黑曲霉群菌種多相分類和鑒定方法最新研究進展

韓小敏，李鳳琴

(國家食品安全風險評估中心，國家衛(wèi)生健康委員會食品安全風險評估重點實驗室，北京，100021)

黑曲霉群(Aspergillusnigergroup)是曲霉屬(Aspergillus)環(huán)繞亞屬(Subgen.Circumdati)黑色組(Sect.Nigri)的一組具有不同程度的黑褐色、紅褐色、橄欖褐色和暗褐色等至黑色分生孢子頭的菌群，即Raper & Fennell(1965)分類系統(tǒng)中的Aspergillusnigergroup[1]。黑曲霉群菌種在自然界分布極為普遍，也是常見引起食品和飼料等腐敗變質的植物病害真菌，但某些菌種因具有重要的經濟利用價值而被廣泛用于食品、醫(yī)藥等工業(yè)[2]。20世紀80年代，美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)將黑曲霉列入一般認為是安全的菌種(generally recognized as safe，GRAS)進行管理，并將其廣泛用于淀粉酶、脂肪酶、檸檬酸和葡萄糖酸等幾十種食品添加劑的生產[3-6]。據報道，已知的黑曲霉群菌種主要來源于土壤，但近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉群菌種可普遍從污染的葡萄、咖啡和可可及其制品等中分離[7-11]。

黑曲霉群菌種作為食品發(fā)酵工業(yè)常用菌和食品中常見的腐敗菌，已有許多分類學家對其系統(tǒng)發(fā)育和分類學關系進行了比較全面的研究，但黑曲霉群菌種的正確分類和鑒定仍然是目前分類學研究中較為困難的一類[10, 12-15]。截止到2019年，黑曲霉群中已有27種黑曲霉的分類學地位被確定。此外，已有研究表明，該類群菌種生物多樣性復雜，難以通過形態(tài)學進行鑒定，需要結合生理學分析、細胞外分泌物類型、分子生物學手段等進行綜合鑒定[10, 12-21]。FRISVAD等[16]總結了不同鑒定方法在曲霉屬(包括黑曲霉群)菌種分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育中的應用情況，具體見表1。分別闡述形態(tài)學、生理特征、細胞外分泌物特征、分子生物學特征和全基因組測序等技術在該類菌種分類鑒定中的具體應用情況。

表1 不同鑒定技術在曲霉屬真菌分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育中的應用情況Table 1 Application of different identification technologies used to characterize Aspergillus strains for taxonomic and phylogenetic purposes

1 不同分類和鑒定方法的研究現(xiàn)狀

1.1 形態(tài)學特征

通常來說，以菌落的宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)為基礎的傳統(tǒng)形態(tài)學特征數據是曲霉屬真菌菌種分類和鑒定的主要依據。但考慮到菌落形態(tài)受培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度等)的影響易發(fā)生改變，因此，如何確保待鑒定菌種與參考模式菌種的培養(yǎng)條件一致性是進行正確鑒定的前提。我國的曲霉屬真菌鑒定學專著《中國真菌志 第5卷曲霉屬及其相關有性型》推薦黑曲霉群菌種鑒定的培養(yǎng)基為查氏瓊脂(czapek agar，CA)、查氏酵母膏瓊脂(czapek yeast extract agar，CYA)和麥芽汁瓊脂(malt extract agar，MEA)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，變化范圍為22～27 ℃，培養(yǎng)時間為5、7、10和14 d或更長時間[1]。真菌學分類和鑒定領域的國際權威專家推薦黑曲霉群菌種鑒定的培養(yǎng)基為CYA、MEA和氯硝胺18%甘油(dichloran glycerol，DG18)瓊脂，培養(yǎng)溫度為15、25和37 ℃，培養(yǎng)時間為7和14 d 或更長時間[13-16]。此外，對于某些難以通過上述培養(yǎng)基進行區(qū)分的菌種，還可選擇肌酸蔗糖瓊脂(creatine sucrose agar，CREA)、麥芽汁提取物啶酰菌胺瓊脂(malt extract agar-boscalid，MEA-B)、酵母提取物蔗糖瓊脂(yeast extract sucrose agar，YES)和燕麥瓊脂(oatmeal agar，OAT)等，培養(yǎng)溫度還可選擇18、21、30、33和40 ℃等[13-14, 22-24]。

黑曲霉群菌種形態(tài)學鑒定的主要依據為待鑒定菌種在推薦的培養(yǎng)條件下的宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)特征[1-2, 13-24]。其中菌落的宏觀形態(tài)特征主要包括菌落的生長速度(以菌落直徑來表示)、菌落的邊緣是否整齊或有不規(guī)則缺裂、菌落的顏色及其變化、菌落的質地(絲絨狀、絮狀、繩狀)、菌落的基部菌絲體薄或厚，柔軟或堅韌，平坦、褶皺或具溝紋、菌落的表面是否產生無色或具有不同顏色的液滴、菌落的反面無色或具不同顏色，是否可以產生菌核等[1-2, 13-24]。菌落的微觀形態(tài)特征主要包括菌落在顯微鏡下的分生孢子梗包括足細胞、分子孢子頭、分生孢梗莖、頂囊、?；?、瓶梗和分生孢子等的形狀、大小、顏色、表面紋飾等，同時還要觀察產孢結構具體特征如產孢細胞的層數、長度和顏色等[1-2, 13-23]。黑曲霉群菌種一般具有黑色、黑褐色、紫褐色等的分生孢子頭，分生孢子頭一般為球形、輻射形或分裂成幾個柱狀結構；分生孢梗莖一般為光滑無色或近頂囊處帶暗褐色；頂囊球形或近球形，有時呈暗褐色；產孢結構為單層或雙層或同時存在單層或雙層產孢細胞；分生孢子球形、近球形、橢圓形或橫向扁平，光滑或不同程度的粗糙至具刺或縱向條紋；有的菌種可以產生菌核，菌核一般為球形或近球形，初為白色至奶油色，老后顏色變暗[1-2, 13-24]。

1.2 細胞外分泌物的特征

作為對外界生物和非生物環(huán)境的反應而產生的細胞外泌物的特征，也成為近年來黑曲霉群菌種分類和鑒定過程中常采用的重要依據[15]。該類物質主要包括次級代謝產物、過量合成的有機酸、積累的碳水化合物(例如海藻糖和多元醇)、胞外酶(extracellular enzymes)、疏水蛋白(hydrophobins)、黏附素(adhesins)、擴張素(expansins)和伴侶蛋白(chaperones)以及某些可能參與避免真菌繁殖結構被昆蟲、螨類和其他動物食用的聚酮類和生物堿等[25]。通常分泌到細胞外或聚集在細胞壁上，并隨著環(huán)境條件的變化而改變。對于那些能夠分泌到細胞外的次級代謝產物如真菌毒素和抗菌素等，因具有高度的種屬特異性，常被用于黑曲霉群菌種的分類和鑒定[26-27]。此外，黑曲霉群的不同種/株產生的次級代謝產物的差異也得到了全基因組測序研究的支持，即從基因組水平研究可知，黑曲霉群的不同種/株之間次級代謝產物產生能力的差異往往與基因組水平上攜帶的聚酮與非核糖體肽合成酶基因的數量和相似性密切相關[28-30]。

近年來，隨著GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS等技術飛速發(fā)展，使得通過檢測一種或幾種特定的生物標志物而輔助于黑曲霉群菌種的分類和鑒定越來越成為可能。目前，可用于黑曲霉群菌種分類和鑒定且相對易于檢測的細胞外泌物主要有neoxaline、黑麥酮酸類(secalonic acid)(包括黑麥酮酸D和F等)、環(huán)棒麥角素(cycloclavine)、狐茅麥角堿(festuclavine)、曲地酸(asterric acid)、dihydrogeodin、erdin(土曲霉素)、tensiol A和B、萘并-γ-吡喃酮類化合物(naphtho-γ-pyrones)、赭曲霉毒素(ochratoxins)(包括OTA、OTB、OTα和OTβ)、伏馬菌素(fumonisins)(包括FB2、FB4和FB6等)和funalenone等[13]。但考慮到黑曲霉群菌種產生的次級代謝產物具有種屬差異并與培養(yǎng)條件密切相關，尤其是培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基組成等，例如并非所有的黑曲霉群菌種都可以產生OTA，且黑曲霉產生OTA能力和產量與其培養(yǎng)條件密切相關，因此科學合理的實驗方案的設計是利用外泌物的特征進行黑曲霉群菌種鑒定的難點[31]。此外，有許多結構尚不清楚但能在黑曲霉群的一個或多個物種中檢測到的次級代謝產物，也可以很好的輔助用于黑曲霉群菌種的分類和鑒定。所以，總體來看，細胞外分泌物的特征是未來黑曲霉群菌種分類和鑒定過程中一個很好的補充方法。

1.3 分子生物學鑒定

已有的研究證明，黑曲霉群菌種作為難以分類和鑒定的種群，為了保證鑒定結果的可靠性，除了依靠形態(tài)學和細胞外分泌物的特征外，仍需結合限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、PCR-RFLP、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、單鏈構象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism，SSCP)、序列分析、引物特異性PCR和實時定量熒光PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)等多種分子生物學技術的鑒定結果進行綜合判斷[32-54]，具體情況見表2。

表2 分子生物學技術在黑曲霉群菌種鑒定中的應用情況Table 2 Application of molecular biology technology in identification of A. niger group

RFLP是最早用于黑曲霉群新種鑒定的分子生物學技術。KUSTERS-VAN等[32-33]采用RFLP技術探討了果膠裂合酶基因(pelA、pelB、pelD)和丙酮酸激酶基因(pki)作為DNA雜交實驗的探針用于黑曲霉群菌種快速鑒定的可行性。結果發(fā)現(xiàn)，pelD基因在黑曲霉群的所有分離株中具有保守性，不能用于黑曲霉群菌種的鑒定，pelA和pelB可用于黑曲霉和塔賓曲霉的鑒定。KUSTERS-VAN等[32]和VARGA等[34]發(fā)現(xiàn)SmaI內切酶消化rDNA后可將黑曲霉、塔賓曲霉、巴西曲霉、炭黑曲霉、日本曲霉、A.ellipticus和A.aculeatus區(qū)分開。VARGA等[34]和HAMARI等[35]發(fā)現(xiàn)用HaeIII/BgIII消化線粒體DNA可將黑曲霉和巴西曲霉與塔賓曲霉區(qū)分開，日本曲霉與A.aculeatus區(qū)分開。隨后陸續(xù)報道了PCR-RFLP用于黑曲霉群菌種鑒定的可行性，尤其是發(fā)現(xiàn)采用RsaI消化ITS基因、Hinf I消化IGS基因和RsaI消化β-微管蛋白(beta-tubulin，benA)基因時可將黑曲霉群菌種的OTA潛在產毒株與非產毒株區(qū)分開[36-39]。PERRONE等[40-42]發(fā)現(xiàn)AFLP技術可以鑒定已知的大多數黑曲霉群菌種。SUSCA等[43]采用PCR-SSCP技術鑒定了包括黑曲霉、巴西曲霉和塔賓曲霉在內的11種黑曲霉。

基于管家基因如核糖體RNA基因及其內轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)和基因內間隔區(qū)(intergenic spacer，IGS)、線粒體細胞色素b(mitochondrial cytochrome b，Cytb)、benA、鈣調蛋白(calmodulin，CaM)和細胞色素氧化酶I(cytochrome oxidase I，Cox I)建立的DNA序列分析和引物特異性PCR分析是目前黑曲霉群菌種分類和鑒定時最常用的分子生物學方法[44-53]。下面對DNA序列分析方法的可行性進行詳細討論。FRISVAD等[16]經過大量的實驗研究表明，受序列變異度的影響，ITS序列僅能將黑曲霉群菌種大致區(qū)分為4個組：(1)黑曲霉和A.lacticoffeatus；(2)巴西曲霉(A.brasiliensis)；(3)A.costaricaensis；(4)塔賓曲霉、臭曲霉、A.vadensis和A.pipers，且大多數具有單層產孢結構的菌種都具有相同的ITS序列，如日本曲霉、A.aculeatus和A.uvarum。YOKOYAMA等[45]通過對黑曲霉群12個種的32株黑曲霉的線粒體基因Cytb的402個核苷酸序列和133個氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)通過Cytb的氨基酸序列差異可以推斷日本曲霉、A.aculeatus、黑曲霉、塔賓曲霉、炭黑曲霉和A.ellipticus的系統(tǒng)發(fā)育關系，但是不能通過Cytb基因的核苷酸序列差異推斷塔賓曲霉和黑曲霉的系統(tǒng)發(fā)育關系。GEISER等[46]基于Cox I和線粒體DNA基因的核苷酸序列對8個種42株黑曲霉的系統(tǒng)發(fā)育關系分析可知，基于CoX I和線粒體DNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹均具有種內和種間變異性，不能用于黑曲霉群菌種的分類和鑒定；此外，SAMSON等[13]基于IGS序列差異分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域的核苷酸序列變異性太高，不能用于黑曲霉群菌種的鑒定。同時，基于丙酮酸激酶、果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、翻譯起始因子2、轉錄延伸因子1-α和RNA聚合酶2等基因的分子鑒定技術僅能區(qū)分2～5種黑曲霉，也不建議用于黑曲霉群菌種的分類和鑒定[44-53]。大量研究證實，已知的黑曲霉群菌種中除了黑曲霉與A.lacticoffeatus可以通過在GenBank數據庫中下載已經公布菌株的benA基因的核苷酸序列，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行初步鑒定外，其余絕大多數菌株均需要通過下載已經公布菌株的CaM核苷酸序列并構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行初步鑒定。但考慮到GenBank數據庫是一個公共、開放的數據庫可以接受上傳的所有序列，并將其用于菌種的分類鑒定或系統(tǒng)發(fā)育分析，但GenBank數據庫并不負責上傳序列真實性或正確性的判斷，因此在利用從GenBank數據庫中下載的序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建時會出現(xiàn)因序列錯誤而引起鑒定錯誤。為了去除錯誤的序列并保證鑒定結果的可靠性，建議采用基因參考序列數據庫(reference sequence database，RefSeq)中公布的序列信息進行系統(tǒng)發(fā)育樹(http://www.ncbi.nlm.gov/refseq/)的構建[7]。

ATOUI 等[47]、SUSCA等[48]和PERRONE等[49]基于管家基因的引物特異性PCR對黑曲霉群不同菌種的研究發(fā)現(xiàn)，不同管家基因的鑒定能力不同,如針對聚酮合成酶(polyketide synthase，PKS)AT結構域的特異性引物可以特異性的鑒定炭黑曲霉，而針對CaM的特異性引物可以特異性的鑒定黑曲霉和炭黑曲霉。此外，即使是對同一個管家基因，引物序列的不同也會產生不同的鑒定能力，如ITS序列。GONZALEZ-SALGADO等[50]和HAUGLAND等[51]采用ITS/NIG、ITS1/JAP、ITS1/HET和ITS1/ELL可分別特異性的擴增黑曲霉、塔賓曲霉、日本曲霉、A.heteromorphus和A.ellipticus。針對PKS序列的不同位置設計不同的引物時，僅能鑒定可產OTA的炭黑曲霉?jié)撛诋a毒株或同時鑒定產OTA的炭黑曲霉和黑曲霉的潛在產毒株[52-53]。

綜上可知，分子生物學技術是黑曲霉群菌種分類和鑒定中必不可少的重要組成部分，但每種分子生物學鑒定方法都難以實現(xiàn)系統(tǒng)、全面和準確的鑒定。目前來說，基于管家基因的序列測定是最為常用的方法，CaM和benA結合能鑒定黑曲霉群的絕大多數菌種，但ITS序列和其他管家基因的鑒定水平有限難以實現(xiàn)精準鑒定。所以，在實際的鑒定中有必要結合多種管家基因的鑒定結果進行綜合判斷。

1.4 生理特征

用于黑曲霉群菌種分類和鑒定研究的生理特征分析，主要是指菌種對不同營養(yǎng)物質如碳源、氮源、無機鹽等的利用能力差異。已有研究證實，黑曲霉、塔賓曲霉、臭曲霉、日本曲霉和A.vadensis在7種不同碳源上的生長曲線各不相同，但黑曲霉和塔賓曲霉的碳源利用情況最相似；相比于其他菌種，黑曲霉和塔賓曲霉對甘油、D-半乳糖醛酸鹽和乙酸鹽的利用能力均較差，臭曲霉和日本曲霉對木糖醇的利用能力較差，塔賓曲霉對檸檬酸的利用能力較差[54]。SAMSON等[13]對已經被鑒定的19種黑曲霉的研究發(fā)現(xiàn)，CREA作為一種半選擇性培養(yǎng)基，可以將黑曲霉群菌種區(qū)分為不同的組。對于可以產生雙層小梗的菌種如黑曲霉及其近緣種包括巴西曲霉、臭曲霉、塔賓曲霉、A.vadensis、A.sclerotioniger、A.costaricaensis、A.piperis和A.lacticoffeatus來說，其在CREA培養(yǎng)基上的生長速度適中，產酸能力較強，可在菌落周圍形成黃色的大暈環(huán)；而對A.ellipticus、A.heteromorphus和A.homomorphus來說，在CREA培養(yǎng)基上的生長速度較快，但產酸能力相對前者較弱。此外，對于可以產生單層小梗的菌種來說，CREA可以很好的將日本曲霉、A.uvarum、A.aculeatus和A.aculeatinus區(qū)分開，具體生長情況如下：A.uvarum在CREA培養(yǎng)基上生長不良、產酸能力有限，而A.aculeatus和日本曲霉在CREA培養(yǎng)基上生長良好、產酸能力中等；A.aculeatinus在CREA培養(yǎng)基上生長速度較快且產酸能力也很強。POLLASTRO等[55]開發(fā)的半選擇性培養(yǎng)基MEA-B(含10 mg/L的啶酰菌胺)可將多種黑曲霉區(qū)分開，如在MEA-B培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，只有炭黑曲霉、A.sclerotioniger、A.homomorphus和A.sclerotiicarbonarius生長狀態(tài)良好，而A.ellipticus、黑曲霉、巴西曲霉、A.vadensis、A.piperis和A.costaricaensis等均未在MEA-B培養(yǎng)基上觀察到菌落生長，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，許多菌株可恢復生長，但只有炭黑曲霉、A.sclerotioniger和A.sclerotiicarbonarius能夠產生孢子。更重要的，根據A.ibericus與炭黑曲霉在MEA-B培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)，可以將與炭黑曲霉親緣關系很近但不能產生OTA的A.ibericus與炭黑曲霉區(qū)分開。

已有研究證實，生理特征分析被成功用于2種具有重要工業(yè)利用價值且親緣關系較近的黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)的鑒定[14]。將2種菌的28株菌接種在僅含0.2%碳源的基本培養(yǎng)基上，分析了其對30種碳源包括葡萄糖、D-半乳糖、半乳糖、D-來蘇糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、乳糖、eritrit、galactit、L-纈氨酸、L-β-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-瓜氨酸、順式烏頭酸、香蘭素(vanillin)、香蘭素酸(vanillin acid)、L-抗壞血酸、D-氨基葡萄糖、雙甘氨肽、水楊苷、果膠、松三糖和α-酮戊二酸的利用情況[14]。結果發(fā)現(xiàn)，2種菌除了在分別以L-山梨糖和2-脫氧-D-葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長情況不同外，黑曲霉和泡盛曲霉具有非常相似的碳源利用情況，具體情況如下：以L-山梨糖作為唯一碳源時黑曲霉的生長速度明顯低于泡盛曲霉，以2-脫氧-D-葡萄糖作為唯一碳源時，所測定的黑曲霉菌株生長狀況良好，但有86.7%的泡盛曲霉未被觀察到生長[14]。

綜上可知，在特定的培養(yǎng)條件下，同種的黑曲霉具有相似的生理特征，但是不同種黑曲霉對營養(yǎng)物質的利用情況差異較大?；谏硖卣鞯牟町惖姆诸惡丸b定也是未來黑曲霉群菌種分類和鑒定領域的一個新的發(fā)展方向。

1.5 全基因組測序分析

截止到2019年8月，全世界范圍內已經完成全基因組測序并公布的黑曲霉群菌種有5種17株，主要包括12株黑曲霉、1株泡盛曲霉、2株塔賓曲霉、1株日本曲霉、1株炭黑曲霉。其中最早完成測序的為檸檬酸生產常用菌黑曲霉ATCC 1015，公布日期為2011年10月12日；接著為黑曲霉SH-2，公布日期為2014年4月17日，其余15株均在近3年完成的測序，且17株菌中有6株菌為我國科學家負責完成測序工作。黑曲霉的基因組大小范圍為31.85～36.45 Mb，GC含量范圍為48.8%～51.6%。

但目前對于全基因組序列測定結果與傳統(tǒng)的形態(tài)學、生理學、分子生物學技術等檢測方法的對比分析，尚缺乏足夠的數據支持，且對于許多最新報道、已經被鑒定的多種黑曲霉群菌株來說，也缺乏全基因組序列分析結果，后續(xù)研究中均有待于進一步加強全基因組序列的分析。

2 總結與展望

黑曲霉群菌種作為具有重要工業(yè)應用價值和常見的植物致病性真菌，其分類和鑒定工作一直是鑒定學中的熱點和難點問題，迫切需要結合形態(tài)學、生理特征、DNA序列特征以及細胞外分泌物的特征等進行綜合分析。此外，為了保證鑒定結果的可靠性，需要進一步加強對生理特征、細胞外泌物特征、分子生物學特征尤其是全基因組序列特征在菌種分類和鑒定工作中的應用。在此基礎上，期望通過國際合作制定出一套可以適合黑曲霉群菌種分類和鑒定以及可以描述物種特征的最低判定標準或規(guī)范。