激光輔助孵化技術(shù)對(duì)囊胚期凍融胚胎移植患者妊娠結(jié)局的影響

馮清 李嘉泓 宋燕 周志偉 段彪 劉娟

【摘要】 目的：探討激光輔助孵化技術(shù)對(duì)囊胚期凍融胚胎移植患者妊娠結(jié)局的影響。方法：選取2017年1月-2018年12月在本院行凍融囊胚解凍移植技術(shù)助孕的339例患者。按激光輔助方式不同分為A組190例和B組149例，A組行透明帶削薄，B組行透明帶打孔。比較兩組胚胎復(fù)蘇率、胚胎著床率、移植周期妊娠率以及子代出生情況。結(jié)果：兩組移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)囊胚率、胚胎解凍復(fù)蘇率、移植周期妊娠率、胚胎著床率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、出生缺陷率、早產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：透明帶削薄、透明帶打孔兩種激光輔助在囊胚期凍融胚胎移植中效果相近，臨床可根據(jù)實(shí)際情況選擇適宜的輔助孵化技術(shù)。

【關(guān)鍵詞】 囊胚期凍融胚胎移植 透明帶削薄 透明帶打孔 妊娠結(jié)局

[Abstract] Objective： To explore the effect of laser-assisted incubation technology on pregnancy outcomes in patients with blastocyst stage freeze-thaw embryo transfer. Method： A total of 339 patients who received freeze-thawed blastocyst thawing transplantation in our hospital from January 2017 to December 2018 were selected. According to different laser assisted methods， the patients were divided into group A 190 cases and group B 149 cases. Group A received zona pellucida thinning， while group B received zona pellucida drilling. Embryo recovery rate， embryo implantation rate， pregnancy rate of transplantation cycle and offspring birth were compared between the two groups. Result： The number of transplanted embryos， high quality blastocyst rate， thawing and resuscitation rate of embryos， pregnancy rate of transplantation cycle， embryo implantation rate， abortion rate， live birth rate， birth defect rate and premature birth rate between the two groups compared， the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Two kinds of laser-assisted techniques， zona pellucida thinning and zona pellucida drilling， have similar effects in the freezing-thawing embryo transfer at blastocyst stage， the appropriate auxiliary incubation technology can be selected clinically according to the actual situation.

[Key words] Blastocyst stage freeze-thaw embryo transfer Zona pellucida thinning Zona pellucida drilling Pregnancy outcomes

First-authors address： Peoples Hospital of Ganzhou City， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.27.015

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）會(huì)因子宮容受性低和胚胎質(zhì)量差等因素的影響，降低胚胎種植率[1-2]。凍融過程中，胚胎會(huì)因暴露在極低溫環(huán)境下，加速透明帶的硬化，胚胎發(fā)育成胚囊后難以從透明帶中孵出，并影響胚胎種植率[3-5]。輔助孵化技術(shù)能夠幫助胚胎經(jīng)透明帶中孵出，其中激光輔助孵化技術(shù)具有安全、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能對(duì)移植前透明帶實(shí)施削減厚度或人工開口，促進(jìn)胚胎孵出，有助于提高臨床妊娠率。本研究旨在分析激光輔助孵化技術(shù)對(duì)囊胚期凍融胚胎移植患者妊娠結(jié)局的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月-2018年12月在本院行凍融囊胚解凍移植技術(shù)助孕的339例患者。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<37歲;②行IVF-ET技術(shù)助孕。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮內(nèi)膜異位癥;②輸卵管積水;③子宮肌瘤;④急性生殖道感染;⑤嚴(yán)重內(nèi)外科疾病;⑥性激素應(yīng)用禁忌證;⑦甲狀腺功能異常;⑧夫妻雙方有任何一方染色體異常。按激光輔助方式不同分為A組190例和B組149例。所有患者均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑、儀器與耗材 囊胚玻璃化冷凍試劑（RapidVit TM Blast， Vitrolife），囊胚玻璃化解凍試劑（RapidWarm TM Blast， Vitrolife），胚胎移植液（EmbryoGlue， Vitrolife），體視顯微鏡（SMZ800，日本Nikon），倒置顯微鏡及顯微操作系統(tǒng)（英國RI），CO2培養(yǎng)箱（澳大利亞Cook），液氮罐（美國MVE），冷凍盒（瑞典Vitrolife），激光封口儀（瑞典Vitrolife），開放式載桿（日本Kitazato），激光破膜系統(tǒng)（英國RI）。

1.2.2 促排卵方案和胚胎培養(yǎng) 應(yīng)用長方案促排卵，取卵后行常規(guī)IVF，37 ℃、三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)胚胎，第三天新鮮移植兩枚卵裂胚或冷凍兩枚卵裂胚，剩余可利用胚胎培養(yǎng)至第5～6天，養(yǎng)成的可利用囊胚行玻璃化冷凍。

1.2.3 囊胚質(zhì)量評(píng)級(jí)及囊胚冷凍和解凍 根據(jù)David Gardner提出的囊胚分級(jí)系統(tǒng)分級(jí)對(duì)分級(jí)在CC以上的第5天或者第6天囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍。本中心定義2PN來源且3BB級(jí)以上囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚。在囊胚玻璃化冷凍前，先進(jìn)行激光皺縮。囊胚冷凍過程：將囊胚在冷凍1液，冷凍稀釋培養(yǎng)基[含10%血清蛋白替代物（SPS）的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）液]中放置10 min，隨后轉(zhuǎn)移至冷凍2液[1.5 M苯二胺（PPD）溶液]中2 min，在冷凍3液（1.5 M PPD溶液+0.1 M蔗糖溶液）中轉(zhuǎn)移3個(gè)位置并在1 min內(nèi)裝載到加藤載桿的前端上，立刻將載桿葉片浸入液氮中，裝好套管，把胚胎保存在液氮中。胚胎解凍過程為：將載桿從液氮中取出，放入解凍1液（0.5 M蔗糖解凍液）2 min中，再移至2液（0.2 M蔗糖解凍液）中3 min，3液[HEPES培養(yǎng)基（含10% SPS）]中10 min，移至G-2微滴皿中清洗最后放于移植皿。

1.2.4 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備 激素替代周期：月經(jīng)第3天開始口服6～12 mg/d補(bǔ)佳樂，2周后行B超檢查，待內(nèi)膜≥8 mm時(shí)肌肉注射80 mg/d黃體酮，5 d后解凍。自然周期：出現(xiàn)黃體生成素（LH）峰，即LH半定量試紙測(cè)定達(dá)65 U/L，優(yōu)勢(shì)卵泡直徑為16～18 mm，排卵日肌肉注射40 mg/d黃體酮，第5天行凍融胚胎移植。

1.2.5 輔助孵化 A組行透明帶削?。阂浦才咛デ?，用激光系統(tǒng)（英國RI）薄化透明帶，使用半環(huán)狀薄化程序，對(duì)透明帶1/4周長區(qū)域進(jìn)行操作，時(shí)長根據(jù)需要選擇1～1.4 ms，削薄透明帶50%～80%。B組行透明帶打孔：移植胚胎前，使用激光系統(tǒng)（英國RI）行透明帶打孔，時(shí)長根據(jù)需要選擇1～1.4 ms，在透明帶上灼燒出透明帶1/8～1/4周長區(qū)域孔洞，操作完成后應(yīng)能明顯觀察到胚胎內(nèi)外液體的流動(dòng)。

1.2.6 胚胎移植 在B超引導(dǎo)下將輔助孵化后胚胎移植入宮腔，黃體功能用黃體酮或絨毛膜促性腺激素（hCG）維持。移植后5周，B超檢查顯示可見孕囊與原始心管搏動(dòng)，即為妊娠。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較兩組胚胎復(fù)蘇情況與胚胎情況，包括移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)囊胚率、胚胎解凍復(fù)蘇率;（2）比較兩組移植情況，包括移植周期妊娠率、胚胎著床率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率;（3）統(tǒng)計(jì)比較兩組子代出生情況，包括出生缺陷、早產(chǎn)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 A組190例，年齡22～36歲，平均（31.23±2.45）歲;不孕年限1～9年，平均（4.15±1.20）年;移植日內(nèi)膜厚度8～15 mm，平均（0.95±0.25）mm;子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備：激素替代周期83例，自然周期107例。B組149例，年齡24～35歲，平均（31.17±2.29）歲;不孕年限2～10年，平均（4.26±1.05）年;移植日內(nèi)膜厚度7～15 mm，平均（0.96±0.27）mm;子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備：激素替代周期63例，自然周期86例。兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組胚胎復(fù)蘇情況與胚胎情況比較 A組移植胚胎數(shù)（1.52±0.50）個(gè)，與B組移植胚胎數(shù)（1.51±0.50）個(gè)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.183，P=0.855）。A組凍前胚胎279個(gè)，B組凍前胚胎234個(gè)。兩組優(yōu)質(zhì)囊胚率、胚胎解凍復(fù)蘇率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3 兩組移植情況比較 兩組移植周期妊娠率、胚胎著床率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.4 兩組子代出生情況比較 兩組子代出生缺陷率、早產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

囊胚評(píng)級(jí)、患者年齡、子宮內(nèi)膜情況、移植胚胎數(shù)目與胚胎解凍復(fù)蘇情況、臨床妊娠情況密切相關(guān)。本研究選擇年齡在37歲以內(nèi)，行凍融囊胚解凍移植技術(shù)的患者按激光輔助孵化方式分組。兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明兩組的一般情況基本一致。納入研究周期的冷凍解凍過程由兩名完成200次以上人類胚胎冷凍解凍臨床操作經(jīng)驗(yàn)的胚胎師隨機(jī)操作。操作人員對(duì)載桿使用、試劑使用和標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程非常熟練并嚴(yán)格執(zhí)行，盡量消除研究過程中的由操作人員引起的試驗(yàn)誤差。

透明帶可局部裂解，促使囊胚正常孵化、種植，而在體內(nèi)小分子物質(zhì)與動(dòng)力學(xué)相關(guān)變化的相互作用下，囊胚可造成透明帶逐漸擴(kuò)張、變薄，并局部發(fā)生斷裂、溶解，確保囊胚正常孵出和成功種植[6-10]，因在胚胎種植中透明帶孵出起到重要作用。IVF-ET技術(shù)中，胚胎或卵子長期在體外培養(yǎng)基中暴露，移植后剩余的新鮮可利用胚胎需行凍融復(fù)蘇，而暴露于液氮中，會(huì)造成透明帶增厚、變硬，阻礙囊胚孵出，直接影響種植成功率[11-13]。輔助孵化技術(shù)是利用人為方式促進(jìn)胚胎脫出透明帶，從而提高胚胎種植成功率，促進(jìn)患者妊娠。

激光輔助孵化具有定位準(zhǔn)確、操作時(shí)間短、胚胎暴露于體外時(shí)間短、可重復(fù)使用、無須昂貴的操作儀器等優(yōu)勢(shì)，可有效降低輔助生殖周期成本，與其他孵化方式相比，是一個(gè)相對(duì)安全、有效的選擇[14-15]。本研究結(jié)果顯示，兩組優(yōu)質(zhì)囊胚率、胚胎解凍復(fù)蘇率、移植周期妊娠率、胚胎著床率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、出生缺陷率、早產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示囊胚透明帶削薄、透明帶打孔均是有效輔助孵化術(shù)方式，效果相當(dāng)。透明帶打孔直接將胚胎暴露于子宮環(huán)境，人為地干擾了胚胎的內(nèi)環(huán)境，內(nèi)膜和胚胎的分子交互影響可能會(huì)影響胚胎著床[16-17]。透明帶削薄將液體通過顯微鏡傳導(dǎo)至透明帶，熱效應(yīng)溶解透明帶，削薄透明帶厚度的50%～80%，長度約為透明帶1/4周長區(qū)域，無須穿透內(nèi)側(cè)透明帶，最大程度減少了囊胚孵出阻力，同時(shí)維護(hù)了胚胎內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[18-20]。因目前研究手段難以明確透明帶上胚胎自然孵出位置，可將透明帶薄化區(qū)域擴(kuò)大，增加其與自然易孵出位點(diǎn)對(duì)應(yīng)概率，為胚胎順利孵出提供良好條件。胚胎發(fā)育至囊胚階段后透明帶已經(jīng)比卵裂胚更薄。故兩種輔助孵化方式對(duì)囊胚而言都能有效減少冷凍過程中透明帶變硬帶來的阻力。這兩種激光孵化方式的作用效果可能被囊胚的高著床率和高妊娠率的特點(diǎn)掩蓋而無明顯差異。

綜上所述，透明帶削薄、透明帶打孔均為有效的輔助孵化手段，兩者在囊胚期凍融胚胎移植中效果相近，臨床可根據(jù)患者具體情況和各實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程選擇適宜的技術(shù)。

參考文獻(xiàn)

[1]林秀峰，杜靜，伍暢，等.拮抗劑方案與克羅米芬微刺激方案對(duì)卵巢低反應(yīng)患者體外受精胚胎移植結(jié)局的臨床研[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2016，13（17）：62-65.

[2]董玲鳳，張靜雯，黃建洲，等.激素替代治療解凍移植周期中體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)卵裂期胚胎移植臨床結(jié)局的影響[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2019，28（1）：71-73.

[3]劉苡萱，朱旻，顏宏利，等.移植日注射人絨毛膜促性腺激素對(duì)凍融胚胎移植妊娠結(jié)局的影響[J].國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2019，38（1）：30-34.

[4]馬博，王丹，李玉虎，等.激光輔助孵化胚胎透明帶內(nèi)層方法的臨床價(jià)值[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2017，26（11）：848-850.

[5]于成和，張麗蓉，柴蓓蓓，等.卵子透明帶激光淺層、深層打孔卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射體外受精效果對(duì)比觀察[J].山東醫(yī)藥，2018，57（7）：51-53.

[6]金琪，駱麗華，黃玲莉，等.三種移植策略在反復(fù)種植失敗患者凍融胚胎移植周期中的應(yīng)用比較[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2019，28（4）：342-347.

[7]李睿，王鵬，臘曉琳.探討輔助孵化在既往種植失敗患者解凍周期中的合理化應(yīng)用[J].生殖與避孕，2016，36（6）：464-470.

[8]趙美，吳海霞，陳智勤，等.凍融胚胎移植中輔助孵化對(duì)妊娠結(jié)局及安全性的影響[J].中華生殖與避孕雜志，2017，37（9）：693-697.

[9]丁錦麗，楊菁，李風(fēng)和.移植胚胎數(shù)量和輔助孵化對(duì)高齡不孕癥患者助孕臨床結(jié)局的影響[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2016，25（1）：16-21.

[10]周媛萍，王海燕，朱玉蓉，等.改良超長激素替代方案在反復(fù)種植失敗患者凍融胚胎移植中的應(yīng)用[J].浙江醫(yī)學(xué)，2019，41（11）：1154-1157.

[11]施迎迎，李萍，林津，等.影響凍融胚胎移植妊娠結(jié)局的相關(guān)因素分析[J].中國婦幼保健，2019，34（4）：879-881.

[12]張小建，彭禮繁，李曉潔，等.Cryoleaf和Cryoloop冷凍載體凍融胚胎移植結(jié)局[J].中國計(jì)劃生育學(xué)雜志，2019，27（2）：154-157.

[13]劉杰，鄭潔，雷亞蘭，等.高齡婦女凍融周期胚胎移植策略的選擇及對(duì)妊娠結(jié)局的影響[J].中國婦幼保健，2019，34（10）：2334-2337.

[14]黃亞，徐利，葛鳳菊，等.激光輔助孵化完全去除透明帶對(duì)冷凍單囊胚移植結(jié)局的影響[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2019，18（3）：334-339.

[15]王琦，陳蔚清，張程.不同激光輔助孵化對(duì)玻璃化冷凍和慢速程序冷凍卵裂期胚胎移植妊娠率的影響[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，31（4）：535-537.

[16]倪曉蓓，王珊珊，陳林君，等.激光輔助孵化技術(shù)在透明帶異?；颊咝迈r移植周期中的應(yīng)用及安全性分析[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2018，27（6）：551-554.

[17]路新梅，徐晨，王亮，等.激光輔助孵化對(duì)種植失敗患者凍融胚胎移植妊娠結(jié)局的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，37（1）：106-110.

[18]彭姝明，劉海鵬，陳藝，等.激光輔助孵化對(duì)多囊卵巢綜合征患者體外受精-胚胎移植治療結(jié)局的影響分析[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2016，25（5）：429-433.

[19]黃青，杜紅姿，劉寒艷，等.激光透明帶打孔法輔助孵化對(duì)凍融胚胎/囊胚移植的影響[J].中國婦幼保健，2015，30（18）：3008-3011.

[20]羅陽，杜紅姿，劉見橋，等.激光輔助孵化對(duì)凍融第三天胚胎囊胚培養(yǎng)后移植結(jié)局的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（9）：1659-1662.

（收稿日期：2020-05-11） （本文編輯：姬思雨）