一種快速脫鹽制備大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法

蔡松 楊東成 唐梅

摘要：為了建立一種高效快捷的大腸桿菌（Escherichia coli）電轉(zhuǎn)化方案，采用類似密度梯度離心的方法，使用角轉(zhuǎn)子離心機達(dá)到快速除鹽的目的。研究發(fā)現(xiàn)，以20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液作為梯度介質(zhì)，采用菌懸液與梯度介質(zhì)比例為1∶5 （V/V）時形成的密度梯度可有效地進(jìn)行離心除鹽，離心后的細(xì)胞以20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液重懸，隨后在電場強度為15 kV/cm的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化能得到較高的轉(zhuǎn)化效率，而在室溫條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化試驗不能提高轉(zhuǎn)化效率。本研究僅通過2次離心，電轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到4.2×109 CFU/μg DNA，大大簡化了試驗流程。

關(guān)鍵詞：電轉(zhuǎn)化;感受態(tài)細(xì)胞;脫鹽;大腸桿菌（Escherichia coli）

中圖分類號：Q812 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0170-05

Abstract： A similar density gradient centrifuge method was adopted to establish an efficient and fast protocol for Escherichia coli electrotransformation. Angle rotor centrifuge was used to achieve the goal of rapid desalination of cells using 20% glycerol （V/V） /1.5% mannitol （m/V） solution as gradient medium. The ratio of bacteria suspension to gradient medium was 1∶5 （V/V） to form a density gradient， which led to effectively centrifugal desalination. After centrifugation the cells were resuspended in a mixture of 20% glycerol ?（V/V）/1.5% mannitol （m/V）， sequentially electroporated at 15 kV/cm. This procedure was suitable for effective desalination. Electroporation at room temperature did not improve transformation efficiency. In this study， the electransformation efficiency can reach 4.2×109 CFU/μg DNA only by two centrifugation， which greatly simplifies the experimental procedure.

Key words： electrotransformation; competent cells; desalting; Escherichia coli

電轉(zhuǎn)化方法相比化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，具有轉(zhuǎn)化效率極高的特點[1]，傳統(tǒng)的RED基因敲除技術(shù)[2]和最新的crispr/cas9-基因敲除/置換技術(shù)[3]高度依賴于電轉(zhuǎn)化方法。相比較而言，傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化一般不能勝任基因敲除中轉(zhuǎn)化大量核酸片段的工作，雖然一些高效的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法如Hananan[4]法以及Inoue[5]法理論轉(zhuǎn)化效率能達(dá)到1.0×108～1.0×109 CFU/μg DNA，也能滿足電轉(zhuǎn)化需要——構(gòu)建高質(zhì)量的基因文庫、抗體庫和突變庫等工作，但從很多研究來看，自制的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率僅為1.0×107 CFU/μg DNA甚至更低[6]，很多時候只能購買價格昂貴的商業(yè)化感受態(tài)細(xì)胞來進(jìn)行相關(guān)試驗，這無疑增加了科研成本。制備高效的電轉(zhuǎn)化細(xì)胞方法一直是研究關(guān)注的熱點，優(yōu)化培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)時添加組分、尋找適宜菌齡的感受態(tài)細(xì)胞及細(xì)胞濃度等[7]，都可以進(jìn)一步提高電轉(zhuǎn)化方法的實用性和高效性。

雖然電轉(zhuǎn)化具有轉(zhuǎn)化效率高的特點，但在制備感受態(tài)細(xì)胞時也面臨制備時間長、相關(guān)步驟繁瑣等問題。由于電轉(zhuǎn)化的試驗原理要求細(xì)胞懸浮液中導(dǎo)電離子盡可能少，且常規(guī)電轉(zhuǎn)化需要低溫離心多次去鹽[8]，因此增加了整個轉(zhuǎn)化過程的操作時間，反復(fù)離心和重懸細(xì)胞還會影響感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。有研究提出了類似密度梯度離心的方式[9]，以達(dá)到快速除鹽的目的，這種方法大大減少了離心次數(shù)，但需要使用具有水平轉(zhuǎn)子的離心機，且要求離心機轉(zhuǎn)速變化緩慢且平穩(wěn)，這對普通科研實驗室的離心機設(shè)備提出了一定要求。

基于以上思路，本研究提出在具有角轉(zhuǎn)子的任意離心機上制備高感受態(tài)細(xì)胞的方法。不同于上述方法在離心管中菌液底部加入梯度介質(zhì)，本研究提出先加入梯度介質(zhì)形成密度梯度，再加入濃縮好的菌液。兩種方法都基于密度梯度離心，但后者能調(diào)整菌液與脫鹽介質(zhì)體積以及菌液的添加方式，從而達(dá)到更好的離心去鹽效果。

此外，目前有不少研究認(rèn)為，在室溫乃至更高溫度下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化細(xì)胞制備，轉(zhuǎn)化效率更高[10]，為了進(jìn)一步簡化電轉(zhuǎn)化細(xì)胞制備，本研究也嘗試在室溫下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制備，并評估了溫度對電轉(zhuǎn)化效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 本研究采用大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α以及質(zhì)粒pUC19，均由實驗室-18 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 蔗糖（AR）、甘油（AR）、甘露醇（AR）室溫保存，氨芐青霉素（>95%）4 ℃保存，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基：1%（m/V）蛋白胨，0.5%（m/V）氯化鈉，0.5%（m/V）酵母粉，2%（m/V）葡萄糖，2%（m/V）瓊脂粉;抗性篩選培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基，氨芐青霉素50 mg/L;SOC培養(yǎng)基：2%（m/V）蛋白胨，0.5%（m/V）酵母粉，0.05%（m/V）氯化鈉，0.018 6%（m/V）氯化鉀，0.095%（m/V）氯化鎂，0.36%（m/V）葡萄糖。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 電擊杯和MicroPulser電穿孔儀（美國 Eppendorf公司），Centrifuge 5417R和Centrifuge 5804R離心機（美國 Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備

1）從甘油管取大腸桿菌 DH5α于無抗性的新鮮LB瓊脂平板上劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

2）從活化 LB 平板上挑取單菌落接種于50 mL SOC培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600 nm為0.3～0.6作為種子液，按種子液1%的接種量接種于100 mL SOC培養(yǎng)基中，后置于37℃搖床，200 r/min，培養(yǎng)至菌液OD600 nm為0.3～0.6。

3）將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至2支50 mL的無菌離心管冰浴15 min，后4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄除上清液，各加入1 mL預(yù)冷的20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液重懸細(xì)胞，將其中1支離心管重懸后的菌液轉(zhuǎn)移至另1支共2 mL，后置于冰水浴中。

4）向15 mL無菌離心管中加入10 mL預(yù)冷的無菌梯度介質(zhì)含20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V），后使用1 mL移液槍沿著離心管內(nèi)壁緩慢傾斜注入2 mL菌懸液，使其水平鋪展至甘油/甘露醇層表面。

5）隨后4 ℃、4 000 r/min離心15 min，先用移液槍將上層水層去除，再將下層甘油/甘露醇層去除，盡量去除離心管內(nèi)的殘余液體。

6）向離心管內(nèi)部加入100 μL預(yù)冷的20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液重懸細(xì)胞，取80 μL重懸液于1.5 mL EP管用于后續(xù)電轉(zhuǎn)化試驗。

1.2.2 電轉(zhuǎn)化 取感受態(tài)細(xì)胞80 μL和1 ng/μL的pUC19質(zhì)粒于冰水浴中解凍，迅速向感受態(tài)細(xì)胞中加入5 μL pUC19質(zhì)粒，用移液槍輕柔地混勻，再置于冰水浴中2 min，然后立即將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電擊杯中，按照預(yù)設(shè)電擊條件進(jìn)行電擊，電擊結(jié)束后立即加入915 μL已在37 ℃搖床預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)1 h，后取100 μL菌液稀釋103～104倍后，再取100 μL稀釋后的菌液涂布于Amp抗性平板，放于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～16 h，待平板長出菌落后，開始計算抗性平板上的菌落數(shù)，并計算電轉(zhuǎn)化效率，具體公式如下：

[電轉(zhuǎn)化效率（CFU/μg DNA）=][菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)DNA量（μg）] ? ?（1）

2 結(jié)果與分析

2.1 密度梯度離心技術(shù)的探索

2.1.1 離心方式的改進(jìn) 有研究提出了類似密度梯度離心的方法[9]，可以達(dá)到快速除鹽的目的，大大減少了離心次數(shù)，其操作方式如圖1a所示，主要利用了密度梯度離心的原理，在一個固定的離心力和液體黏度條件下，顆粒沉降速率主要與其自身密度ρ與溶液介質(zhì)密度L之間的差值成比例，見公式（2）。

一般水作為介質(zhì)時，密度ρ為1.00 g/mL（室溫），用20%的甘油調(diào)整溶液介質(zhì)密度ρ約為1.05 g/mL[11]，而鹽水的密度ρ約為1.01 g/mL[12]，因此，以20%甘油作為離心時的介質(zhì)，大腸桿菌沉降，而鹽水溶液難以沉降，從而達(dá)到細(xì)胞和鹽分的分離。該方法步驟簡單，但以角轉(zhuǎn)子的離心機離心時，往往難獲得高效率的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。

[v=d2（ρ-L）18μ×g] ? （2）

式中，v為細(xì)胞的沉降速度（m/s），d為顆粒直徑（m），[ρ]為顆粒密度（kg/m3），L為介質(zhì)密度（kg/m3），μ為介質(zhì)黏度（mPa·s），g為離心力（kg·m/s2）。

鑒于此，本研究對該方法進(jìn)行了改進(jìn)，如圖1b所示，借鑒傳統(tǒng)的用于細(xì)胞或細(xì)胞器分離的密度梯度離心方法[13]，將菌液濃縮后鋪展至梯度介質(zhì)層進(jìn)行梯度離心，采用橫截面積更小的15 mL離心管，以此提高梯度層的穩(wěn)定性，改變大腸桿菌的脫鹽效率。

2.1.2 密度梯度介質(zhì)的選擇 密度梯度離心常用的梯度介質(zhì)為甘露醇、山梨醇、甘油、蔗糖、多聚糖和中性硅膠油等[14]，對于活性細(xì)胞的分離常選用蔗糖、甘油或中性硅膠油等為梯度介質(zhì)，但同樣密度的甘油相比于蔗糖來說，其滲透壓更小、黏度更大，在離心分離過程中有利于維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，同時黏度的增加有利于維持樣品層與梯度層的穩(wěn)定。其次，甘油相比于中性硅膠油價格也更便宜。因此，以甘油作為梯度介質(zhì)較為經(jīng)濟合理。

2.1.3 梯度介質(zhì)濃度對密度梯度離心的影響 分別以不同濃度的甘油水溶液作為梯度介質(zhì)，經(jīng)4 ℃、4 000 r/min離心15 min后，如表1所示，當(dāng)甘油水溶液比重達(dá)到20%（V/V）及以上時，即ρ≥1.05 g/mL，水層與甘油層實現(xiàn)明顯的分層，即以20%甘油水溶液作為密度梯度介質(zhì)。為了探究20%甘油水溶液中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘露醇是否會影響離心前后的分層情況，經(jīng)4 ℃、4 000 r/min離心15 min后，均明顯分層。因此，20%甘油水溶液加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘露醇對于離心前后的分層情況沒有影響（表1）。

2.2 不同濃度的甘油/甘露醇溶液對電轉(zhuǎn)化效率的影響

電擊結(jié)束后，往復(fù)蘇培養(yǎng)基中添加一定濃度的滲透溶液[15]能夠有效地提高電轉(zhuǎn)化效率;也有研究認(rèn)為，使用一定濃度的滲透溶液重懸細(xì)胞再進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，對于效率的提高也有幫助[16]。為了進(jìn)一步探究感受態(tài)細(xì)胞中滲透溶液對其電轉(zhuǎn)化效率的影響，經(jīng)密度梯度離心后（圖1b），分別以預(yù)冷去離子水（即甘油與甘露醇濃度均為0）、20%甘油水溶液以及20%甘油水溶液加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘露醇（m/V）重懸細(xì)胞，輔助維持細(xì)胞在離心過程中的滲透壓平衡[11]。經(jīng)3次重復(fù)試驗，由表2可知，以去離子水重懸細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)化試驗，電轉(zhuǎn)化效率為1.3×109 CFU/μg DNA;以20%甘油（V/V）水溶液重懸細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)到2.1×109 CFU/μg DNA;而當(dāng)往20%甘油（V/V）水溶液加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘露醇重懸細(xì)胞，相較于僅使用甘油水溶液重懸細(xì)胞，其效率均有一定程度提高，且以20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液重懸細(xì)胞時，電轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)到3.3×109 CFU/μg DNA。

在電擊過程中瞬時的高壓使細(xì)胞形成空隙，細(xì)胞在一定時間內(nèi)慢慢吸收外界物質(zhì)如核酸片段，但由于胞內(nèi)與胞外滲透壓的差異，使得細(xì)胞內(nèi)液大量外流，導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，同時也不利于外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。而通過使用20%甘油/1.5%甘露醇溶液重懸細(xì)胞，使得電轉(zhuǎn)的感受態(tài)細(xì)胞處于一定濃度的滲透溶液中，能夠維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡，從而有效防止細(xì)胞內(nèi)容物外流，提高了細(xì)胞的存活率，使最終的電轉(zhuǎn)化效率進(jìn)一步得到提高。

2.3 梯度介質(zhì)體積對電轉(zhuǎn)化效率的影響

密度梯度離心法的優(yōu)點在于僅離心1次就獲得較純的樣品顆粒，減少離心步驟。但使用密度梯度離心法分離樣品時，樣品的添加體積是試驗成敗的關(guān)鍵因素之一[17]。為此，將菌懸液體積固定為2 mL，通過改變梯度介質(zhì)的體積，以探索梯度介質(zhì)體積對分離效果的影響，進(jìn)而找到最適合的菌懸液/梯度介質(zhì)體積比。經(jīng)過3次重復(fù)試驗，由圖2可知，隨著梯度介質(zhì)體積的提高，電轉(zhuǎn)化效率不斷提高，當(dāng)兩者體積比為1∶5時，電轉(zhuǎn)化效率達(dá)到3.6×109 CFU/μg DNA，而后再增加梯度介質(zhì)體積，電轉(zhuǎn)化效率趨于平緩。

電轉(zhuǎn)化效率的高低關(guān)鍵在于是否制備出低鹽濃度的感受態(tài)細(xì)胞和DNA片段，一般所制備的DNA片段經(jīng)純化后鹽濃度都很低，所以電轉(zhuǎn)化效率主要取決于感受態(tài)細(xì)胞中鹽離子的含量。感受態(tài)細(xì)胞中鹽成分去除不凈，在電擊時瞬時的高壓會產(chǎn)生電弧導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡[12]。通過減少菌液的體積增加梯度介質(zhì)體積，梯度離心結(jié)束后實現(xiàn)了細(xì)胞與鹽分的有效分離，進(jìn)而降低了感受態(tài)細(xì)胞中鹽離子的含量，從而減弱鹽離子對電轉(zhuǎn)化試驗的干擾。

2.4 電場強度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

電場強度一直被認(rèn)為是影響電轉(zhuǎn)化效率的重要因素[18]，同時，重懸液由去離子水轉(zhuǎn)變成20%甘油/1.5%甘露醇溶液，重懸液的改變是否也會影響電場強度對電轉(zhuǎn)化效率的影響，也需要進(jìn)一步研究。為了探索電場強度大小以及重懸液的改變對電轉(zhuǎn)化效率的影響，分別采用不同重懸液重懸細(xì)胞在不同的電場強度下進(jìn)行電擊試驗。經(jīng)過3次重復(fù)試驗，結(jié)果表明，隨著電場強度的提高，電轉(zhuǎn)化效率隨之提高，當(dāng)以去離子水重懸細(xì)胞，電場強度在13 kV/cm時，電轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)2.3×109 CFU/μg DNA，而當(dāng)以20%甘油/1.5%甘露醇溶液重懸細(xì)胞，電場強度在15 kV/cm時，電轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)4.2×109CFU/μg DNA，隨后電轉(zhuǎn)化效率急劇降低（圖3）。

在進(jìn)行電轉(zhuǎn)化試驗時，經(jīng)高電場強度電擊后本身大量的細(xì)胞會死亡，只有少部分細(xì)胞存活下來，而攜帶了外源核酸片段的細(xì)胞存活下來的數(shù)量更少，在尋找到最適宜的電場強度后，再進(jìn)一步增加電場強度反而會導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，電轉(zhuǎn)化效率急劇降低。同時，電擊緩沖液由20%甘油/1.5%甘露醇溶液代替去離子水時，在不同電場強度條件下的電轉(zhuǎn)化效率均有一定程度的提高，使得最適宜的電場強度由13 kV/cm變?yōu)?5 kV/cm。

2.5 溫度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

在制備電轉(zhuǎn)化細(xì)胞及電轉(zhuǎn)化試驗過程中通常溫度要保持在0～4 ℃[12]，也有不少研究認(rèn)為室溫甚至更高溫度進(jìn)行電轉(zhuǎn)化試驗相比于低溫其效率反而更高[19]。因此，為了進(jìn)一步探究溫度對電轉(zhuǎn)化效率的影響，探索出更加簡便的電轉(zhuǎn)化試驗方案，本研究進(jìn)行了3次重復(fù)試驗。由表3可知，在不同溫度梯度下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備以及電擊試驗，隨著溫度的提高，電轉(zhuǎn)化效率急劇降低，當(dāng)溫度為37 ℃時，其電轉(zhuǎn)化效率僅為7.3×107 CFU/μg DNA，而當(dāng)溫度保持在0～4 ℃時，其電轉(zhuǎn)化效率可達(dá) ? ?3.9×109 CFU/μg DNA，即0～4 ℃時的電轉(zhuǎn)化效率比37 ℃時提高了約52倍。

電轉(zhuǎn)化效率的提高意味著外源DNA進(jìn)入更多的細(xì)胞，同時在電擊結(jié)束后有更多的細(xì)胞存活下來。在制備電轉(zhuǎn)化細(xì)胞時，需要使用預(yù)冷的去離子水洗滌細(xì)胞以去除培養(yǎng)基和導(dǎo)電溶質(zhì)，所有的設(shè)備都需要提前預(yù)冷，而且整個操作過程需要保持低溫環(huán)境，具體的機理目前尚不清楚，可能的原因是保持低溫環(huán)境影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的脆性增加，瞬時的高電壓更容易在細(xì)胞表面形成局部的瞬態(tài)孔隙[7]，使得外源DNA更容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部。但也有一些菌株在進(jìn)行電轉(zhuǎn)化試驗時需要保持室溫甚至更高溫度，其觀點為細(xì)胞經(jīng)多次低溫洗滌離心后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)會受到一定破壞[12]，不利于細(xì)胞的存活，經(jīng)低溫制備出的感受態(tài)細(xì)胞更容易收縮，從而降低了細(xì)胞膜的流動性與通透性，瞬時的高電壓在細(xì)胞表面形成局部的瞬態(tài)孔隙減少，外源DNA反而不容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部，而溫度的提高能夠增加細(xì)胞膜的流動性，外源DNA更容易進(jìn)入細(xì)胞。但通過對大腸桿菌DH5α進(jìn)行多次反復(fù)的試驗驗證，發(fā)現(xiàn)隨著電轉(zhuǎn)化試驗過程中的溫度提高，電轉(zhuǎn)化效率反而急劇降低。也有許多類似研究認(rèn)為以一般的大腸桿菌菌株進(jìn)行電轉(zhuǎn)化試驗，整個試驗操作最好保持低溫操作才能保證較高的電轉(zhuǎn)化效率[12，20]。

3 小結(jié)

本研究分別對密度梯度離心技術(shù)及影響大腸桿菌電轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行探索。首先，通過對梯度介質(zhì)進(jìn)行分析選擇，并對梯度介質(zhì)濃度及菌懸液與梯度介質(zhì)之間的體積比關(guān)系進(jìn)行研究。利用15 mL離心管代替50 mL離心管，探索出一種類似于密度梯度離心法且適用于角轉(zhuǎn)子離心機的離心方法，使用角轉(zhuǎn)子離心機實現(xiàn)細(xì)胞與鹽分的有效分離，整個電轉(zhuǎn)化試驗僅需2步離心，省去了常規(guī)方法的多步洗滌離心除鹽，簡化了電轉(zhuǎn)化試驗步驟。其次，在確定好離心技術(shù)的同時進(jìn)一步探究影響電轉(zhuǎn)化效率的因素——滲透溶液的濃度、梯度介質(zhì)體積、電場強度以及電轉(zhuǎn)化試驗過程的溫度等。研究發(fā)現(xiàn)，菌懸液與脫鹽梯度介質(zhì)比例為1∶5時，使用20%甘油/1.5%的甘露醇作為滲透溶液重懸細(xì)胞，在電場強度為 ?15 kV/cm下進(jìn)行電擊，且制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞及電轉(zhuǎn)化過程中溫度維持在0～4℃，最終所制備的感受態(tài)細(xì)胞電轉(zhuǎn)化效率達(dá)4.2×109 CFU/μg DNA，較傳統(tǒng)方法電轉(zhuǎn)化效率提高的同時也大大縮短了試驗時間，為以后的分子試驗打下了堅實的基礎(chǔ)。

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