三葉青多糖對人肝癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用及機(jī)理研究

戴慶福 林玉梅 王玉霞 高珊珊 曹慧敏 陳開紅

肝癌是人體常見的惡性腫瘤之一，位列消化道腫瘤死亡第一位。常規(guī)治療以手術(shù)和放化療為主，但不可避免的骨髓抑制、免疫力低下、胃腸道反應(yīng)等毒副作用使得治療難度加大。肝作為人體解毒器官，通過減少藥物攝入量和降低藥物的活性等方式來提升抗藥性的研究，使得中醫(yī)藥治療領(lǐng)域中，抗腫瘤藥物為患者疾病治療提供了新的路徑[1]。三葉青即金線吊葫蘆，最初用于治療高熱、肝炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及病毒性腦膜炎等疾病，后在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，被納入抗腫瘤常用藥物中并取得了一定的成效。究其原因在于三葉青總氨基酸、多糖的含量之于肝癌細(xì)胞HepG2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的效果上[2]。本研究為三葉青多糖對人肝癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用及機(jī)理，特選取2019 年4 月—2020 年3 月以來我院收治76 例肝癌患者的臨床資料為樣本勘驗(yàn)對象，現(xiàn)就具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)分析如下。

1 基本資料和方法

1.1 基本資料

應(yīng)用醫(yī)學(xué)研究勘驗(yàn)對比法，選取2019 年4 月—2020 年3 月以來我院收治76 例肝癌患者的臨床資料，按照介入治療環(huán)節(jié)是否應(yīng)用三葉青多糖，等分為對照組（未施用組，CTX 環(huán)磷酰胺）和試驗(yàn)組。其中對照組男21 歲，女17 歲，年齡在43～67 歲，平均年齡（55.01±0.11）歲, Zung 抑郁自評量表（SDS）測試患者抑郁情況，6 例中重度抑郁患者；治療時(shí)間1～3 個(gè)月。試驗(yàn)組男20 歲，女18歲，年齡在44～66 歲，平均年齡（55.11±0.01）歲；Zung 抑郁自評量表（SDS）測試7 例中重度抑郁；治療時(shí)間1～3 個(gè)月。兩組患者臨床資料在年齡、抑郁情況、基本家庭背景（中等收入，月人均工資3 000～4 000 元）、治療時(shí)間（1～3 個(gè)月）上差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)對比意義（P＞0.05）。

1.2 方法

臨床實(shí)驗(yàn)和對比兩組細(xì)胞凋亡有效率、Bcl-2、Bax 和Survivin蛋白表達(dá)結(jié)果及其PXR 受體調(diào)控的CYP3A 誘導(dǎo)作用結(jié)果。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡率。具體步驟為：收集細(xì)胞[數(shù)目約（1～ 5）×106個(gè)/mL]，500～ 1 000 r/min 離心5 min，棄去培養(yǎng)液；細(xì)胞洗滌，3 mL PBS 洗滌1 次；乙醇固定；離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70% 的乙醇固定，4℃，1～2 h；細(xì)胞重懸，離心棄去固定液，3 mL PBS 重懸5 min；細(xì)胞過濾400 目的篩網(wǎng)過濾1次，500～1 000 r/min 離心5 min，棄去PBS；染色；用1 mL PI 染液染色，4℃避光30 min；流式細(xì)胞儀檢測；PI 用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488 nm，發(fā)射光波波長大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI 熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對側(cè)散射光的散點(diǎn)圖；結(jié)果判斷。免疫化學(xué)法檢測Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白。石蠟切片脫蠟至水；3%H202室溫孵育5 ～10 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS 浸泡5 min，（如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）；5%～10%正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1 ～2 h 或4℃過夜；PBS沖洗，5 min×3 次；滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA － PBS 稀釋），37℃孵育10 ～30 min；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10 ～30 min；PBS 沖洗，5 min×3 次；滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10 ～30 min；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10 ～30 min；PBS 沖洗，5 min×3次；顯色劑顯色（DAB 或AEC）；自來水充分沖洗，復(fù)染，封片?？疾霻HP 對Bcl-2 表達(dá)/ 癌細(xì)胞凋亡的影響和Survivin 表達(dá)/ 癌細(xì)胞凋亡的影響；考察THP 對PXR 受體調(diào)控的CYP3A誘導(dǎo)作用，可半定量地評價(jià)THP 對肝臟降解致癌物及其他效應(yīng)物功能的誘導(dǎo)作用。

1.3 觀察指標(biāo)[3]

細(xì)胞培養(yǎng)及倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察；AO 染色及熒光顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察；MTT 法檢測THP 對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。細(xì)胞凋亡：染色后細(xì)胞核呈棕褐色的細(xì)胞被判為凋亡細(xì)胞；凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃聚，通常沿核膜分布；整體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，如細(xì)胞表面微絨毛狀突起消失，細(xì)胞間接觸消失，細(xì)胞質(zhì)濃聚，形成具有膜結(jié)構(gòu)的包裹著胞漿內(nèi)容物和核物質(zhì)的凋亡小體；相比壞死，凋亡細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)直到晚期才會解體。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包IBM SPSS Statistics 24.0（社會科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包）對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料均用χ2檢驗(yàn)，以%表示，其他計(jì)量資料比較均以（±s）表示，以t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞凋亡結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期表明,隨GPS 濃度逐漸增高，S 期阻滯作用也逐漸增強(qiáng),出現(xiàn)明顯的“亞二倍體”凋亡峰,隨濃度的增高凋亡峰也逐漸升高；TUNEL 染色法和掃描電鏡觀察到，GPS 使人肝癌細(xì)胞BEL-7402 發(fā)生明顯的凋亡形態(tài)變化,并隨濃度的增加出現(xiàn)凋亡作用逐漸增強(qiáng)；Western blot 結(jié)果顯示，隨GPS 濃度逐漸增高,凋亡相關(guān)蛋白Bax 的表達(dá)逐漸升高,抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)逐漸下降,同時(shí)出現(xiàn)死亡受體TNFR1 的表達(dá)增強(qiáng),提高ERK 磷酸化水平。

2.2 兩組免疫化學(xué)法檢測結(jié)果

試驗(yàn)組在Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白上優(yōu)于對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體參見表格1 所示。

2.3 兩組PXR 受體調(diào)控的CYP3A 誘導(dǎo)作用結(jié)果

PXR 受體調(diào)控的CYP3A 誘導(dǎo)作用結(jié)果表明，CYP3A mRNA的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平中CYP3A6、CYP3A4、CYP3A7 均無顯著增加。具體參見表格2 所示。

表1 兩組免疫化學(xué)法檢測結(jié)果比較（%）

表2 兩組PXR 受體調(diào)控的CYP3A 誘導(dǎo)作用結(jié)果比較

3 討論

人肝癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的研究中，通過分析腫瘤發(fā)生發(fā)展中細(xì)胞增殖、生長、分化、代謝等調(diào)節(jié)失控；細(xì)胞凋亡用以清除多余、衰老和受損傷的細(xì)胞來保持機(jī)體內(nèi)平衡。三葉青多糖的應(yīng)用，在肝癌細(xì)胞凋亡中，充當(dāng)一系列基因激活、蛋白表達(dá)調(diào)控、預(yù)防和治療惡性腫瘤的效果確切。

汪正飛等[4]的研究表明，TFIC50 為3.247 mg/mL,TF 的高、中、低的劑量分別為5、1.25、0.312 5 mg/mL；TF 高、中、低濃度劑量48 h 后對肝癌HepG2 細(xì)胞增殖隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)；TF的高、中、低劑量的抑瘤率分別為64.07%、53.64%、46.69%；抑制腫瘤生長的抑制作用優(yōu)于CTX（環(huán)磷酰胺）組。李振濤等證實(shí)，三葉青具有抑制腫瘤、保肝、抗炎及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多種藥理活性,對抑制肝癌等多種消化系腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡,而對正常細(xì)胞無明顯毒副作用,其抗瘤機(jī)制包括激活胱天蛋白酶（Caspase）家族啟動(dòng)凋亡、引起B(yǎng) 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）基因家族表達(dá)變化從而促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放等[5]。有研究認(rèn)為[6]，有利于提取物中絕大多數(shù)活性成分的釋放，可以對健康人群和癌癥患者提供預(yù)防和輔助治療腫瘤以及提高抗氧化活性和免疫力等功效，尤其對癌癥患者的輔助治療和康復(fù)大有益處，可消除放療、化療的毒副作用，增加免疫力，且同樣適用于普通人預(yù)防腫瘤和提高機(jī)體抗氧化活性。高藥物能抑制SMMC-7721 肝癌細(xì)胞的生長,并具有濃度依賴性，光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；DNA 瓊脂糖凝膠電泳可見DNA 梯形條帶；流式細(xì)胞儀（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測分析出現(xiàn)凋亡亞二倍體峰[7]。綜合來講，介入治療配合三葉青多糖的效果，旨在通過影響HepG2 通路，干預(yù)Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白表達(dá)，發(fā)揮其抑制細(xì)胞黏附基質(zhì)、遷移和侵襲的作用[8-12]。

綜上所述，三葉青多糖對人肝癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用明顯，且整體上加速了細(xì)胞凋亡率，改善了Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白表達(dá)，并無基因轉(zhuǎn)錄影響，值得臨床實(shí)踐中大力實(shí)施推廣。