同位素內(nèi)標(biāo)液質(zhì)聯(lián)用法測定動(dòng)物源食品中的氯丙嗪殘留量

吳基任 李成 譚高好 莫秋岸 徐彬

摘 要 建立測定動(dòng)物源食品中氯丙嗪（Chlorpromazine）殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)方法。樣品用乙腈和水（80/20）超聲波提取后，用Waters Oasis PRiME HLB小柱凈化，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離。以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，用電噴霧正離子（ESI+）多反應(yīng)監(jiān)測、基質(zhì)校準(zhǔn)同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。方法在0.1～20 μg/L范圍內(nèi)具有良好線性，相關(guān)系數(shù)r=0.998。樣品在低、中、高3個(gè)濃度水平下的平均回收率為89.1%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.5%～4.8%。檢出限（S/N=3）為0.1 μg/kg，定量下限（S/N=10）為0.3 μg/kg。

關(guān)鍵詞 超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜 ；同位素內(nèi)標(biāo) ；氯丙嗪 ；動(dòng)物源食品

中圖分類號 O656.31 文獻(xiàn)識別碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.021

Abstract Chlorpromazine residues in animal-based food were detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and quantified by using an isotope-labeled internal standard. The samples were extracted by acetonitrile and water （80/20）， purified by Waters Oasis PRiME HLB column， separated by Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column. The acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution were used as the mobile phase for gradient elution. The chlorpromazine was detected by using electrospray ionization （ESI+） in positive ion mode with multiple reaction monitoring （MRM）， and its quantity was analyzed by using the matrix matched calibration method combined with the stable isotope-labeled internal standard. This combined method had a good linearity in the range of 0.1～20 g/L， and its correlation coefficient was r=0.998. The mean recoveries of spiked samples at three levels （low， moderate and high） ranged from 89.1% to 93.5% with relative standard deviations （RSD） of 2.5%～4.8%. The detection limit （S/N=3） was 0.1 g/kg， and the lower limit of quantitation （S/N=10） was 0.3 g/kg.

Keywords supper-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ； isotope-labeled internal standard ； chlorpromazine ； animal-based food

氯丙嗪（Chlorpromazine）是一種吩噻嗪類藥物，在臨床上作為中樞多巴胺受體的阻斷劑，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，常用來鎮(zhèn)吐、鎮(zhèn)靜催眠以及抗暈眩、暈動(dòng)癥等[1-2]。因經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，一些養(yǎng)殖戶在飼料中違規(guī)添加氯丙嗪來抑制家畜的運(yùn)動(dòng)，以達(dá)到育肥的目的；或是在家畜的長途運(yùn)輸過程中使用氯丙嗪，以減輕動(dòng)物的應(yīng)激性，降低死亡率[3-5]。氯丙嗪在家畜飼養(yǎng)中的濫用，會(huì)通過動(dòng)物性食品的殘留直接危害到人類健康[6-9]。衛(wèi)生部于2010年3月22日公布的第四批“食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單”中就包含了氯丙嗪。而且我國農(nóng)業(yè)部235公告明確規(guī)定了氯丙嗪等精神類藥物只允許治療使用，且不得在動(dòng)物性食品中檢出[10]。目前現(xiàn)行有效的氯丙嗪殘留檢測方法為GB/T 20763-2006，適用基質(zhì)是豬腎和肌肉組織[11]，根本無法滿足現(xiàn)在的要求，且該方法前處理過于復(fù)雜，實(shí)際應(yīng)用中氯丙嗪加標(biāo)回收率偏低[12]。因此建立簡單準(zhǔn)確的動(dòng)物性食品中氯丙嗪的檢測方法，給食品風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警和食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐勢在必行[13-14]。本研究分析了前處理方法和色譜條件等對動(dòng)物性食品中氯丙嗪殘留量同位素內(nèi)標(biāo)液質(zhì)聯(lián)用法檢測效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和設(shè)備

LC-30超高效液相（日本島津），QTRAP 5500三重四級桿液質(zhì)（美國AB SCIEX），SK7200B超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)），T-18均質(zhì)機(jī)（IKA廣州），Multi Reax全能型振蕩器（德國Heidolph），Centrifuge 5804高速離心機(jī)（德國Eppendorf），DG-12型固相萃取裝置（美國Supelco）；Autovap S60氮吹儀（美國ATR），XS-205電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo），Milli-Q超純水制備系統(tǒng)（美國MILLI-PORE）。

1.1.2 試劑和樣品

鹽酸氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer），鹽酸氯丙嗪-D6同位素內(nèi)標(biāo)（德國Dr.Ehrenstorfer），乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，德國默克公司），Waters Oasis PRiME HLB小柱：200 mg/6 mL（美國Waters），實(shí)驗(yàn)用水為超純水，樣品為農(nóng)貿(mào)市場不同攤位采購的豬肉、牛肉、羊肉各10批。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將樣品切成小塊后用勻漿機(jī)粉碎，稱取5 g樣品于50 mL離心管中，添加氯丙嗪-D6內(nèi)標(biāo)溶液，漩渦混勻；加入10 mL 80%乙腈水溶液，漩渦混勻2 min，置于超聲波清洗器超聲提取10 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液直接加載到Waters Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，保持1滴/s的流速，收集全部流出液；在40℃下氮?dú)獯抵两?，?0%甲醇水溶解定容至2 mL，過0.22 μm微孔濾膜，上LC-MS/MS測定[15]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取鹽酸氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸氯丙嗪-D6同位素內(nèi)標(biāo)，用甲醇配制成10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 儀器分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters Acquity UPLCTM BEH C18 1.7 μm，2.1×100 mm。

流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2 μL。梯度洗脫程序見表1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度：550℃；霧化氣壓力（GS1）：50 psi；氣簾氣壓力（CUR）：20 psi；輔助氣壓力（GS2）：50 psi。質(zhì)譜參數(shù)條件見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理的優(yōu)化

畜肉基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪及非極性磷脂類干擾物，極大地干擾目標(biāo)化合物的分析，這就要求前處理必須能夠凈化畜肉的復(fù)雜基質(zhì)，同時(shí)釋放出目標(biāo)化合物。試驗(yàn)使用不同濃度的乙腈溶液處理樣品，提取目標(biāo)化合物，同時(shí)起到沉淀蛋白的目的。試驗(yàn)比較了70%、80%、90%乙腈水溶液及純乙腈溶液提取效率和凈化效果，發(fā)現(xiàn)含80%乙腈水溶液提取效率最高。在固相萃取小柱的選擇上，選取了Waters Oasis HLB （200 mg/6 mL）和Waters Oasis PRiME HLB（200 mg/6 mL）進(jìn)行比較，這2種固相萃取小柱均無需活化、淋洗及洗脫。而Waters Oasis PRiME HLB作為增強(qiáng)型除磷脂等非極性干擾物的新型反相SPE吸附劑，結(jié)合80%乙腈水溶液作為提取液沉淀蛋白，能夠有效地除去畜肉樣品中的大部分基質(zhì)干擾，獲得更干凈的樣品譜圖及準(zhǔn)確分析結(jié)果，2種固相萃取小柱對豬肉、牛肉、羊肉3種陰性基質(zhì)的凈化效果見下圖1和圖2。

2.2 色譜流動(dòng)相的條件的優(yōu)化

采用乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，將空白基質(zhì)配制的1 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測試，比較出峰情況，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相水相加入5 mmol/L乙酸銨，可以改善色譜峰拖尾的問題，但存在響應(yīng)值偏低的問題，而乙腈-0.1%甲酸水溶液則有利于化合物的離子化，信號響應(yīng)得到增強(qiáng)。綜合考慮基質(zhì)干擾、靈敏度、峰型等因素，選取乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相。氯丙嗪及D-6氯丙嗪總離子流圖及二級質(zhì)譜圖見圖3和圖4。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

精確吸取氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液、D6-氯丙嗪內(nèi)標(biāo)溶液，用處理好的陰性樣品溶液稀釋，配置成2 ng/mL的D6-氯丙嗪內(nèi)標(biāo)，氯丙嗪為0.1、0.5、2、5、10、20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。按優(yōu)化好的儀器條件對標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行測定，以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，得到線性回歸方程：Y= 18.116 72X-0.205 02，相關(guān)系數(shù)r =0.998，表明目標(biāo)化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在陰性樣品中添加一定量的氯丙嗪及D6-氯丙嗪，按1.2.1處理后上機(jī)測定，根據(jù)定量離子對色譜峰的信噪比[其中信噪比（S/N=3）為檢出限，信噪比（S/N=10）為定量下限]，得出該方法檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

取陰性豬、牛、羊肉，分別添加0.5、2、10 μg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行6個(gè)平行試驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表3。從表中可知，氯丙嗪在豬、牛、羊這3種基質(zhì)中的3個(gè)水平加標(biāo)，回收率在89.1%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6）在2.5%～4.8%，符合GB/T 27404-2008 《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》標(biāo)準(zhǔn)附錄F中F.1回收率的要求（被測組分含量<0.1 mg/kg時(shí)，回收率范圍為60%～120%）及標(biāo)準(zhǔn)附錄F中實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)的要求[相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6）<10%]。

2.5 實(shí)際樣品檢測

采用本方法對市場采購的10批共30份豬肉、牛肉、羊肉樣品進(jìn)行檢測，其中僅有1份豬肉檢出略低于檢出限（0.07 μg/kg）的氯丙嗪，牛肉、羊肉中未檢出，結(jié)果見表4和圖5。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用80%乙腈-水溶液超聲渦旋提取，建立了同位素內(nèi)標(biāo)液質(zhì)聯(lián)用法測定畜肉中氯丙嗪的方法。針對豬肉、牛肉、羊肉等3種基質(zhì)的陰性樣品，通過加標(biāo)回收、精密度和市場采購試樣的測試結(jié)果可知，該方法前處理操作簡便、快速，凈化效果好，精密度和準(zhǔn)確度高，檢測靈敏度優(yōu)于現(xiàn)行有效的國標(biāo)方法，很適用于大批量畜肉樣品中氯丙嗪的監(jiān)測。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國獸藥典委員會(huì).獸藥使用指南[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：183.

[2] 沈建忠，謝聯(lián)金. 獸醫(yī)藥理學(xué)[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000：155-157.

[3] 陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學(xué)[M]. 第2版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：10-158.

[4] 劉學(xué)劍. 畜產(chǎn)品中獸藥殘留的原因及控制[J]. 獸藥與飼料添加劑，2004，9（5）：1-3.

[5] 李銀生，曾振靈. 獸藥殘留的現(xiàn)狀與危害[J]. 中國獸藥雜志，2002，36（1）：29-33.

[6] 孔紅英. 吩噻嗪類抗精神藥物對神經(jīng)系統(tǒng)的副作用分析及處理[J]. 中國中醫(yī)資訊，2011，3（10）：230-230.

[7] 張春旺，潘心紅，馮彩群，等. 一起由氯丙嗪引起的食物中毒的快速測定[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2001，11（1）：109-112.

[8] 魯桂芳，滕青賢. 氯丙嗪不良反應(yīng)回顧[J]. 中國醫(yī)院用藥評價(jià)與分析，2007，7（5）：388-390.

[9] 劉 淳. 超搞效液相色譜法測定豬肉中氯丙嗪[J]. 科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2014，30：187-189.

[10] The Ministry of Agriculture Bulletin of PRC235（農(nóng)業(yè)部235號公告），2002.

[11] 龐國芳，宋文斌，董振霖，等.GB/T 20763-2006豬腎和肌肉組織中胰腺丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安殘留量的測定液相色譜=串聯(lián)質(zhì)譜法[C]//中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).2006，12：31.

[12] 馮 銳，梁 祈，詹若挺，等. 豬肉中氯丙嗪殘留量測定國家標(biāo)準(zhǔn)方法的優(yōu)化[J]. 醫(yī)學(xué)信息，2015，3（9）：124-124.

[13] 梁玉禧，李益珍，等. 液質(zhì)聯(lián)用法測定豬肉產(chǎn)品中違禁添加物氯丙嗪、異氯丙嗪和萬古霉素殘留研究[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2016，2：69-73.

[14] 劉建靜，楊曙明. 氯丙嗪殘留技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國獸牧獸醫(yī)雜志，2008，35（10）：141-144.

[15] 黃德鳳，Kim Van Tran，等. Oasis PRiME HLB-UPLC-MS/MS測定豬肉中78種獸藥殘留[J]. Oasis PRiME HLB食品應(yīng)用文集，2015，5：8-10.