2株圣喬治教堂諾卡菌的鑒定與藥物敏感性分析*

顧全，柳朔怡，韓素桂，張尊，孫尚凡，張玉敏(1.唐山市人民醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.核醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，c.輸血科，河北唐山 06000；.唐山市婦幼保健院產(chǎn)前診斷遺傳病診斷中心，河北唐山 06000；.唐山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北唐山 06000)

諾卡菌屬是一類(lèi)嚴(yán)格需氧菌，革蘭染色呈陽(yáng)性或不定，有弱抗酸性。其分類(lèi)隸屬于放線(xiàn)菌綱、放線(xiàn)菌目、棒桿菌亞目、諾卡菌科，目前已知該屬有效命名菌種有111個(gè)，常見(jiàn)致病菌種有膿腫諾卡菌(N.abscessus)、皮疽諾卡菌(N.farcinica)、巴西諾卡菌(N.brasiliensis)等。圣喬治教堂諾卡菌(N.Cyriacigeorgica)是2001年命名的諾卡菌種，但非新發(fā)致病菌[1]。在確定獨(dú)立分類(lèi)位置之前多被鑒定為“星形諾卡菌(N.asteroides)”藥物Ⅵ型。2005年Conville等通過(guò)16S rRNA基因、hsp65基因和DNA-DNA雜交等分類(lèi)證據(jù)證實(shí)星形諾卡菌藥物Ⅵ型應(yīng)鑒定為圣喬治教堂諾卡菌[2]。目前圣喬治教堂諾卡菌是日本、泰國(guó)和我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)諾卡菌病的主要致病菌種[3]，并在近年來(lái)我國(guó)大陸地區(qū)報(bào)告比率逐漸上升，部分地區(qū)可達(dá)46%[4]。按《臨床微生物手冊(cè)》(第11版)報(bào)道，圣喬治教堂諾卡菌可能是常見(jiàn)的人類(lèi)諾卡菌病原體，之前報(bào)道的星形諾卡菌大部分是該種[5]。隨著分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，過(guò)去鑒定為“星形諾卡菌”或“星形諾卡菌復(fù)合群”菌株多被證實(shí)為其他已命名菌種，嚴(yán)格意義的星形諾卡菌已少有致病報(bào)道[5]。本研究對(duì)2株諾卡菌臨床分離株進(jìn)行表型與基因鑒定，并對(duì)臨床常用抗菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，為臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源與初步鑒定 收集2019年唐山市人民醫(yī)院臨床分離諾卡菌菌株2株。其中A30分離自呼吸科患者支氣管灌洗液標(biāo)本，A151分離自婦科患者痰標(biāo)本。經(jīng)革蘭染色和弱抗酸染色鏡下觀察形態(tài)，初步鑒定至諾卡菌屬。

1.2主要儀器及試劑 SLAN基因擴(kuò)增儀(上海宏石公司)，ABI 3730型DNA測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)；2×Taq PCR Mix擴(kuò)增體系(上海生工公司)，血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力平板、麥康凱平板(鄭州安圖公司)，藥敏紙片與E-test藥敏試條(溫州康泰公司)，快速革蘭染色液、快速抗酸染色液(珠海貝索公司)，引物合成與擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由上海生工公司完成。

1.3形態(tài)學(xué)鑒定 菌株分別接種血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，置35 ℃培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落形態(tài)。革蘭染色按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；弱抗酸染色參考快速抗酸染色試劑說(shuō)明書(shū)略作改動(dòng)：石炭酸復(fù)紅溶液染色15 min，0.2 mol/L硫酸溶液脫色3 min，亞甲基藍(lán)溶液染色1 min。

1.4基因擴(kuò)增、測(cè)序與鑒定 用水煮裂解法提取DNA[6]。參照文獻(xiàn)[7-8]合成原核生物16S rRNA基因通用引物8F、1492R和hsp65基因引物，并參照文獻(xiàn)反應(yīng)條件進(jìn)行。引物與擴(kuò)增信息見(jiàn)表1。用2×Taq PCR Mix預(yù)混液配制體系。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，交由上海生工公司進(jìn)行產(chǎn)物純化并在ABI 3730型DNA測(cè)序儀上行Sanger雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果截去引物結(jié)合區(qū)并選取QV值>25的片段，以Blast比對(duì)搜索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。以MEGA 5.0軟件構(gòu)建16S rRNA基因與hsp65基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，用鄰接法與Kimura兩參數(shù)模型，進(jìn)化樹(shù)拓?fù)渲σ訠ootstrap法自舉檢驗(yàn)1 000次。龜分枝桿菌作為系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)外枝。

表1 基因擴(kuò)增所用引物信息

1.5藥敏分析 用E-test方法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)[9]，測(cè)試藥物包括阿米卡星、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、亞胺培南、利奈唑胺、米諾環(huán)素、妥布霉素、頭孢吡肟、慶大霉素。35 ℃培養(yǎng)48 h后讀取MIC值，若生長(zhǎng)不足，培養(yǎng)時(shí)間延至72 h。參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M24-A2標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果[10]。用E-test法、微量肉湯稀釋法和紙片擴(kuò)散法對(duì)甲氧嘧啶/磺胺甲噁唑藥敏結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，35 ℃培養(yǎng)48 h，若生長(zhǎng)不足延至72 h。復(fù)方磺胺甲噁唑MIC值≤2 μg/mL/38 μg/mL為敏感，≥4 μg/mL/76 μg/mL為耐藥。紙片擴(kuò)散法中，抑菌圈直徑≥35 mm判為敏感，≤15 mm判為耐藥。微量肉湯稀釋法中，菌體生長(zhǎng)量80%被抑制判為終點(diǎn)孔。

2 結(jié)果

2.1菌株形態(tài)學(xué)鑒定 圣喬治教堂諾卡菌可在血平板、巧克力平板上緩慢生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)小的顆粒樣菌落，培養(yǎng)72 h后呈淡黃色、干燥、堆積樣菌落，有泥土氣味，麥康凱平板未見(jiàn)生長(zhǎng)。革蘭染色陽(yáng)性，菌體可部分脫色呈串珠狀。有弱抗酸性，可抵抗0.2 mol/L硫酸溶液脫色，臨床標(biāo)本中菌體呈分枝狀,可相互纏繞，見(jiàn)圖1。

注：A，圣喬治教堂諾卡菌血平板培養(yǎng)72 h生長(zhǎng)菌落；B，痰標(biāo)本中圣喬治教堂諾卡菌弱抗酸染色形態(tài)(×1 000)；C，圣喬治教堂諾卡菌血瓊脂平板培養(yǎng)72 h革蘭染色形態(tài)(×1 000)。

2.2基因鑒定與進(jìn)化分析 A30和A151 16S rRNA基因與圣喬治教堂諾卡菌(N.cyriacigeorgica，登錄號(hào)：NR041857.1)相似度分別為99.92%和100%，與少食諾卡菌(N.paucivorans，登錄號(hào)：NR041863.1)相似度為98.83%和98.59%，與星形諾卡菌(N.asteroides，登錄號(hào)：NR041856.1)相似度為98.46%和95.53%。2株臨床分離株可鑒定為圣喬治教堂諾卡菌，測(cè)序生物信息學(xué)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。經(jīng)2次雙向測(cè)序，發(fā)現(xiàn)A30菌種在16S rRNA基因48位為簡(jiǎn)并堿基R(A/G)，可能是該菌存在多拷貝的16S rRNA基因，見(jiàn)圖2。A30和A151hsp65基因與圣喬治教堂諾卡菌(N.cyriacigeorgica，登錄號(hào)：AY756522.1)相似度均為100%，與其他諾卡菌種相似度低于98.6%。16S rRNA基因與hsp65基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，A30與A151均與圣喬治教堂諾卡菌DDSM 44484在同一拓?fù)浞种?，與其他諾卡菌種有較大進(jìn)化距離。見(jiàn)圖3、圖4。

表2 2株諾卡菌測(cè)序生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)

圖2 圣喬治教堂諾卡菌A30菌株16S rRNA基因多拷貝位點(diǎn)

注：以龜分枝桿菌(M. chelonae)AY457072.1為根。

注：以龜分枝桿菌(M. chelonae)JX154110.1為根。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果 2株圣喬治教堂諾卡菌對(duì)阿米卡星、頭孢曲松、亞胺培南、利奈唑胺、米諾環(huán)素、妥布霉素、頭孢吡肟、復(fù)方磺胺甲噁唑均敏感，對(duì)環(huán)丙沙星耐藥。紙片擴(kuò)散法顯示，A30和A151菌株復(fù)方磺胺甲噁唑抑菌圈直徑分為38 mm和19 mm。E-test法和微量肉湯稀釋法確定復(fù)方磺胺甲噁唑MIC值分別為0.125 μg/mL/2.375 μg/mL和0.5 μg/mL/9.5 μg/mL。見(jiàn)表3。

表3 2株圣喬治教堂諾卡菌抗菌藥物敏感性結(jié)果

3 討論

圣喬治教堂諾卡菌的中文翻譯尚有分歧，部分學(xué)者引用“蓋爾森基興諾卡菌”翻譯。2019年國(guó)際系統(tǒng)與進(jìn)化微生物學(xué)期刊《International Journal of Systematics of Evolutionary Microbiology》更新了《國(guó)際原核生物分類(lèi)命名法》，原核生物命名有明確的詞源，中文翻譯可參考詞源?！癱yriacigeorgica”由2個(gè)詞根組成：“cyriacum”新拉丁語(yǔ)中性名詞，來(lái)源于希臘語(yǔ)中性名詞“kuriakon”，意為教堂；“georgica”新拉丁語(yǔ)陰性名詞，意為“圣喬治”，“cyriacigeorgica”詞源意為圣喬治教堂[11]。諾卡菌鏡下形態(tài)呈分枝狀，弱抗酸性，屬內(nèi)鑒定較復(fù)雜，需結(jié)合碳源利用試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化、脲酶、藥物敏感性等綜合進(jìn)行[12]。16S rRNA基因和hsp65基因是目前較為常用的諾卡菌種基因鑒定靶位。諾卡菌的16S rRNA相似度較高，部分諾卡菌菌種16S rRNA基因存在多拷貝[13]，若需準(zhǔn)確鑒定至種，相似度需大于99.8%。如本研究的A30菌株16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示在48位出現(xiàn)簡(jiǎn)并堿基R(A/G)，多拷貝基因會(huì)影響比對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性。圣喬治教堂諾卡菌為新命名菌種，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的早期序列中，有將圣喬治教堂諾卡菌錯(cuò)誤標(biāo)記為星形諾卡菌，會(huì)影響鑒定結(jié)果。采用其他管家基因或構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可增加鑒定的可信度。如hsp65基因，相似度大于99.5%，可提供準(zhǔn)確的鑒定依據(jù)[8]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)為諾卡菌快速鑒定提供了新的方法。通過(guò)提取蛋白質(zhì)法或菌液直接涂布法，均能準(zhǔn)確鑒定圣喬治教堂諾卡菌。但大部分諾卡菌種培養(yǎng)物不易乳化或存在噬瓊脂現(xiàn)象，這會(huì)增加菌懸液制備難度而影響鑒定準(zhǔn)確率，若選取早期培養(yǎng)菌落(菌齡小于48 h)，可提升質(zhì)譜鑒定率[5]。

諾卡菌感染的首選用藥為復(fù)方磺胺甲噁唑，必要時(shí)可配伍亞胺培南。近年來(lái)不斷出現(xiàn)諾卡菌耐藥現(xiàn)象，特別是磺胺類(lèi)藥物的耐藥。此外，CLSI推薦的微量肉湯稀釋法在多中心重復(fù)性研究中，重復(fù)性較低[14]，可能與該藥物MIC終點(diǎn)值判斷困難有關(guān)。通常終點(diǎn)值對(duì)應(yīng)該孔80%菌量被抑制，但在實(shí)際操作中，由于諾卡菌浮于藥敏孔表面不易判斷抑菌量，或判讀人員經(jīng)驗(yàn)不足，極易出現(xiàn)誤差。微量肉湯稀釋法配合紙片擴(kuò)散法與E-test法，藥敏結(jié)果可相互驗(yàn)證，可避免誤差[15]。本研究中A151菌株復(fù)方磺胺甲噁唑紙片擴(kuò)散法抑菌圈直徑為19 mm，無(wú)法判斷敏感性，配合微量肉湯稀釋法與E-test法，可以確定其MIC值為1 μg/mL/38 μg/mL，依據(jù)CLSI M24-A2的折點(diǎn)范圍可判斷為敏感。依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)方磺胺甲噁唑的藥敏試驗(yàn)使用的磺胺甲噁唑/甲氧芐啶復(fù)方配比為19∶1，而臨床使用的復(fù)方磺胺甲噁唑磺胺甲噁唑/甲氧芐啶配比為5∶1。藥敏試驗(yàn)復(fù)方配比與臨床復(fù)方制劑配比不同，可能導(dǎo)致體外藥敏結(jié)果無(wú)法有效預(yù)測(cè)感染治療效果?；前奉?lèi)藥物為濃度依賴(lài)型，需要足夠的濃度與對(duì)氨苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合二氫葉酸合成酶，臨床用藥參考藥敏標(biāo)準(zhǔn)時(shí)需要酌情考慮使用量。