shí),大量氧自由基產(chǎn)生,破壞膜結(jié)構(gòu),致膜通透性增加,造成細(xì)胞Ca2+內(nèi)流和Ca2+超載現(xiàn)象。?；撬峥赏ㄟ^(guò)保護(hù)膜脂免受自由基引起的過(guò)氧化、抑制Ca2+超載來(lái)保護(hù)缺血心肌[19,20]。在本研究中,血清和組織中均檢測(cè)到?；撬崴降南陆??；撬岜淮罅肯?表明心肌和血液中牛磺酸的代謝都出現(xiàn)了障礙,心肌中的Ca2+超載較為嚴(yán)重,心肌細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重,血液中的含量也出現(xiàn)下降,提示對(duì)這一損傷難以進(jìn)行全面的系統(tǒng)調(diào)節(jié)。

谷氨酰胺和谷氨酸(glutamate)均屬于谷氨酰胺和谷氨酸代謝途徑,且兩者的含量都出現(xiàn)了下降,尤其谷氨酰胺在心肌和血清中的含量都出現(xiàn)了下降。谷氨酰胺是一種主要由骨骼肌和肝臟產(chǎn)生的氨基酸,在細(xì)胞中占碳和氮代謝的絕大部分[21]。文獻(xiàn)報(bào)道谷氨酰胺可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)通路核心介質(zhì)NF-κB的激活,來(lái)減少各種炎癥因子的生成,進(jìn)而減輕炎癥因子對(duì)心肌的損傷,達(dá)到保護(hù)心肌的作用[22],同時(shí)谷氨酸是合成谷胱甘肽的重要物質(zhì),而谷氨酰胺是其主要來(lái)源。谷胱甘肽系統(tǒng)是體內(nèi)細(xì)胞減少氧化應(yīng)激的主要機(jī)制之一。谷氨酰胺能夠通過(guò)誘導(dǎo)谷胱甘肽的合成保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷,從而有利于缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞的恢復(fù)[23]。其在心腦血管疾病中亦被研究證明具有明顯的抗氧化和清除自由基的作用,對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用[24]。本研究中,谷氨酰胺含量的下降,可能與心肌缺血中氧化應(yīng)激壓力增大和炎性反應(yīng)密切相關(guān)。

3 結(jié)論

本文利用代謝組學(xué)的分析手段檢測(cè)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠血清和心肌組織代謝物的變化,通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析,確定了?；撬帷⒐劝滨０?、瓜氨酸、鳥(niǎo)氨酸等18個(gè)差異代謝物,這些代謝物主要與能量代謝、精氨酸代謝、谷氨酰胺和谷氨酸代謝等途徑有關(guān),揭示了心肌缺血的發(fā)病機(jī)制,為臨床早期疾病預(yù)測(cè)和診斷提供了依據(jù)。