血橙花色苷研究進(jìn)展

胥 萍，林小靖，付紅偉

(1.浙江大學(xué)自貢創(chuàng)新中心，四川 自貢 643000；2.浙江大學(xué)華南工業(yè)研究院，廣東 廣州 510000，3.浙江大學(xué)，浙江 杭州 310000)

血橙(Citrussinensis)屬蕓香科甜橙類, 因果肉具紅色血絲或血斑而得名。我國(guó)引入的血橙品種有路比(Ruby)、塔羅科(Tarocco)、馬耳(Maltaise)、 桑吉耐洛(Sanguinello)、摩洛(Moro)、臍血橙等。其中路比血橙和塔羅科血橙是主要栽培品種，被譽(yù)為“血橙之王”，主要分布在四川、廣東、廣西和湖南等地[1]。

血橙具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，尤其是豐富的維生素C、花青素、抗壞血酸、黃酮類化合物和羥基肉桂酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Ni 等人體必需元素[2]。血橙果肉的紅色是花青素與糖結(jié)合形成的苷類化合物所致，是柑橘中唯一含有花青素的品種?；ㄉ蘸渴茄裙麑?shí)的重要質(zhì)量指標(biāo)，對(duì)人體健康有重要意義，具有抗氧化、抗癌、降低膽固醇、降血壓、增加骨密度、減肥、降血脂和防止心血管疾病等功效[3-5]?；ㄉ盏姆e累開始于裂片邊緣的囊泡和血橙果實(shí)的花端，其濃度與栽培實(shí)踐、成熟階段、遺傳、季節(jié)與氣候條件、收獲時(shí)間和生理因素密切相關(guān)。低溫會(huì)增加血橙中花色苷的積累，而高溫會(huì)破壞花色苷。采收后的血橙可以在氧化應(yīng)激條件下刺激花色苷的合成，可提高花色苷的含量[6]。

1 血橙花色苷種類的研究

花色苷是由其配基花青素與糖以糖苷鍵形式結(jié)合而成的一類化合物，其苷元(花青素)是基于黃酮離子結(jié)構(gòu)，使花色苷具有強(qiáng)抗氧化劑和清除自由基的作用。同時(shí)，黃酮離子的發(fā)色團(tuán)特性使花青素成為最常見的天然色素。羥基的數(shù)量，糖的性質(zhì)和數(shù)量，以及這些取代基的位置決定了花色苷個(gè)體之間的差異[7]。Mondello等采用高效液相色譜/紫外-可見光分光光度計(jì)法(HPLC/UV-Vis)從血橙汁中共分離出27種花色苷峰，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3(6”-丙二酰)-β-葡萄糖苷為主要成分，但并未對(duì)其他峰進(jìn)行定性研究[8]。Lee采用高效液相色譜-二極管陣列法(HPLC-DAD)從巴德血橙中共檢測(cè)出了7種花色苷，其中矢車菊素-3(6”-丙二酰)-β-葡萄糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷含量分別占到了44.8%和33.6%[9]。DUGO等采用微量高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜法(Micro-HPLC-ESI/MS)從西西里血橙中共檢測(cè)出了8種花色苷，其中芍藥素- 3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香苷、3’ -甲花翠素-3(6”- 丙二酰)葡萄糖苷首次在血橙中被發(fā)現(xiàn)[10]。Winterhalter等采用高速逆流色譜和制備高效液相色譜法從血橙中分離制備花色苷，并采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC- ESI-MS/MS)和核磁共振法(NMR)法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，除了以上2種主要成分外，還鑒定出了6種其它花色苷，分別為矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-槐糖苷、飛燕草素-3(6”-丙二酰)葡萄糖苷、甲基花青素-3(6” -丙二酰)葡萄糖苷、矢車菊素-3-(6” -二乙二酰)葡萄糖苷，其中矢車菊素-3-(6” -二乙二酰)葡萄糖苷是在血橙中首次被發(fā)現(xiàn)[11]。曹少謙等采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(HPLC- ESI-MS)法首次從血橙花色苷中檢測(cè)出了矢車菊素-3-葡萄糖苷的加合物4-乙基鄰苯二酚[12]。

2 血橙花色苷的提取與純化

提取花色苷是從植物中測(cè)定總花色苷或者單個(gè)花色苷的首要步驟，因此提取方法的選擇對(duì)后續(xù)分析花色苷非常重要。在大多數(shù)水果和蔬菜中，花色苷位于表皮細(xì)胞附近[13]。提取過程通常涉及使用酸性溶劑，酸性溶劑可以使細(xì)胞膜變性，同時(shí)溶解花色苷。酸性溶劑可以穩(wěn)定花色苷，但也可能通過破壞花色苷與金屬離子或者其他色素的聯(lián)系來(lái)改變組織中花色苷的天然形態(tài)，在濃縮過程中也可能產(chǎn)生?；吞腔乃崴鈁14]。含鹽酸的溶劑在萃取濃縮過程中會(huì)導(dǎo)致花色苷降解[14]。為了盡量減少花色苷的分解，使用較弱的有機(jī)酸(如甲酸、乙酸、檸檬酸或酒石酸)或少量(0.5%到3%)的揮發(fā)性酸(如三氟乙酸)，在色素濃縮過程中可以去除。在酸存在的情況下進(jìn)行的程序需要小心操作，以避免酸依賴的花色苷降解[14-15]。同時(shí)根據(jù)提取方法的不同，降低提取溶劑與植物原料的比例，可以減少濃縮步驟[14]。

用于提取的溶劑體系不是提取花色苷所特有的，在提取過程中還會(huì)提取相當(dāng)多的其他化合物，花色苷的定性和定量分析會(huì)因?yàn)檫@些可能干擾測(cè)量的化合物如糖類、蛋白質(zhì)和纖維素等的存在而變得復(fù)雜，因此需要純化含花色苷的粗提物，從而提高花色苷的純度來(lái)擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。在純化過程中不同的樹脂被用于純化花色苷，包括離子交換樹脂、聚酰胺樹脂和凝膠等經(jīng)過純化后濃度可以提高10～20倍[16]。其中凝膠Sephadex LH-20柱層析可用于粗提物純化，也可以用于分離單個(gè)花青素。Manley和Shubiak在1975年首次將HPLC應(yīng)用于單個(gè)花色苷分離[17]，HPLC方法目前廣泛的應(yīng)用于總花色苷和單個(gè)花色苷的分離純化中[18]。

曹少謙等[9]將血橙去皮，榨汁離心后取上清液，采用柱色譜法對(duì)血橙花色苷制備方法進(jìn)行了優(yōu)化，探索了12種樹脂對(duì)血橙花色苷的吸附和解析能力，最終發(fā)現(xiàn)NKA-9 大孔樹脂的吸附和解析效果最好，且洗脫劑為50%的檸檬酸乙醇溶液(pH值=2.5)。

3 花色苷的穩(wěn)定性及其提高技術(shù)

由于花色苷容易發(fā)生反應(yīng)，很容易降解并形成無(wú)色棕色化合物，因此影響花青素穩(wěn)定性的因素很多，包括溫度、pH、氧氣、酶、復(fù)合物和金屬離子的存在、抗壞血酸、二氧化硫、糖及其降解產(chǎn)物等[19]。一般而言，降低花色苷溶液的pH值至2.8可以促進(jìn)結(jié)構(gòu)向黃烷陽(yáng)離子的轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)穩(wěn)定性；改變pH會(huì)影響其性質(zhì)，如果pH低于3，一些多糖不能很好地保護(hù)花色苷，從而引起降解。pH高于3，容易引起聚合物如變性蛋白。花色苷在溶液介質(zhì)中有4種結(jié)構(gòu)的變換，在一定條件下花色苷的4種結(jié)構(gòu)之間存在著平衡：藍(lán)色的醌式(脫水)堿(A)、紅色的黃烊鹽正離子(AH+)、無(wú)色的假堿(B)和查爾酮(C)。加入其他化合物如酚類化合物，能夠適當(dāng)延長(zhǎng)花青素的穩(wěn)定性；鐵等金屬離子的加入也是一種增加花青素穩(wěn)定性的可行方法。在長(zhǎng)期冷藏期間花色苷會(huì)發(fā)生變化，花色苷的合成在收獲后繼續(xù)進(jìn)行，其在血橙中的濃度在冷藏期間增加[2,20]。血橙花色苷 pH4.0時(shí)對(duì)熱最為敏感。另外，血橙花色苷對(duì)熱、光都很不穩(wěn)定。金屬離子都表現(xiàn)出對(duì)花色苷熱降解的保護(hù)作用，Al3+對(duì)血橙花色苷有明顯的增效作用，且隨著濃度增加增色作用越強(qiáng)；Cu2+低濃度下，對(duì)花色苷熱降解有一定保護(hù)作用，但是高濃度下有明顯的促進(jìn)花色苷降解的作用。喻最新等[21]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過草酸處理可以明顯提高在儲(chǔ)藏過程中的花色苷含量。

花色苷穩(wěn)定化常用的方法有：添加大分子物質(zhì)、小分子輔色、金屬離子螯合和微膠囊化等。其中大分子物質(zhì)常添加的為多糖類(蛋白質(zhì)、果膠、瓜爾豆膠)、蛋白質(zhì)(乳蛋白、酵母甘露糖蛋白等)；小分子輔色物質(zhì)常見的為多酚和黃酮類、肽和氨基酸類、有機(jī)酸類；金屬離子螯合劑常見的為Fe3+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Al3+等[22]。微膠囊化是一種用天然或合成高分子材料將固體、液體或氣體等物質(zhì)包埋形成微小粒子的技術(shù)，使被包埋物質(zhì)與外界環(huán)境隔離，有效保護(hù)其原有活性，增加其貯存穩(wěn)定性的過程，在花色苷穩(wěn)定技術(shù)中比較常用[22]。微膠囊技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于微膠囊壁材和制備方法的探究，這決定了微膠囊化包埋的效果以及釋放特性，其中常用的壁材為高分子材料，如殼聚糖、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠、麥芽糊精、蛋白質(zhì)和卵磷脂等[23-24]。微膠囊的制備方法可分為化學(xué)法、物理化學(xué)法和物理法，常用的為物理法，包括空氣懸浮包衣法、噴霧干燥法、擠壓法、超分子包合物形成法、空氣蒸發(fā)沉積法、靜電結(jié)合法等[25]。其中，噴霧干燥法是乳化液被霧化成微細(xì)液滴分散在高溫?zé)釟饬髦忻撍稍铮⒓?xì)液滴水分迅速蒸發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)成膜和干燥，采用該法制成的微膠囊顆粒均一、可溶性好、熱穩(wěn)定性高、適用性廣，且成本低廉、工藝簡(jiǎn)單、易于產(chǎn)業(yè)化，在微膠囊產(chǎn)品制備中最常用，據(jù)報(bào)道有80%～90%的微膠囊都是采用噴霧干燥法制備[26]。目前，已有研究者將黑枸杞、石榴、藍(lán)冠果花色苷以及紫蘇油、沙棘果油等通過噴霧干燥法制備微膠囊的報(bào)道[27-31]。

4 花色苷的生理活性

花色苷具有多種生理活性，如減少氧化，抗應(yīng)激和預(yù)防冠心病，還能抗菌、消炎和抗癌活動(dòng)，控制肥胖和糖尿病或改善視力等[32-35]。通過攝入花色苷，以人群為基礎(chǔ)的調(diào)查顯示，花色苷與心血管疾病、糖尿病和癌癥發(fā)病率的降低有關(guān)[36]。同時(shí)研究顯示，不同健康狀況的志愿者攝入富含花色苷的水果后，臨床和生物醫(yī)學(xué)指標(biāo)均有所改善[36]?；ㄉ盏纳飳W(xué)效應(yīng)已經(jīng)被經(jīng)典地與它們的抗氧化能力聯(lián)系起來(lái)，盡管在生理水平上涉及的實(shí)際機(jī)制還有待建立[37]。一些體外研究、動(dòng)物模型和人體試驗(yàn)的研究表明，植物中的花色苷能夠?qū)M織產(chǎn)生活性氧(ROS)介導(dǎo)的損傷起保護(hù)作用[38-39]。Kelebek等[40]采用 DPPH·法評(píng)價(jià)抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)摩洛血橙抗氧化能力比桑吉耐洛血橙強(qiáng)。Titta等[41]研究發(fā)現(xiàn)血橙花色苷可以抑制大鼠體內(nèi)的脂肪堆積和體重增加。