• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熒光定量PCR方法分析鮮雞蛋貯藏過(guò)程蛋殼表面優(yōu)勢(shì)菌的變化

    2020-12-23 05:29:38石一武頌文李文涓袁璐李焱張浩帆馬國(guó)柱劉東立
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年23期
    關(guān)鍵詞:乳酸桿菌霉菌葡萄球菌

    石一,武頌文,李文涓,袁璐,李焱,張浩帆,馬國(guó)柱,劉東立*

    1(陜西省疾病預(yù)防控制中心,陜西 西安,710054)2(西安醫(yī)學(xué)院,陜西 西安,710021)3(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部,陜西 西安,710061)4(西安市疾病預(yù)防控制中心,陜西 西安,710054)5(咸陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心,陜西 咸陽(yáng),712000)

    雞蛋隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng),其新鮮度下降,營(yíng)養(yǎng)成分也會(huì)丟失[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞雞蛋品質(zhì)積極探索主要是針對(duì)哈氏單位、質(zhì)量損失率、蛋黃系數(shù)和微生物含量等指標(biāo)[2-4]。傳統(tǒng)微生物計(jì)數(shù)的方法可以從整體上反映雞蛋的衛(wèi)生學(xué)情況,但很難反映出某種微生物具體的數(shù)量,不同培養(yǎng)基的選擇往往也會(huì)帶來(lái)一定程度的偏差[5],操作復(fù)雜,時(shí)效性較慢。近年來(lái)越來(lái)越多的研究者通過(guò)分子生物學(xué)方法鑒定微生物的種類和變化情況,如變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)、16S~23S rRNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism, SSCP)等[6-8]。雖然這些技術(shù)方法具有免培養(yǎng)、快速等特點(diǎn),但是不能對(duì)微生物的數(shù)量進(jìn)行絕對(duì)定量。

    熒光定量PCR技術(shù)最大的特點(diǎn)就是可以準(zhǔn)確定量樣品中微生物的含量,SHI等[9]利用熒光定量PCR技術(shù)研究了米酒在釀造過(guò)程中酵母菌和乳酸菌的變化情況;TOFALO等[10]利用熒光定量PCR技術(shù)研究了餐用油橄欖在發(fā)酵過(guò)程中總酵母的數(shù)量變化情況,也有學(xué)者通過(guò)監(jiān)測(cè)食醋發(fā)酵過(guò)程中醋酸菌、乳酸菌的變化控制和提高產(chǎn)品的風(fēng)味[17]。

    本研究旨在通過(guò)熒光定量PCR的方法,對(duì)3個(gè)地區(qū)鮮雞蛋在儲(chǔ)存過(guò)程中蛋殼表面4種優(yōu)勢(shì)菌屬(葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬、鏈霉菌屬和腸球菌屬)進(jìn)行定量分析,從而為具體研究雞蛋腐敗微生物、延長(zhǎng)雞蛋的貨架期奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本來(lái)源

    在榆林(YL)、漢中(HZ)和西安(XA)3個(gè)地市,分別選取一家具有代表性的蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行取樣,采集當(dāng)天生產(chǎn)的雞蛋,每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)收集30枚雞蛋,共3個(gè)批次。所有樣品遵循無(wú)菌采樣要求,存放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱。采樣當(dāng)天即為第0天,并于后續(xù)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第14、28、42和56天)分別使用一次性棉拭子收集蛋殼表面微生物標(biāo)本。所有拭子保存于-40 ℃冰箱,等待提取核酸。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 DNA提取

    使用德國(guó)Qiagen公司DNA提取試劑盒(51304),采用改良的核酸提取方法提取樣本DNA。將采樣標(biāo)本拭子頭剪入1.5 mL離心管中。加入180 μL 20 mg/mL的溶菌酶,旋渦振蕩混勻37 ℃金屬浴30 min。加入25 μL蛋白酶K、200 μL AL,旋渦振蕩混勻56 ℃金屬浴過(guò)夜。短暫離心,將離心管中液體全部吸出轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中。加200 μL無(wú)水乙醇,振蕩混勻,剩余步驟參照說(shuō)明書。

    1.2.2 擴(kuò)增插入片段

    針對(duì)4種菌屬按照文獻(xiàn)[11-13]合成特異性引物,引物序列見表1。25 μL PCR反應(yīng)體系包括:10×buffer 2.5 μL,正向/反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,dNTP(10 mmol/L)0.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,rTaq(5 U/μL)0.2 μL,DEPC 水 16.3 μL,模板2 μL。PCR反應(yīng)程序如下:預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性95 ℃ 30 s,退火30 s(溫度見表1),延伸72 ℃ 2 min,共40個(gè)循環(huán);最終延伸72 ℃ 5 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用北京天根公司DNA純化回收試劑盒(離心柱型)對(duì)瓊脂糖電泳條帶清晰的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

    表1 四種優(yōu)勢(shì)菌屬引物序列和退火溫度Table 1 Primer sequence and annealing temperature of four dominant bacteria

    1.2.3 插入片段與pMD18-T載體的連接

    吸取1 μL載體 pMD18-T,1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,3 μL DEPC 水和5 μL SolutionⅠ充分混合,室溫孵育1 h。

    1.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

    吸取100 μL感受態(tài)細(xì)胞DH5α懸液到1.5 mL離心管中,將10 μL連接產(chǎn)物全部加入,吹打混勻,冰浴30 min。取出離心管,42 ℃金屬浴45 s,再放置冰中1 min。向離心管中加入890 μL SOC培養(yǎng)基,混勻后置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h。吸200 μL懸液鋪于倒好的LB/Amp/X-gal/IPTG固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。

    1.2.5 篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

    取出隔夜培養(yǎng)的平板,室溫放置1~2 h,觀察平板上的藍(lán)白斑菌落,挑取白色菌落至5 mL LB/Amp培養(yǎng)液試管中,37 ℃搖床培養(yǎng)12 h。吸取1 mL菌液,送至上海生工生物工程公司測(cè)序。

    利用DNASTAR軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果核苷酸序列進(jìn)行處理,得到目的片段基因序列。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的基因片段進(jìn)行BLAST比對(duì),確定轉(zhuǎn)化效果。

    1.2.6 質(zhì)粒提取

    根據(jù)比對(duì)結(jié)果,選取轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒,使用日本Takara公司MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取,最后得到標(biāo)準(zhǔn)品。

    1.2.7 測(cè)定質(zhì)粒濃度

    使用 Nanodrop微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定質(zhì)粒濃度,應(yīng)用 Avogadro’s常數(shù)(1摩爾溶液大約有6.022 141 5×1023拷貝數(shù))計(jì)算質(zhì)??截悢?shù),按公式(1)、(2)、(3)和(4)計(jì)算:

    質(zhì)量=質(zhì)粒質(zhì)量濃度(ng/μL)×體積(μL)

    (1)

    分子質(zhì)量(平均分子質(zhì)量)=(載體質(zhì)粒片段大小+插入片段大小)×(330 Da×2)

    (2)

    (注:每個(gè)堿基平均分子質(zhì)量為330 Da,每對(duì)堿基平均分子質(zhì)量為660 Da)

    溶液摩爾數(shù)=質(zhì)量/分子質(zhì)量

    (3)

    拷貝數(shù)=溶液摩爾數(shù)×6.022 141 5×1023

    (4)

    1.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

    取8個(gè)0.2 μL PCR反應(yīng)管編號(hào),每管加入20 μL DEPC水。從提取的質(zhì)粒溶液中吸取5 μL,加入到第1管中,旋渦振蕩3 s,充分混勻。更換槍頭后,從第1管中吸取5 μL溶液加入到第2管中,同樣振蕩3 s。以此類推直至第8管,按體積比1∶5進(jìn)行稀釋,蓋緊后短暫離心后備用。

    1.2.9 熒光定量PCR擴(kuò)增

    20 μL反應(yīng)體系包括:SYBR Green Realtime PCR Mix 10 μL,正/反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL(引物序列同前),ROX Reference Dye 0.4 μL,DEPC 水 6 μL,模板2 μL。預(yù)變性95 ℃ 5 min,變性95 ℃ 10 s,退火15 s(溫度同前),延伸72 ℃ 45 s,共40個(gè)循環(huán),72 ℃收集熒光,溶解曲線設(shè)置為默認(rèn)值。

    1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析

    統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 18.0軟件,組間差異性分析采用單因素方差分析的方法,當(dāng)P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果于分析

    2.1 擴(kuò)增插入片段

    隨機(jī)挑選3份提取好的樣本核酸,利用4種優(yōu)勢(shì)菌屬的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖1所示,擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期長(zhǎng)度基本一致,葡萄球菌屬(150 bp)、乳酸桿菌(341 bp)、鏈霉菌(583 bp)和腸球菌(144 bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)明顯非特異性條帶,說(shuō)明菌屬引物特異性較好,陰性對(duì)照均正常無(wú)污染。

    a-乳酸桿菌屬和葡萄球菌屬;b-鏈酶菌屬;c-腸球菌屬圖1 特異性引物擴(kuò)增效果Fig.1 Specific primer amplification effect

    2.2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選

    經(jīng)過(guò)平板篩選和DNA測(cè)序驗(yàn)證,4種優(yōu)勢(shì)菌屬的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒均構(gòu)建成功,通過(guò)提取質(zhì)??梢杂糜跇?biāo)準(zhǔn)曲線樣本的制備。

    2.3 葡萄球菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)結(jié)果

    經(jīng)過(guò)qPCR測(cè)定,計(jì)算葡萄球菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)分別為:E=84.71%,R2=0.998,Slope=-3.753,Tm=83.67(圖2-a),R2值較好。不同取樣時(shí)間熒光定量PCR結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)顯示HZ、XA組葡萄球菌屬的數(shù)量在14 d前均呈增多趨勢(shì),而后持續(xù)減少。

    2.4 乳酸桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)結(jié)果

    乳酸桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)分別為:E=88.73%,R2=0.996,Slope=-3.625,Tm=87.09(圖3-a),不同取樣時(shí)間熒光定量PCR結(jié)果見表2。由表2可知,隨著時(shí)間延長(zhǎng),3組乳酸桿菌屬的數(shù)量在14 d后均呈下降趨勢(shì)。

    a-標(biāo)準(zhǔn)曲線;b-熔解曲線;c-擴(kuò)增曲線圖2 葡萄球菌屬熒光定量PCR結(jié)果Fig.2 Staphylococcus qPCR results

    表2 三個(gè)地市4種優(yōu)勢(shì)菌屬的比較 單位:拷貝數(shù)

    a-標(biāo)準(zhǔn)曲線;b-熔解曲線;c-擴(kuò)增曲線圖3 乳酸桿菌屬熒光定量PCR結(jié)果Fig.3 Lactobacillus qPCR results

    2.5 鏈霉菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)結(jié)果

    經(jīng)過(guò)倍比稀釋,鏈霉菌屬標(biāo)準(zhǔn)品所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)分別為:E=79.68%,R2=0.990,Slope=-3.929,Tm=89.93(圖4-a)。從表2數(shù)據(jù)可以看出,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),YL、XA組鏈霉菌屬的數(shù)量整體呈上升趨勢(shì)。

    2.6 腸球菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)結(jié)果

    腸球菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)分別為:E=102.71%,R2=0.999,Slope=-3.259,Tm=84.86(圖5-a),R2值也較好,不同取樣點(diǎn)熒光定量PCR結(jié)果見表2。結(jié)果表明,HZ、XA組腸球菌屬的數(shù)量在28 d后才出現(xiàn)下降。

    綜合來(lái)看,4種優(yōu)勢(shì)菌屬的擴(kuò)增曲線基線平整、指數(shù)區(qū)明顯,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合度高,說(shuō)明可信度高結(jié)果可靠,熔解曲線呈現(xiàn)單一熔解峰,說(shuō)明無(wú)引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。

    2.7 不同地區(qū)間優(yōu)勢(shì)菌屬的比較

    比較不同地區(qū)間4種優(yōu)勢(shì)菌qPCR結(jié)果后發(fā)現(xiàn),葡萄球菌屬和腸球菌屬3組之間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),說(shuō)明受采樣地影響較為明顯。而乳酸桿菌和鏈霉菌2個(gè)菌屬則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    a-標(biāo)準(zhǔn)曲線;b-熔解曲線;c-擴(kuò)增曲線圖4 鏈霉菌屬熒光定量PCR結(jié)果Fig.4 Streptomyces qPCR results

    a-標(biāo)準(zhǔn)曲線;b-熔解曲線;c-擴(kuò)增曲線圖5 腸球菌屬熒光定量PCR結(jié)果Fig.5 Enterococcus qPCR results

    3 結(jié)論與討論

    不同品牌的雞蛋蛋殼表面菌落總數(shù)在貯存初期介于9.315×102~1.367×104CFU/個(gè)[4],隨著貯藏時(shí)間的變化呈上升趨勢(shì),貯藏時(shí)間越長(zhǎng)受污染的程度越大[18]。然而蛋殼表面的菌群多種多樣,只有少部分是致病菌,一些正常菌群的增加似乎起到了避免雞蛋被致病菌定植,防止雞蛋腐敗變質(zhì)的作用[22-23]。采用DGGE分析的方法與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法,所測(cè)得的細(xì)菌總數(shù)和多樣性也不盡相同[24]。

    在美國(guó)雞蛋的貨架期通常被限定為45 d[19],國(guó)內(nèi)銷售的散裝雞蛋目前大多沒(méi)有標(biāo)注生產(chǎn)日期,盒裝品牌雞蛋的保質(zhì)期根據(jù)儲(chǔ)藏溫度也有所不同,通常在30~60 d且尚未有完善的雞蛋貨架期標(biāo)準(zhǔn)。此次通過(guò)熒光定量PCR的方法發(fā)現(xiàn),4種蛋殼表面的優(yōu)勢(shì)菌屬數(shù)量隨著儲(chǔ)存時(shí)間的變化各不相同,其中葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量在儲(chǔ)存的前14 d呈現(xiàn)增多的趨勢(shì),14 d后則下降。鏈霉菌屬數(shù)量整體呈上升趨勢(shì),而腸球菌屬數(shù)量在儲(chǔ)存28 d 后呈下降趨勢(shì)。葡萄球菌屬是蛋內(nèi)發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)菌之一,除此之外還有鏈球菌、大腸桿菌、變形桿菌、假單胞菌和沙門氏菌等均能引起禽蛋不同程度的腐敗變質(zhì)[20]。蛋殼表面葡萄球菌屬數(shù)量的增多與蛋內(nèi)葡萄球菌的污染是否有關(guān)有待進(jìn)一步研究。乳酸桿菌屬適宜在厭氧的環(huán)境下生長(zhǎng),此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示蛋殼表面的乳酸桿菌屬數(shù)量先增加后減少。有研究顯示乳酸菌能夠抑制某些腐敗菌引起的產(chǎn)膜、變色和使汁液渾濁等腐敗現(xiàn)象的發(fā)生[25],除此之外,鏈霉菌也具有一定的抗菌活性[21],此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中鏈霉菌屬數(shù)量的增加是否與抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)有關(guān)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。蛋殼表面乳酸桿菌屬和鏈霉菌屬的數(shù)量在3個(gè)地區(qū)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,也許可以反映鮮雞蛋在儲(chǔ)存過(guò)程中品質(zhì)變化的真實(shí)情況。由于我們的樣品數(shù)量有限, 4種優(yōu)勢(shì)菌屬的統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    乳酸桿菌霉菌葡萄球菌
    喝酸奶或可治療抑郁
    揭示水霉菌繁殖和侵染過(guò)程
    乳酸桿菌在宮頸癌發(fā)病中的作用研究進(jìn)展*
    甘肅科技(2021年9期)2021-04-11 11:19:11
    如何防治兔葡萄球菌病
    肉雞葡萄球菌病診療
    霉菌的新朋友—地衣
    地衣和霉菌
    青霉菌柚苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)
    一例水牛疥螨繼發(fā)感染葡萄球菌病的診治
    雞葡萄球菌病的綜合防治措施
    欧美日本亚洲视频在线播放| 国产麻豆成人av免费视频| 精品午夜福利在线看| 国产高潮美女av| 午夜精品国产一区二区电影 | 黑人高潮一二区| 日韩人妻高清精品专区| 国产欧美日韩精品一区二区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲精品国产成人久久av| eeuss影院久久| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费观看精品视频网站| 国产美女午夜福利| 偷拍熟女少妇极品色| 一区二区三区高清视频在线| 大香蕉久久网| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久九九热精品免费| 久久综合国产亚洲精品| 久久精品国产清高在天天线| 国产男靠女视频免费网站| 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人a区在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲五月天丁香| 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲色图av天堂| a级一级毛片免费在线观看| 国产久久久一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区精品| 日本免费a在线| 日韩三级伦理在线观看| 成人三级黄色视频| 亚洲电影在线观看av| 国产伦在线观看视频一区| 99热这里只有是精品50| 国产在线精品亚洲第一网站| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品国产亚洲av天美| 高清毛片免费看| 麻豆乱淫一区二区| 国产片特级美女逼逼视频| 毛片女人毛片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成年女人永久免费观看视频| 在线观看66精品国产| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美在线一区亚洲| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品福利观看| 一级av片app| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久久久精品国产欧美久久久| 99久久精品国产国产毛片| 国产精品,欧美在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 毛片一级片免费看久久久久| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 伦理电影大哥的女人| 国产成人一区二区在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲人成网站在线播| 久久九九热精品免费| 日本a在线网址| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产视频一区二区在线看| .国产精品久久| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲欧美清纯卡通| 男女边吃奶边做爰视频| 日本五十路高清| 亚洲av二区三区四区| 亚洲图色成人| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 男人狂女人下面高潮的视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 99久国产av精品国产电影| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产高清视频在线播放一区| 九九在线视频观看精品| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲无线观看免费| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日日啪夜夜撸| 国产精品永久免费网站| 一级毛片我不卡| 有码 亚洲区| 22中文网久久字幕| 可以在线观看毛片的网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 色5月婷婷丁香| 在线免费十八禁| 少妇的逼好多水| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产综合懂色| 天天躁日日操中文字幕| 久久精品国产自在天天线| 成人亚洲欧美一区二区av| 成年av动漫网址| 97热精品久久久久久| 免费av不卡在线播放| 国产激情偷乱视频一区二区| 99热这里只有是精品在线观看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 哪里可以看免费的av片| avwww免费| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一级毛片aaaaaa免费看小| 韩国av在线不卡| 国产美女午夜福利| 国模一区二区三区四区视频| 成人特级av手机在线观看| 草草在线视频免费看| 色在线成人网| 九九在线视频观看精品| 97超碰精品成人国产| 别揉我奶头 嗯啊视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 春色校园在线视频观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲乱码一区二区免费版| 国内精品美女久久久久久| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 免费人成在线观看视频色| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲av免费在线观看| 91av网一区二区| 不卡一级毛片| 国产探花极品一区二区| 丝袜喷水一区| 精品人妻熟女av久视频| 夜夜爽天天搞| 久久久久久国产a免费观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日本一二三区视频观看| 亚洲av免费在线观看| 在线观看一区二区三区| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美区成人在线视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 午夜久久久久精精品| 久久久a久久爽久久v久久| 精品无人区乱码1区二区| 国产成年人精品一区二区| 在线观看一区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 真人做人爱边吃奶动态| 毛片女人毛片| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩欧美三级三区| 国产精品无大码| 日本黄大片高清| 国产伦在线观看视频一区| 欧美成人免费av一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| or卡值多少钱| 国产av不卡久久| 无遮挡黄片免费观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日本熟妇午夜| 中文字幕久久专区| 欧美中文日本在线观看视频| 久久6这里有精品| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成年版毛片免费区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久99久视频精品免费| 日韩高清综合在线| 久久久久久久午夜电影| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 高清午夜精品一区二区三区 | 精品乱码久久久久久99久播| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产一区二区激情短视频| 日韩一本色道免费dvd| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲图色成人| 亚洲成人久久爱视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 我要看日韩黄色一级片| 美女黄网站色视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美+日韩+精品| 日本免费a在线| 欧美性猛交黑人性爽| 久久亚洲精品不卡| 免费看光身美女| 欧美高清成人免费视频www| 高清毛片免费看| 一级av片app| 成人性生交大片免费视频hd| 久久久久国内视频| 成人午夜高清在线视频| av在线观看视频网站免费| 亚洲美女黄片视频| 成人三级黄色视频| 日本 av在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产不卡一卡二| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品人妻偷拍中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲第一区二区三区不卡| 在线播放无遮挡| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久久欧美国产精品| 国产 一区 欧美 日韩| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲欧美日韩高清在线视频| av在线老鸭窝| 久久久久久久久久久丰满| 极品教师在线视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲国产精品国产精品| 少妇人妻精品综合一区二区 | 一区二区三区免费毛片| 男女边吃奶边做爰视频| 久久久久久国产a免费观看| 哪里可以看免费的av片| 国产精品,欧美在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 国产精品一区二区免费欧美| 国产av一区在线观看免费| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产伦一二天堂av在线观看| 在线国产一区二区在线| 国产免费男女视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜日韩欧美国产| av在线亚洲专区| 精品人妻偷拍中文字幕| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲最大成人中文| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 黄色一级大片看看| 女同久久另类99精品国产91| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 九九爱精品视频在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲av免费高清在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产精品一区二区性色av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩国内少妇激情av| 国产精品人妻久久久久久| 在线国产一区二区在线| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲三级黄色毛片| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 91狼人影院| 日韩成人伦理影院| 亚洲av二区三区四区| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 香蕉av资源在线| 国产老妇女一区| 国产高潮美女av| 久久精品人妻少妇| 黄片wwwwww| 亚洲18禁久久av| 嫩草影院精品99| 欧美激情在线99| 中国美女看黄片| 插阴视频在线观看视频| 变态另类丝袜制服| 香蕉av资源在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产亚洲欧美98| 免费观看的影片在线观看| 乱系列少妇在线播放| 午夜激情福利司机影院| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 最近最新中文字幕大全电影3| 波多野结衣巨乳人妻| 看免费成人av毛片| 国内精品一区二区在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日本一本二区三区精品| 久久久精品大字幕| 国产在线男女| 中文资源天堂在线| 国产精品不卡视频一区二区| 中文字幕av在线有码专区| 大香蕉久久网| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99久久精品热视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 少妇的逼水好多| 网址你懂的国产日韩在线| 波多野结衣高清无吗| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲自拍偷在线| 春色校园在线视频观看| 最近在线观看免费完整版| 麻豆成人午夜福利视频| 三级毛片av免费| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 99视频精品全部免费 在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| ponron亚洲| 神马国产精品三级电影在线观看| 看黄色毛片网站| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲最大成人手机在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 99热精品在线国产| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 两个人的视频大全免费| 日本色播在线视频| 五月伊人婷婷丁香| av国产免费在线观看| 亚洲18禁久久av| 国产精品久久视频播放| 免费在线观看成人毛片| 国产片特级美女逼逼视频| 女人被狂操c到高潮| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲性久久影院| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品三级大全| 美女内射精品一级片tv| 国产精品嫩草影院av在线观看| 1024手机看黄色片| 精品久久久久久成人av| 国产精品永久免费网站| 午夜日韩欧美国产| 在线天堂最新版资源| 国产真实伦视频高清在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费av毛片视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 日本精品一区二区三区蜜桃| АⅤ资源中文在线天堂| 我要搜黄色片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产人妻一区二区三区在| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 中出人妻视频一区二区| 桃色一区二区三区在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩国内少妇激情av| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本黄大片高清| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 在线观看免费视频日本深夜| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久这里只有精品中国| 九九热线精品视视频播放| 日韩高清综合在线| 亚洲精品456在线播放app| 又爽又黄a免费视频| 免费av观看视频| 亚洲不卡免费看| 国产精品一区www在线观看| 亚洲av熟女| 成人性生交大片免费视频hd| 赤兔流量卡办理| 婷婷精品国产亚洲av| 看十八女毛片水多多多| 国产午夜福利久久久久久| 热99在线观看视频| 黄色视频,在线免费观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 最近在线观看免费完整版| 天堂网av新在线| 黄色一级大片看看| 久久久久国产网址| 欧美区成人在线视频| 99久久精品热视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 1024手机看黄色片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 搡老熟女国产l中国老女人| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产麻豆成人av免费视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 午夜福利高清视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲av免费在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品一二三区在线看| 亚洲在线自拍视频| 欧美+日韩+精品| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品,欧美在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品伦人一区二区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 美女 人体艺术 gogo| 免费观看精品视频网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩制服骚丝袜av| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲四区av| 午夜老司机福利剧场| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产精品一区www在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 97超碰精品成人国产| 午夜福利18| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精华一区二区三区| 精品日产1卡2卡| 一个人看的www免费观看视频| 我的女老师完整版在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 在线观看66精品国产| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲精品久久国产高清桃花| 中文在线观看免费www的网站| 全区人妻精品视频| 我的女老师完整版在线观看| 久久久色成人| 国产探花在线观看一区二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成年版毛片免费区| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久欧美国产精品| 国产乱人视频| 亚洲最大成人av| 在线看三级毛片| 国产免费男女视频| 黄片wwwwww| 午夜福利在线观看吧| 少妇人妻精品综合一区二区 | 成年版毛片免费区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一级毛片电影观看 | 简卡轻食公司| av福利片在线观看| 成人国产麻豆网| 国产精品伦人一区二区| 悠悠久久av| 黄色视频,在线免费观看| 精品日产1卡2卡| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产蜜桃级精品一区二区三区| av卡一久久| 精品久久久久久成人av| 国产在视频线在精品| 国产高清不卡午夜福利| 波多野结衣巨乳人妻| 婷婷精品国产亚洲av在线| 夜夜爽天天搞| 亚洲国产精品久久男人天堂| av.在线天堂| 精品久久久久久久久av| 久久99热6这里只有精品| 婷婷亚洲欧美| 一进一出好大好爽视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产单亲对白刺激| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲自拍偷在线| 午夜老司机福利剧场| 女人被狂操c到高潮| 波野结衣二区三区在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美bdsm另类| 长腿黑丝高跟| 久久久成人免费电影| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久鲁丝午夜福利片| 婷婷六月久久综合丁香| 最后的刺客免费高清国语| 国产成人a区在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜精品在线福利| 99久久精品一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲精品国产成人久久av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 春色校园在线视频观看| 久久人人爽人人片av| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产高清视频在线播放一区| 一级毛片电影观看 | 日本五十路高清| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜免费激情av| 成人av在线播放网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 日日啪夜夜撸| 久久久成人免费电影| 一本一本综合久久| 色5月婷婷丁香| 99视频精品全部免费 在线| 国产不卡一卡二| 97热精品久久久久久| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲熟妇熟女久久| 成人性生交大片免费视频hd| 久久久久性生活片| 国产视频内射| 久久久久免费精品人妻一区二区| 美女免费视频网站| 69av精品久久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲国产精品成人综合色| 精品一区二区三区视频在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 嫩草影视91久久| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品爽爽va在线观看网站| 男人的好看免费观看在线视频| 看片在线看免费视频| 国产极品精品免费视频能看的| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美日韩国产亚洲二区| 午夜福利视频1000在线观看| 99热这里只有是精品50| 日韩精品中文字幕看吧| avwww免费| 在线播放无遮挡| 久久中文看片网| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 成年免费大片在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| h日本视频在线播放| 欧美激情在线99| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人aa在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| www.色视频.com| 国产美女午夜福利| 不卡视频在线观看欧美| 一区福利在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 91精品国产九色| 看十八女毛片水多多多| 亚洲精品国产成人久久av| 乱人视频在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 身体一侧抽搐| 美女cb高潮喷水在线观看| 97超碰精品成人国产| 精品国产三级普通话版| 插阴视频在线观看视频| 午夜福利成人在线免费观看| 精品熟女少妇av免费看| 一夜夜www| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲精品在线观看二区| 精品人妻熟女av久视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩国内少妇激情av| 男女啪啪激烈高潮av片| 舔av片在线| 国产 一区 欧美 日韩| 身体一侧抽搐| 亚洲七黄色美女视频| 一进一出抽搐动态| 国产精品99久久久久久久久| 国产成年人精品一区二区| 免费看日本二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 91av网一区二区| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产久久久一区二区三区| 午夜福利在线在线| 亚洲精品国产av成人精品 | or卡值多少钱| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲中文字幕日韩| 听说在线观看完整版免费高清| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 成人亚洲精品av一区二区| 成人亚洲欧美一区二区av|