腸道環(huán)境與糞菌移植調(diào)控腸道菌群失調(diào)影響肝纖維化轉(zhuǎn)歸

林玲，宋紅麗（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植科，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 3009）

肝移植是治療終末期肝病最有效的治療方法之一，肝纖維化是進(jìn)展為終末期肝病的必經(jīng)階段［1］，為了阻止終末期肝病的發(fā)生，防治肝纖維化意義重大。肝纖維化本質(zhì)上是慢性炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的積聚［2］，而肝實(shí)質(zhì)的血液供應(yīng)大約有75%來自門靜脈，門靜脈系統(tǒng)將腸道直接連接到肝臟，當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，細(xì)菌及其產(chǎn)物通過門靜脈系統(tǒng)到達(dá)肝臟，導(dǎo)致慢性炎癥引發(fā)肝纖維化［3］。眾多肝臟疾?。ㄈ绮《拘愿窝祝凭愿尾?，非酒精性肝病和肝硬化等）的病理變化過程被發(fā)現(xiàn)與腸道菌群有關(guān)［4］。恢復(fù)腸道菌群平衡，調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)和分泌， 協(xié)調(diào)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收， 維持腸上皮屏障的完整性， 促進(jìn)并維護(hù)免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育和活動(dòng)等，對(duì)肝纖維化的恢復(fù)治療具有重要意義［5］。通過調(diào)節(jié)腸道環(huán)境及糞菌移植來操縱腸道菌群，促進(jìn)“健康”細(xì)菌的生長(zhǎng)從而治療慢性肝病的研究目前已有部分成功投入臨床試驗(yàn)，但仍存在著部分臨床應(yīng)用和技術(shù)方面的障礙。本文主要概述了調(diào)控腸道菌群失調(diào)影響肝纖維化轉(zhuǎn)歸的研究進(jìn)展。

1 肝纖維化腸道菌群的變化

1.1 腸道菌群的構(gòu)成：通過16SrRNA 測(cè)序?qū)δc道菌群的原核門進(jìn)行培養(yǎng)鑒定發(fā)現(xiàn)主要的菌門包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門，其他占比較低的有梭桿菌門、疣微菌門、衣原體門、螺旋體門等［6］。根據(jù)菌群所在腸道部位劃分，健康十二指腸和空腸的優(yōu)勢(shì)屬是鏈球菌屬；而在健康大腸中，厚壁菌門和擬桿菌門占大多數(shù)，并且厚壁菌門和擬桿菌門的比例被證實(shí)與肥胖和代謝綜合征的易感性有關(guān)［7］。

1.2 腸道菌群的變化與肝纖維化的相關(guān)性：研究表明，腸道菌群的構(gòu)成變化與病毒性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝硬化等肝臟疾病有關(guān)。如乙肝患者腸道菌群結(jié)構(gòu)較健康人群腸道菌群多樣性降低，且腸道菌群中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌厚壁菌門和擬桿菌門中的羅氏菌屬、雙歧桿菌及類桿菌等菌屬數(shù)量顯著減少，而致病菌及條件致病菌如腸桿菌、腸球菌及酵母菌等顯著增 加［8］。丙肝患者則存在特殊腸道菌群，主要是腸桿菌、梭菌 XIV、毛螺菌和瘤胃菌［9］。Loomba 等［10］通過DNA 的全基因組測(cè)序法分析非酒精性脂肪性肝病患者糞便腸道菌群的組成成分，研究結(jié)果顯示非酒精性脂肪性肝病的腸道菌群主要是由厚壁菌門和擬桿菌門組成，其次是變形菌門和放線菌門，隨著病情的發(fā)展從輕度或中度非酒精性脂肪肝病到晚期纖維化時(shí)，變形菌門出現(xiàn)明顯的增加，而厚壁菌門出現(xiàn)減少。以上信息提示，慢性肝臟疾病根據(jù)其種類而存在明顯的菌群變化特征，必須進(jìn)行進(jìn)一步的研究鑒定菌群的成員，為更好的治療方法確定新的靶向目標(biāo)。

1.3 腸道菌群失調(diào)促進(jìn)肝纖維化發(fā)展的機(jī)制：肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵在于：肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活；ECM 的積聚；肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的激活；炎癥反應(yīng)；肝細(xì)胞的死亡。而腸道菌群失調(diào)從多方面促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展。

1.3.1 影響腸道屏障功能：腸道菌群在腸道屏障功能中扮演著促進(jìn)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和消化以及調(diào)節(jié)代謝功能的角色［11］。當(dāng)腸道菌群失調(diào)，其數(shù)量或組成發(fā)生變化時(shí)，緊密連接蛋白的表達(dá)被抑制，腸道通透性增加，易位到固有層中的病原體激活免疫反應(yīng)并和免疫細(xì)胞一起通過全身循環(huán)進(jìn)入肝臟［12］。肝臟內(nèi)的病原體識(shí)別受體被激活后，肝內(nèi)主要免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子，趨化因子和細(xì)菌產(chǎn)物激活HSC，產(chǎn)生ECM，從而導(dǎo)致纖維化和肝硬化［13］。

1.3.2 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)：當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，細(xì)菌的過度生長(zhǎng)及其內(nèi)毒素，如脂多糖、鞭毛蛋白、肽聚糖和細(xì)菌DNA 等分泌增加，并穿過腸上皮膜刺激肝臟免疫系統(tǒng)激活［14］，上調(diào)炎癥因子如腫瘤壞死因子α，白介素1β 和白介素6 的分泌，刺激肝細(xì)胞中的血小板釋放大量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β），促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成和積累，并增強(qiáng)HSC 的增殖和活化，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展［15］。

1.3.3 調(diào)控機(jī)體代謝：腸道菌群代謝產(chǎn)物包括膽汁酸、短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）、乙醇等在肝纖維化進(jìn)展的發(fā)病機(jī)制中起著重要作 用［16］。膽汁酸主要存在于腸肝循環(huán)系統(tǒng)中，它能夠通過激活法尼基衍生物 X 受體和G 蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體 5 通路，調(diào)控血管生成素1、一氧化氮合酶2 和白細(xì)胞介素18 等機(jī)制抑制腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移從而維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定性［12］。SCFA 是腸道中無法消化的碳水化合物的產(chǎn)物，包括乙酸鹽、丙酸鹽、戊酸鹽、丁酸鹽等，尤其是丁酸，通過影響緊密結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)腸腔內(nèi)和肝門系統(tǒng)之間的細(xì)胞內(nèi)分子通道從而在維持上皮屏障的完整性中起著重要作用［17］。同樣的，外源性酒精攝入經(jīng)腸道菌群代謝生成乙醛使黏附連接蛋白上的酪氨酸磷酸化，腸道通透新增加，內(nèi)毒素從腸上皮位移進(jìn)入體循環(huán)，引起進(jìn)一步肝臟損傷［18］。

2 調(diào)節(jié)腸道菌群有效治療肝纖維化

2.1 腸道環(huán)境：腸道環(huán)境因素，包括飲食、益生菌、益生菌、病毒和藥物，特別是抗生素，均可以改變腸道菌群，從而影響肝纖維化轉(zhuǎn)歸。

2.1.1 抗生素：抗生素通過減少腸道菌群組，減少腸溶炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，穩(wěn)定腸道上皮屏障，降低具有潛在毒性的膽汁酸，從而影響非酒精性脂肪性肝病和酒精性肝病的病情進(jìn)展［11］。然而，在抗生素進(jìn)行抗感染治療期間，腸道菌群中有益細(xì)菌（如雙歧桿菌、普氏桿菌、乳桿菌）減少，微生物α-多樣性降低，而潛在的致病菌（如腸桿菌科）增多，在停用抗生素后仍不能逆轉(zhuǎn)［19］。同時(shí)廣泛的抗生素暴露易導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)以及各種胃腸效應(yīng)、超敏反應(yīng)和藥物特異性不良反應(yīng)，尤其非選擇性抗生素引起共生腸道菌群群落結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細(xì)菌代謝改變和宿主蛋白質(zhì)組受損［20］。研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者在使用廣譜抗生素后，膽汁酸譜中初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸減少，且出現(xiàn)顯著的SCFA 減少，對(duì)正常腸道菌群功能造成長(zhǎng)期損害［21］。而利福昔明作為一種廣譜抗生素，和其他抗生素不同，其除具有殺菌、抑菌、降低內(nèi)毒素減少炎癥反應(yīng)和轉(zhuǎn)氨酶的作用，還被證明能促進(jìn)有益細(xì)菌的增加［22］。因此利福昔明也被定義為“優(yōu)生菌”，及“腸道菌群正向調(diào)節(jié)劑”［19］。

2.1.2 小檗堿：小檗堿是從黃連中提取的天然生物堿，而黃連則常用于治療炎性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠抑制促纖維化因子的表達(dá)，激活A(yù)MP 依賴的蛋白激酶〔adenosine 5'-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK〕信號(hào)傳導(dǎo)通路，而AMPK 信號(hào)傳導(dǎo)的激活可以抑制肝星狀細(xì)胞增殖和膠原蛋白的表達(dá)［23］。脂多糖作為腸道細(xì)菌的產(chǎn)物通過門靜脈進(jìn)入肝臟， 被肝巨噬細(xì)胞上的Toll 樣受體4 （toll-likereceptor，TLR4） 識(shí)別， 活化信號(hào)通路引發(fā)炎癥和胰島素抵抗［24］。張園園等［25］研究通過比對(duì)高脂飲食組和治療組（高脂飲食的同時(shí)每天予 200 mg/kg 黃連素灌胃），發(fā)現(xiàn)黃連素灌胃能明顯降低脂多糖和白介素6 水平，進(jìn)一步研究推測(cè)黃連素可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群、減少脂多糖生成而抑制肝巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放， 進(jìn)而減輕肝臟炎癥反應(yīng)。

2.1.3 益生菌、益生元和合生元：益生菌是人類來源的活細(xì)菌或酵母菌，它能夠與腸桿菌科細(xì)菌之間競(jìng)爭(zhēng)抑制，穩(wěn)定腸道通透性，減少菌群易位；誘導(dǎo)厭氧菌和革蘭氏陽性菌生長(zhǎng)，限制革蘭氏陰性菌，減少脂多糖從而降低內(nèi)毒素水平；減少腸道氨的吸收，加強(qiáng)氨的排出，改善預(yù)后［26］。其中乳桿菌，雙歧桿菌和鏈球菌最常被使用來抑制革蘭陰性菌群，例如乳桿菌，具有抑制非酒精性脂肪型肝炎的發(fā)展，改善胰島素和葡萄糖耐量，預(yù)防果糖引起的非酒精性脂肪性肝病發(fā)作等作用，從而進(jìn)行有效的靶向 治療［27］。

益生元選擇性發(fā)酵并調(diào)節(jié)菌群成分，通常是不可消化的植物低聚糖，例如低聚果糖，低聚半乳糖，乳果糖和菊粉，它們可作為有益細(xì)菌的食物并促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌等的繁殖［28］。益生元通過抑制脂肪酶（如乙酰輔酶A 羧化酶，脂肪酸合酶，蘋果酸酶）從而降低肝臟脂肪、膽固醇的生成［29］。同時(shí)腸道菌群對(duì)益生元的發(fā)酵會(huì)增加盲腸和門靜脈血中SCFA 的含量，丙酸酯濃度的增加作用于脂肪形成相關(guān)限速酶的轉(zhuǎn)錄來抑制脂肪形成［30］。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)通過將益生菌長(zhǎng)雙歧桿菌與益生元低聚果糖處理共生后應(yīng)用于非酒精性脂肪性肝病患者后發(fā)現(xiàn)低聚果糖可能是長(zhǎng)雙歧桿菌在腸道中生長(zhǎng)的潛在促進(jìn)劑［31］。 合生元是含有益生菌和益生元的產(chǎn)品，或再加入維生素和微量元素等，從而最大化益生菌和益生元的作用。張揚(yáng)等［32］的研究，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用合生元后，腸道黏膜TLR4 的表達(dá)下調(diào)，促炎性細(xì)胞因子分泌下調(diào)，血清學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)改善。

總之，益生菌、益生元和合生元能減少腸道炎癥，改善肝功能和疾病預(yù)后，且副作用 有限，是治療肝臟疾病的有前途的選擇［33］。

2.2 移植方案

2.2.1 糞菌移植：糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT），是通過將健康捐贈(zèng)者的糞便放入患者的胃腸道中，直接改變受者腸道菌群組成使其正?；_(dá)到治療效果的“特殊移植”方法［34］。目前，F(xiàn)MT 技術(shù)已經(jīng)能夠有效地治療復(fù)發(fā)和難治性艱難梭菌感染、炎癥性腸病、便秘等胃腸道疾病［35］。而Kang 等［36］的研究提出了FMT 能夠控制乙型肝炎患者病情進(jìn)展的新概念。連續(xù)的FMT 可作為治療乙型肝炎相關(guān)慢性肝病的新型模式，且相較于單一的益生菌，它不僅能夠恢復(fù)由抗生素引起的肝硬化中微生物群組成和功能的破壞［21］，而且安全性高，常見不良事件諸如腹部不適、腹瀉、便秘和低燒，嚴(yán)重副作用極為罕見且往往與內(nèi)鏡檢查和鎮(zhèn)靜有關(guān)，但是該技術(shù)目前仍存在變量以及保存方面的問題［37］。除卻胃腸系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)FMT 還具有移植到外陰、鼻竇、泌尿道、皮膚的潛在能力，未來的研究應(yīng)集中在微生物在不同器官中的特定使用，即選擇性微生物群移植策略［38］。

2.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞移植 ：間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是具有多重分化和自我更新能力的異質(zhì)性基質(zhì)干細(xì)胞亞群，已被證明能夠分化為一系列細(xì)胞譜系，例如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞，因此被用于研究治療肝臟疾 ?。?9］。通過移植MSCs 誘導(dǎo)肝細(xì)胞樣細(xì)胞促進(jìn)肝臟再生，表達(dá)可溶性因子調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞減少肝損傷，分泌營(yíng)養(yǎng)因子如生長(zhǎng)因子、趨化因子，減少活化肝星狀細(xì)胞增殖和膠原合成，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑的表達(dá)促進(jìn)肝纖維化的消退，減少體外硫代乙酰胺或四氯化碳誘導(dǎo)的活性氧化物質(zhì)損傷來保護(hù)肝細(xì)胞［40］。而個(gè)體之間肝再生的方法可能并不相同，最佳的MSCs 治療必須針對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化［41］。腸道菌群的改變是否可作為MSCs 治療個(gè)體化的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍在研究中。

3 調(diào)節(jié)腸道菌群治療肝纖維化的進(jìn)展與展望

肝纖維化是肝臟長(zhǎng)期損傷、修復(fù)過程中肝臟結(jié)締組織異常增生產(chǎn)生的病理現(xiàn)象。若患者長(zhǎng)期存在肝損傷未得到有效治療，病情逐漸進(jìn)展為肝硬化、甚至進(jìn)一步發(fā)展為肝功能衰竭或肝癌，不得不進(jìn)行肝移植手術(shù)后仍需要面對(duì)術(shù)后并發(fā)癥、免疫抑制劑長(zhǎng)期應(yīng)用帶來的副作用等問題。

本文總結(jié)了腸道菌群在慢性肝病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中的作用，將病毒性肝炎，酒精性肝病，非酒精性肝病等慢性肝病與腸道菌群失調(diào)聯(lián)系起來。并介紹了通過使用抗生素、小檗堿、益生菌、益生元、合生元和FMT 調(diào)節(jié)腸道菌群，對(duì)改善慢性肝臟疾病，抗肝纖維化進(jìn)展，避免終末期肝病進(jìn)行肝移植手術(shù)的臨床價(jià)值。其中MSCs 作為阻滯和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新治療靶點(diǎn)，仍存在纖維化潛力以及促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和致癌性等問題，需要在臨床大樣本的隨機(jī)、對(duì)照試驗(yàn)中評(píng)估腸道菌群改變對(duì)MSCs 治療肝纖維化的意義。