高效液相色譜法測定感冒靈顆粒中咖啡因、阿司匹林和非那西丁含量

劉彬果，葉盛英

（中國人民解放軍第九八三醫(yī)院，天津300142）

感冒靈顆粒為中國人民解放軍第九八三醫(yī)院的自制中西藥復(fù)方制劑，臨床應(yīng)用多年，具有清熱解毒功效，用于治療感冒發(fā)熱，咽喉疼痛，頭痛等，療效確切。方中蒲公英、敗醬草清熱解毒，為君藥；金銀藤、連翹、桔梗為臣藥?，F(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準僅對中藥成分進行定性鑒別，無含量測定項[1]。為有效控制該制劑質(zhì)量，本研究中建立了同時測定咖啡因、阿司匹林及非那西丁含量的高效液相色譜（HPLC）法[2－3]?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），包括OpenLAB CDS色譜工作站；XS105型電子分析天平（上海梅特勒－托利多公司，精度為十萬分之一）；KQ－50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為50 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

阿司匹林對照品（批號為100113－201606），咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ枮?181807），非那西丁對照品（批號為62－44－2），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為超純水(自制），其他試劑均為分析純；感冒靈顆粒（中國人民解放軍第九八三醫(yī)院制劑室提供，批號分別為14290215，15100215，15220215）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇－0.01 mol／L磷酸二氫鉀溶液（40∶60，V／V）；檢測波長：265 nm；進樣量：10μL；流速：1.0 mL／min；柱溫：室溫。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取阿司匹林對照品、非那西丁對照品及咖啡因?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加流動相制成含阿司匹林200μg／mL、非那西丁200μg／mL、咖啡因70μg／mL的溶液，即得。

供試品溶液：取樣品適量，研細，取0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL流動相，再稱定質(zhì)量，經(jīng)超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，然后用流動相補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例制備不含阿司匹林、非那西丁和咖啡因的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別吸取上述3種溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照品溶液與對照品溶液相同保留時間處無對應(yīng)峰出現(xiàn)，表明陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取咖啡因?qū)φ掌?7.5 mg、阿司匹林對照品51.25 mg、非那西丁對照品51.28 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，流動相稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密吸取1，2，4，5，6，8，10，20μL，依次進樣，按擬訂色譜條件測定峰面積，以進樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程，Y咖＝0.042 2 X咖－0.526 66（r＝0.999 9），Y阿＝2.568 5X阿－4.225 6（r＝0.999 7），Y非＝23.37 X非＋45.497（r＝0.999 9）。結(jié)果咖啡因、阿司匹林、非那西丁進樣量分別在0.35～7.00μg，1.025～20.500μg，1.025～20.510μg（n＝7）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取同一混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次，測定，記錄峰面積。結(jié)果阿司匹林、咖啡因、非那西丁的RSD分別為2.46%，2.67%，1.13%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為15100215）樣品適量，依法制備供試品溶液，室溫放置0，1，2，3，4，5，7，12 h時按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果咖啡因、阿司林和非那西丁的RSD分別為1.72%，2.56%，1.63%(n＝6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為15100215）樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果咖啡因、阿司匹林和非那西丁平均含量的RSD分別為1.97%，3.01%，2.26%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為15100215）0.3 g，共5份，精密稱定，分別精密加入混合對照品（咖啡因0.25 mg／mL，阿司匹林1.016 mg／mL，非那西丁1.81 mg／mL）各5 mL，精密加入流動相50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用流動相補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。詳見表1。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。計算3批樣品中咖啡因、阿司匹林、非那西丁的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取方法選擇[2－5]

考察超聲提取方法中所用的提取溶劑和提取時間等因素，比較分別采用甲醇和流動相提取時的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)采用甲醇提取時，峰形拖尾，無法達到很好的分離效果；當(dāng)采用流動相進行提取時，提取完全，且峰形較好?？疾炝瞬煌崛r間（20，30，40 min）的影響，結(jié)果表明，超聲提取30 min，樣品即可提取完全，故選擇流動相超聲提取30 min。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

表2 3批樣品含量測定結(jié)果（mg／g）

3.2 檢測波長選擇

參考文獻[6－9]，對3種成分在220～400 nm波長范圍進行了紫外光譜掃描，根據(jù)各成分的最大吸收值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用265 nm作為檢測波長時，3種成分均有較好的紫外吸收，被測成分檢測靈敏。

3.3 流動相選擇

參考文獻[10－13]，比較了多種流動相體系，分別采用了甲醇－0.01 mol／L磷酸二氫鉀溶液、冰醋酸－甲醇溶液（用乙二胺調(diào)節(jié)pH 3.7）、乙腈－四氫呋喃－冰醋酸－水和甲醇－水，當(dāng)采用甲醇－水、冰醋酸－甲醇溶液為流動相時，干擾嚴重，樣品穩(wěn)定性差，基線漂移，無法達到分離要求；當(dāng)選用甲醇－0.01 mol／L磷酸二氫鉀溶液和乙腈－四氫呋喃－冰醋酸－水為流動相時，可滿足檢測要求。對這2種流動相進行研究，綜合考察了樣品的穩(wěn)定性、分離度、峰形、出峰時間、峰形（對稱性）、理論板數(shù)等因素，最終選擇甲醇－0.01 mol／L磷酸二氫鉀溶液為流動相，并對其不同比例進行研究，確定甲醇－0.01 mol／L磷酸二氫鉀溶液（40∶60，V／V）為流動相。

3.4 方法評價

該方法操作簡單，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，空白無干擾，能同時測定咖啡因、阿司匹林、非那西丁的含量，可用于感冒靈顆粒的質(zhì)量控制。