基于UPLC-MS/MS測定烘焙咖啡豆中美拉德產(chǎn)物F3-A含量

王東旭，胡奇杰，王鳳麗，王新財，厲芬，陳褚建

(湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州，313000)

美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)是一種在食品熱加工和貯藏過程中廣泛存在的非酶褐變反應(yīng)，主要是指食品中的羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質(zhì))間發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)，又稱羰胺反應(yīng)[1]。隨著美拉德反應(yīng)的進行，會產(chǎn)生一系列復(fù)雜的化合物，稱為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)。MRPs廣泛存在于各種食品體系中，對食品的色澤、風(fēng)味、穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值具有很大的影響[2-3]。[5-(5,6-dihydro-4H-pyridin-3-ylidenemethyl)-furan-2-yl]methanol，簡稱F3-A，是葡萄糖-賴氨酸反應(yīng)模型中發(fā)現(xiàn)的一個美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[4-7]。藥理實驗研究顯示，F(xiàn)3-A在細胞因子誘導(dǎo)的Caco-2細胞中對NO及誘導(dǎo)性NO合成酶具有明顯的抑制作用，是一種潛在的預(yù)防腸道炎癥活性物質(zhì)[8]。Caco-2細胞滲透性實驗表明，F(xiàn)3-A還具備較好的滲透性，同時由于F3-A具備良好的水溶性，其具有較高的生物利用度，因此有望在體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用[9]。

F3-A作為美拉德反應(yīng)模型產(chǎn)物，主要由葡萄糖脫水形成的5-羥甲基糠醛與賴氨酸經(jīng)Strecker降解、脫水環(huán)化形成的2,3,4,5-四氫吡啶發(fā)生縮合反應(yīng)形成[9]。但其在真實食品中的研究還較少，目前文獻報道只在烘焙面包中檢出[9]，在其他食品中的研究還未見報道。

咖啡中含有大量的活性成分，具有減肥、提神醒腦、利尿、抗氧化等保健功效[10-12]，其中綠原酸[13-14]、咖啡因[15-17]、葫蘆巴堿[16-19]等已得到較多研究，但烘焙咖啡豆中F3-A含量的檢測尚未見報道?；趯3-A的生成機理分析，咖啡生豆中含有約60%糖類物質(zhì)和0.6%賴基酸[20]，在烘焙環(huán)境下，推測烘焙咖啡豆中會有F3-A生成。同時目前關(guān)于F3-A的檢測方法主要為液相色譜法[9]，該法具有對復(fù)雜基質(zhì)分離要求較高，檢出限相對較高等不足。超高效液質(zhì)聯(lián)用法(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)作為一種集液相色譜的高分離效能與質(zhì)譜的強鑒定能力于一體的檢測技術(shù)，具有適用范圍廣、靈敏度高、重復(fù)性好的特點，因而開發(fā)針對烘焙咖啡豆中F3-A的液質(zhì)聯(lián)用方法對于探究F3-A在咖啡豆中的存在與否具有重要意義，此項研究同時有助于開發(fā)咖啡的潛在藥用價值和經(jīng)濟價值。

本研究以5種咖啡豆(分別產(chǎn)自洪德拉斯、肯尼亞、印尼、巴西和薩爾瓦多)為原料，經(jīng)過不同程度(輕度、中輕度、中度、中深度、重度和重深度)的烘焙，采用UPLC-MS/MS法檢測F3-A含量。通過分析F3-A含量變化，揭示不同烘焙時間、溫度對不同品種咖啡豆F3-A成分的影響，為調(diào)控烘焙咖啡豆中F3-A含量、提高咖啡藥用價值提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準品： [5-(5,6-dihydro-4H-pyridin-3-ylidenemethyl)-furan-2-yl]methanol(F3-A)，按參考文獻 [6]合成，結(jié)構(gòu)經(jīng)紅外譜圖和質(zhì)譜確證，經(jīng)高效液相色譜峰面積歸一化法定量測定，純度>95%；甲醇(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)、氨水(分析純，質(zhì)量分數(shù)25%～28%)，上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸(分析純，質(zhì)量分數(shù)36.0%～38.0%)，江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司；Waters Oasis MCX(混合型強陽離子交換反向吸附劑)固相萃取小柱(60 mg，3 mL)、Waters Oasis WCX(混合型弱陽離子交換反相吸附劑)固相萃取小柱(60 mg，3 mL)、Waters Oasis HLB(全能型親水親脂平衡反相吸附劑)固相萃取小柱(60 mg，3 mL)，美國Waters公司；試驗用水為超純水。

咖啡原料：洪德拉斯SHB咖啡豆，產(chǎn)自洪都拉斯NINFA LANZA莊園；肯尼亞AA++咖啡豆，產(chǎn)自肯尼亞奇雅瓦姆魯魯；印尼羅布斯塔咖啡豆，產(chǎn)自印度尼西亞爪哇；巴西喜拉多咖啡豆，產(chǎn)自巴西喜拉多；薩爾瓦多紅波旁咖啡豆，產(chǎn)自薩爾瓦多Loma La GIoria莊園。

ACQUITYTM 超高效液相色譜、XevoTMTQD三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司；ME204E型電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；Genius 3漩渦混合器，德國IKA公司；KB-5010型試管振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-500DB型超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Allegra X-12R型臺式冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；12孔固相萃取儀，美國Supelco公司；Turbovap LV型多樣品自動濃縮儀，瑞典Biotage公司；Simplicity型超純水儀，美國MilliPore公司；L9/11/B410型馬弗爐，德國Nabertherm公司；JFSD-100型粉碎機，上海嘉定糧油儀器有限公司。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的制備

準確稱取F3-A標準物質(zhì)適量，用甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL儲備溶液，置于-20 ℃冰箱中保存。根據(jù)需要移取標準儲備溶液，經(jīng)初始流動相溶液配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、50、100、500和1 000 ng/mL的標準工作溶液。取1.00 mL標準溶液經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾后供UPLC-MS/MS檢測。

1.2.2 供試品溶液的制備

隨機選取咖啡豆平鋪一層于坩堝盤中，放入馬弗爐固定位置烘焙。設(shè)定烘焙溫度為220 ℃，烘焙時間分別為10、20、30、40、50和60 min，烘焙完成后，立即取出冷卻至室溫。參照文獻[18]按咖啡豆爆裂程度定義為輕度(一爆密集爆)、中輕度(一爆尾爆)、中度(一爆結(jié)束二爆前)、中深度(二爆初爆)、重度(二爆密集爆)、重深度(二爆尾爆)。收集烘焙咖啡豆樣品，用粉碎機將咖啡豆粉碎(粒徑1.00 mm)，供含量測定。

稱取1.00 g(精確至0. 01 g)咖啡豆粉置于15 mL離心管中，加入10.00 mL 1 mol/L HCl溶液，渦旋2 min，超聲20 min，以9 000 r/min離心5 min，取上清液5.00 mL過固相萃取小柱(依次用3.00 mL甲醇和3.00 mL水活化)，經(jīng)3.00 mL水和3.00 mL甲醇淋洗，6.00 mL 體積分數(shù)5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液于試管中，40 ℃下氮吹至近干，加入1.00 mLV(甲醇)∶V(0.1%甲酸水溶液)=5∶95混合溶液復(fù)溶，混勻，過0.22 μm有機濾膜。按儀器工作條件進行測定。

1.3 測定方法

分別精密吸取上述不同濃度對照品溶液各5.00 μL，注入高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，測定出峰面積，以質(zhì)量濃度(ng/mL)(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制F3-A化合物標準曲線圖。精密吸取上述供試品溶液5.00 μL，注入高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，測定峰面積，采用外標法定量。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為甲醇溶液，流動相B為體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，5%A；1.0～2.0 min，5%～50%A；2.0～3.0 min，50%～95%A；3.0～4.0 min，95%A；4.0～4.1 min，95%A～5%A；4.1～7.0 min，5%A；流速0.30 mL/min；進樣體積5.00 μL；柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)電離，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式檢測；毛細管電壓為5.0 kV；離子源和脫溶劑氣溫度分別為150和350 ℃；脫溶劑氣和錐孔氣流速分別為800和50 L/h；碰撞氣為氬氣；F3-A的定性定量離子對(m/z)、錐孔電壓及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 F3-A的監(jiān)測離子對及最佳質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Selected transitions and optimized potentials of F3-A

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

由于咖啡豆基質(zhì)較為復(fù)雜，采用振蕩提取和液液萃取作為提取和純化方法提取效率不高，純化效果不佳[9]。因此本研究分別對提取和純化方式進行了優(yōu)化。在其余條件完全一致情況下，分別采用振蕩提取20 min和超聲20 min,考察2種方式的提取效率。結(jié)果表明，超聲提取得到的目標物響應(yīng)面積較振蕩高(15.2±1.3)%，故確定超聲20 min作為最佳提取方法。其次考察了各種固相萃取小柱的純化效果，由于F3-A為弱堿性，本研究選取了Oasis HLB、Oasis MCX、Oasis WCX 3種相同品牌及規(guī)格，但不同填料類型的固相萃取小柱進行純化優(yōu)化，如圖1所示。結(jié)果顯示，WCX和MCX均能有效地對F3-A進行富集及純化，其中MCX的富集及純化效果最佳，而HLB則較難在柱中保留，故最終選取MCX作為最優(yōu)固相萃取小柱。

圖1 固相萃取小柱優(yōu)化Fig.1 Optimization of solid phase extraction column

2.2 標準曲線、線性范圍和檢出限

將F3-A對照溶液在上述液相質(zhì)譜條件下進行測定，繪制進樣濃度為橫坐標、定量離子對峰面積為縱坐標的F3-A化合物標準曲線，線性擬合得到線性方程和決定系數(shù)，結(jié)果見表2。F3-A線性擬合良好，決定系數(shù)達到0.999。F3-A對照品溶液色譜圖及陽性樣品色譜圖見圖2。F3-A峰形良好，目標峰周圍無雜峰干擾，滿足定量檢測要求。根據(jù)信噪比(S/N)=3，采用不含F(xiàn)3-A的空白基質(zhì)樣品提取液逐級稀釋F3-A標準溶液分析得到檢出限。

表2 回歸方程和線性范圍Table 2 Linearity Parameter and linear range of F3-A

a-F3-A標準溶液色譜圖(10 ng/mL)；b-陽性樣品色譜圖圖2 F3-A標準溶液色譜圖和陽性樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms for the standard solution of F3-A and the positive sample

2.3 回收率和精密度實驗

在咖啡豆樣品中分別加入3個濃度梯度的F3-A標準溶液，按上述條件平行測定6次，扣除本底含量后計算加標回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表3。采用該方法測定F3-A的加標回收率為85.7%～93.3%，相對標準偏差為2.56%～3.97%。F3-A化合物精密度和回收率均滿足定量檢驗需求。

表3 F3-A精密度與回收試驗結(jié)果(n=6)Table 3 Test results for recovery and precision(n=6)

2.4 烘焙咖啡豆F3-A含量檢測及調(diào)控

基于新建立的咖啡豆中F3-A的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，在220 ℃下對5種咖啡生豆中F3-A含量進行了測定，結(jié)果見圖3。未烘焙情況下，5種咖啡生豆中均未檢出F3-A，隨著烘焙條件的加入，正如之前推測，5種咖啡豆中均檢測出F3-A，隨著烘焙時間的增加，F(xiàn)3-A的含量先升高再下降，烘焙10 min時，除了薩爾瓦多紅波旁咖啡豆，其余4種咖啡豆中F3-A含量達到峰值，肯尼亞AA++咖啡豆含量最高達到297.5 μg/kg。烘焙時間繼續(xù)增加，F(xiàn)3-A含量則逐漸下降，烘焙時間達到40 min時，5種烘焙咖啡豆中F3-A含量不再檢出。因此，確定10 min為最佳咖啡豆烘焙時間。

圖3 五種咖啡豆不同烘焙時間下的F3-A含量變化(n=3)Fig.3 F3-A content of 5 coffee beans with different roasting time (n=3)

不同烘焙溫度下烘焙10 min后對5種咖啡豆中F3-A的含量進行測定，結(jié)果見圖4。不同烘焙溫度下F3-A含量差異較大， 200 ℃時，5種咖啡豆中F3-A含量達到峰值，洪都拉斯SHB和肯尼亞AA++咖啡豆含量最高，分別達到了318.1和329.5 μg/kg，溫度繼續(xù)增高會造成F3-A含量下降。因此最終確定咖啡豆最佳烘焙溫度為200 ℃。

圖4 五種咖啡豆不同烘焙溫度下的F3-A含量變化(n=3)Fig.4 F3-A content of 5 coffee beans with different roasting temperature (n=3)

結(jié)合不同溫度和不同時間下F3-A含量比對發(fā)現(xiàn)，二者之間存在交叉影響，咖啡豆在240 ℃烘焙10 min與220 ℃下烘焙30 min兩種模式下，F(xiàn)3-A含量接近，表明低溫長時烘焙和高溫短時烘焙具有類似的烘焙效果，其原因推測為F3-A分解速率受溫度因素影響所致，在較高溫度下F3-A分解越快，較低溫度下F3-A含量維持更久。

3 結(jié)論

本文建立了以UPLC-MS/MS檢測咖啡豆中F3-A含量的檢測方法，采用鹽酸溶液提取、MCX固相萃取小柱純化，在MRM模式下檢測，外標法定量。該分析方法靈敏度好、準確度高、實用性強，其中檢出限為1.0 μg/kg，遠低于已報道[9]的21.0 μg/kg，為咖啡豆中F3-A含量檢測尤其是痕量檢測提供了技術(shù)支持。本文首次發(fā)現(xiàn)了烘焙咖啡豆存在美拉德產(chǎn)物F3-A，且F3-A含量與烘焙條件和咖啡豆品種密切相關(guān)。不同烘焙溫度及時間下，5種咖啡豆中F3-A含量測定結(jié)果顯示，輕度烘焙時F3-A含量普遍較高，最優(yōu)烘焙條件為200 ℃下烘焙10 min?？夏醽咥A++咖啡豆較其他4種咖啡豆中生成F3-A含量更高，達到329.5 μg/kg。與文獻[9]報道烘焙面包中F3-A的最高含量(177 μg/kg)相比，烘焙咖啡豆中F3-A含量更高，更具有潛在的藥用價值。