大豆脫落酸受體基因家族鑒定、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化及表達(dá)模式分析

張兆涵　張?zhí)煨瘛⊥跞f鵬　解莉楠

摘要：【目的】鑒定大豆脫落酸受體基因（GmPYLs）家族成員，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化及表達(dá)模式分析，為深入研究該基因家族在大豆生長發(fā)育和非生物脅迫中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳詳M南芥PYLs基因（AtPYLs）家族成員序列為參考，從JGI和NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定出GmPYLs基因家族成員;利用生物信息學(xué)方法對該基因家族的組成、基因結(jié)構(gòu)、保守性、系統(tǒng)進(jìn)化、啟動子區(qū)順式作用元件及其編碼蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行全面分析，并基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對GmPYLs基因家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】從大豆全基因組序列中鑒定出21個GmPYLs基因，長度為500～4000 bp，分布在15條染色體上，編碼蛋白的氨基酸數(shù)量為178～267個，分子量為19457.11～29105.43 Da，理論等電點（pI）為4.82～7.23，均為親水蛋白，但穩(wěn)定性存在明顯差異，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。GmPYLs蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。GmPYLs基因家族成員可分為四大組，同一組成員基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的氨基酸序列、三級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和保守基序（motif）均相似。大豆、擬南芥、苜蓿和水稻的PYLs基因被分為五大類群（Ⅰ～Ⅴ），大豆、擬南芥、水稻和苜蓿的大多數(shù)PYLs基因歸于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類群;Ⅳ類群含少量的擬南芥和大豆PYLs基因，而Ⅴ類群僅含少部分苜蓿PYLs基因。擬南芥與大豆直系同源基因?qū)?shù)量多于擬南芥與苜蓿直系同源基因?qū)?shù)量。21個GmPYLs基因的啟動子序列主要包含響應(yīng)逆境脅迫、調(diào)節(jié)生長發(fā)育及響應(yīng)植物激素的順式作用元件，且所有GmPYLs基因的啟動子區(qū)至少含有1個植物激素響應(yīng)元件，其中，以含ABA響應(yīng)元件的GmPYLs基因數(shù)量最多。GmPYLs基因具有組織表達(dá)特異性，且品種間的表達(dá)模式也存在差異?！窘Y(jié)論】GmPYLs基因家族成員在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化上較保守，其基因組復(fù)制事件可能發(fā)生在豆科植物分化以后，且大部分GmPYLs基因被保留，在響應(yīng)非生物脅迫中存在廣泛的潛在機(jī)制，尤其與激素響應(yīng)密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 大豆;GmPYLs;基因家族;鑒定;系統(tǒng)進(jìn)化;非生物脅迫;表達(dá)分析

中圖分類號： S565.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1904-13

Identification，phylogenetic evolution and expression analysis of abscisic acid receptors gene family in Glycine max L. Merr

ZHANG Zhao-han， ZHANG Tian-xu， WANG Wan-peng， XIE Li-nan*

（College of Life Science， Northeast Forestry University/Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration，Ministry of Education， Harbin? 150040， China）

Abstract：【Objective】The abscisic acid receptor gene family in Glycine max L. Merr GmPYLs was identified by bioinformatics，and analyzed its evolution model and expression pattern. The purpose of this study was to provide a theoretical basis for in-depth study of the role of PYL gene in soybean development and abiotic stress. 【Method】The reported members of PYLs gene family in Arabidopsis thaliana（AtPYLs） were used as a reference，and the members of GmPYLs gene family were identified by JGI and NCBI databases. The gene family composition，gene structure，conservatism，evolutionary relationship，cis-acting element of promoter region， and its coding protein physicochemical properties and domain were analyzed by bioinformatics method. Based on high throughput transcriptome sequencing data，the expression patterns of GmPYLs gene family members were analyzed. 【Result】In this study，21 GmPYLs genes were identified from soybean whole genome sequence， which were distributed on 15 chromosomes with a sequence length of 500-4000 bp. The protein encoded was 19457.11-29105.43 Da in molecular weight， amino acids number was 178 to 267， theoretical isoelectric point（PI） was 4.82-7.23，which was hydrophilic protein mainly distributed in the cytoplasm. But the stability was different. The secondary structure of the protein was mainly α-helix and random coil. The GmPYLs gene family could be divided into four groups. In the same group，the gene structure，amino acid sequence of conded protein，protein tertiary structure，functional domain and conserved motif were very similar. The PYLs genes of G. max， Arabidopsis thaliana， Oryza sativa and Medicago truncatula were divided into five groups （Ⅰ-Ⅴ）. Most of the PYLs genes in G. max， Arabidopsis thaliana， Oryza sativa and Medicago truncatula were classified into groups Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ. Group IV contained a small amount of AtPYLs and GmPYLs genes， while group Ⅴ contained only a small part of MtrPYLs genes. The promoter sequences of 21 GmPYLs genes mainly contained cis-acting elements that responded to stress， regulate growth and respond to plant hormones. The promoter regions of all GmPYLs genes contained at least one hormone response element， of which the largest number of GmPYLs genes containing ABA response elements. The results of transcriptome sequencing analysis showed that GmPYLs gene had tissue-specific expression|， and there were differences in the expression patterns between different varieties. 【Conclusion】Members of the GmPYLs gene family are conservative in phylogenetic evolution， and their genome replication events may occur after legume differentiation， and most of the GmPYLs genes are retained. There are a wide range of potential mechanisms in response to abiotic stress， closely related to hormone response.

Key words： soybean; GmPYLs; gene family; identification; systematic evolution; abiotic stress; expression analysis

Foundation item： National Natural Science Foundation of China for Young Scholars（31801444）

0 引言

【研究意義】大豆（Glycine max L. Merr ）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有極高的營養(yǎng)價值，是人類獲取植物蛋白的主要來源，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。干旱、鹽堿和極端溫度等非生物脅迫嚴(yán)重制約大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。PYR（Pyrabactin resistance）/PYL（PYR1-like）/RCAR（Regulatory components of ABA receptor）（簡稱PYL）蛋白家族作為脫落酸（ABA）的直接受體，在響應(yīng)ABA介導(dǎo)的非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用（Ma et al.，2009;Park et al.，2009;Rodriguez et al.，2014）。因此，鑒定大豆PYLs基因（GmPYLs）家族成員，分析其進(jìn)化及表達(dá)模式，以期深入了解大豆響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制，對提高大豆抗脅迫能力具有重要竟義。【前人研究進(jìn)展】PYL蛋白位于ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的頂端，以抑制2C型蛋白磷酸酶（PP2C）活性作為主要調(diào)控方式（Park et al.，2009）。在缺乏ABA時，PYL蛋白不與PP2C結(jié)合，因此PP2C活性很高，從而阻止SNF1相關(guān)蛋白激酶2（SNF1-related protein kinases 2，SnRK2）及其下游因子的活化;當(dāng)存在ABA時，PYL結(jié)合PP2C，抑制PP2C活性（Melcher et al.，2009;Miyazono et al.，2009），被抑制的PP2C釋放SnRK2，隨后SnRK2磷酸化，激活A(yù)BA響應(yīng)元件結(jié)合因子（ABA-responsive elements bin-ding factors，ABFs），從而啟動下游因子響應(yīng)逆境（Soon et al.，2012）。因此，PYL蛋白在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮重要作用，間接調(diào)控植物響應(yīng)非生物脅迫（Miao et al.，2006;Yu et al.，2015）。迄今，已有較多有關(guān)PYLs基因的研究報道，陸續(xù)從擬南芥（Ma et al.，2009）、葡萄（Boneh et al.，2012）、水稻（He et al.，2014）、番茄（González-Guzmán et al.，2014）、玉米（李鴻杰等，2015）、橡膠樹（Guo et al.，2017）、棉花（Chen et al.，2017）和苜蓿（黃思源等，2019）中分別鑒定出14、8、13、14、21、27、13和14個PYL蛋白。其中，部分PYL蛋白的生物學(xué)功能已被驗證。如ABA以不依賴于AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2和AtPYL4的方式啟動擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中的MeJA信號（Ye et al.，2016）;過表達(dá)AtPYL4、AtPYL8和AtPYL13基因可增強(qiáng)擬南芥的耐旱性（Santiago et al.，2009;Fuchs et al.，2014;Pizzio et al.，2017;Quan et al.，2018）;過表達(dá)AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2和AtPYL3基因可提高擬南芥的抗旱性和水分利用率（Li et al.，2018）;過表達(dá)AtPYL5基因可降低干旱脅迫下擬南芥植株的蒸騰速率，減少水分損失，減輕氧化脅迫傷害，進(jìn)而提高光合作用效率（Quan et al.，2018）;AtPYR1和AtPYL2是脫落酸誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的關(guān)鍵受體（Dittrich et al.，2019）;AtPYL8和AtPYL9蛋白在擬南芥?zhèn)雀L中發(fā)揮重要作用（Zhao et al.，2014，2016）。此外，過表達(dá)玉米ZmPYL8、ZmPYL9和ZmPYL12基因可提高植株的耐寒性（He et al.，2018）;敲除水稻OsPYL1、OsPYL4和OsPYL6基因可提高水稻的產(chǎn)量（Miao et al.，2018）;過表達(dá)小麥TaPYL4基因可減少蒸騰作用并增強(qiáng)光合作用以提高水分利用效率和抗旱性（Mega et al.，2019）;玉米ZmPYL9基因響應(yīng)干旱脅迫和ABA誘導(dǎo)，導(dǎo)致該基因的表達(dá)量明顯提高（王延召等，2020）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對PYLs基因家族的研究主要集中在擬南芥、棉花、番茄、水稻和苜蓿等模式植物，雖然GmPYLs基因家族已被鑒定（Bai et al.，2013），但目前在JGI數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中尚未找到本研究鑒定得到的2個基因（GmPYL19和GmPYL22），也未進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以擬南芥PYLs基因（AtPYLs）家族成員序列為參考，利用JGI和NCBI數(shù)據(jù)庫從大豆全基因組鑒定出GmPYLs基因家族成員;利用生物信息學(xué)方法對該基因家族的組成、基因結(jié)構(gòu)、保守性、進(jìn)化關(guān)系、啟動子區(qū)順式作用元件及其編碼蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行全面分析，并基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對GmPYLs基因家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為探究該基因家族的生物學(xué)功能及其在大豆生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試大豆品種為Williams 82和Jack，由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。主要試劑：RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）、無水乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

1. 2 樣品采集及RNA提取

將大豆種子種植于溫室（26 ℃，光照14 h/黑暗10 h）中，待幼苗的第一片真葉充分展開后，選取長勢一致的幼苗，采集其頂端分生組織、真葉、上胚軸、下胚軸和根。每個組織設(shè)3個獨立的生物學(xué)重復(fù)，放入液氮速凍，提取總RNA。高通量轉(zhuǎn)錄組測序由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1. 2 GmPYLs基因家族鑒定

從TAIR數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）查找14個AtPYLs基因及其編碼蛋白的相關(guān)信息，并在JGI數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）進(jìn)行氨基酸序列同源比對，篩選出與AtPYLs蛋白同源的GmPYLs候選蛋白。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTp比對分析，最終確定GmPYLs基因家族成員，并命名。

1. 3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）中獲取苜蓿PYLs基因（MtrPYLs）家族成員和水稻PYLs基因（OsPYLs）家族成員編碼蛋白氨基酸序列。利用MEGA 10.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并使用Bootstrap（自展法）進(jìn)行3000次可信度檢測，分析GmPYLs基因家族與AtPYLs、MtrPYLs和OsPYLs基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1. 4 基因結(jié)構(gòu)及保守性分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得大豆全基因組序列信息，利用TBtools提取GmPYLs基因序列信息，采用GSDS（Gene structure display server）在線分析GmPYLs基因結(jié)構(gòu)。使用DNAMAN 6.0對GmPYLs、AtPYLs、MtrPYLs和OsPYLs蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對;利用MEME和TBtools分析GmPYLs蛋白的保守motif;并以SMART在線分析GmPYLs蛋白的結(jié)構(gòu)域。

1. 5 染色體定位與共線性分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取GmPYLs基因的染色體定位信息，利用MapChart繪制染色體定位圖。運用MCScanx和TBtools分析GmPYLs基因家族成員間及其與AtPYLs和MtrPYLs間的共線性關(guān)系，闡釋不同物種PYLs基因家族間的復(fù)制事件，確定直系同源基因和旁系同源基因。

1. 6 啟動子序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中提取GmPYLs基因家族成員起始密碼子上游2000 bp基因組序列，利用PlantCARE在線分析啟動子區(qū)順式作用元件。

1. 7 理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ProtParam在線分析GmPYLs和AtPYLs蛋白的分子量、等電點、穩(wěn)定性、親/疏水性等理化性質(zhì)。使用PSORT II Prediction預(yù)測GmPYLs蛋白的亞細(xì)胞定位情況;采用SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測GmPYLs蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)。

1. 8 表達(dá)特性分析

表達(dá)量數(shù)據(jù)由高通量轉(zhuǎn)錄組測序獲取，測序平臺為Illumina HiseqTM 2500，每個樣品產(chǎn)生6.0 Gb測序數(shù)據(jù)，測序方式為雙末端（PE）測序，讀長為150 bp，將轉(zhuǎn)錄組分析通用的FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）值作為基因的表達(dá)量，分析GmPYLs基因的組織表達(dá)特異性及品種間表達(dá)差異。

1. 9 統(tǒng)計分析

利用Excel 2016統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)，并采用T-test進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 GmPYLs基因家族鑒定及命名

根據(jù)氨基酸序列相似性比對及NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTp序列驗證，最終獲得21個GmPYLs基因，命名為GmPYL1～GmPYL21，其基因長度、染色體位置及編碼氨基酸數(shù)量如表1所示。21個GmPYLs基因序列長度為570～3927 bp，編碼蛋白的氨基酸數(shù)量為178～267個。

2. 2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

由圖1可知，大豆、擬南芥、苜蓿和水稻的PYLs基因被分為五大類群（Ⅰ～Ⅴ），其中，大豆、擬南芥、水稻和苜蓿的大多數(shù)PYLs基因歸屬于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類群，Ⅳ類群含少量的擬南芥和大豆PYLs基因，而Ⅴ類群只有少部分苜蓿PYLs基因，說明PYLs基因在植物進(jìn)化及分化過程中相對保守，在不同物種間未發(fā)生明顯變異;21個GmPYLs基因成員分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ類群中，其中，Ⅰ類群有8個成員，Ⅱ類群有6個成員，Ⅲ類群有5個成員，Ⅳ類群有2個成員;在Ⅰ～Ⅲ類群中，GmPYLs基因數(shù)量明顯多于AtPYLs基因數(shù)量，推測在十字花科和豆科植物分化后大豆全基因組發(fā)生復(fù)制事件并保留下較多基因。Ⅳ類群中GmPYLs基因數(shù)量少于AtPYLs基因數(shù)量，說明Ⅳ類群PYLs基因在大豆全基因組復(fù)制事件中可能發(fā)生丟失。故推測相同類群的基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域相似。

2. 3 GmPYLs基因家族的基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

由GmPYLs基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2-A）可知，21個GmPYLs基因可分為四大組（Ⅰ～Ⅳ），僅Ⅲ組中的5個GmPYLs基因存在內(nèi)含子，其他16個GmPYLs基因均無內(nèi)含子（圖2-B）。蛋白保守基序（motif）分析結(jié)果顯示，從GmPYLs和AtPYLs蛋白中共鑒定出10個保守motif（motif 1～motif 10）（圖2-C），長度為8～50個氨基酸（表2），其蛋白保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分布情況如圖2-D所示。所有GmPYLs蛋白共有的motif為motif 1、motif 2和motif 3，與多序列比對分析結(jié)果（圖3）一致。在同一組內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹同一節(jié)支點的基因具有相似的保守motif結(jié)構(gòu)（圖2-A和圖4）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，21個GmPYLs蛋白均包含1個共有的聚酮環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域2（Pfam：Polyketide_cyc2），部分GmPYLs蛋白含有3個特有的結(jié)構(gòu)域：聚酮環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域（Pfam：Polyketide_cyc）、樺樹花粉蛋白結(jié)構(gòu)域（Pfam：Bet_v_1）和過氧化物酶結(jié)構(gòu)域（Pfam：peroxidase）（圖4和表3）。其中，Pfam：peroxidase是GmPYL14蛋白所特有，說明其可能行使與其他GmPYLs基因不同的生物學(xué)功能，如負(fù)責(zé)清除葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中的過氧化氫及其他氧化有毒化合物等。

2. 4 GmPYLs基因家族的染色體定位及共線性分析結(jié)果

利用MapChart繪制GmPYLs基因家族成員在染色體上的位置，結(jié)果如圖5所示。21個GmPYLs基因分別位于1、2、3、4、6、7、8、9、11、13、14、15、16、17和18號染色體上，其中1號染色體上分布的GmPYLs基因數(shù)量最多，為3個，其次是6、7、13和14號染色體上分布的GmPYLs基因數(shù)量，均為2個，其他染色體僅包含1個基因。共線性和復(fù)制基因分析結(jié)果（圖6-A）顯示，GmPYL1/2/3/4、GmPYL5/6/7/8、GmPYL9/10/11、GmPYL12/13/14、GmPYL15/16、GmPYL17/19和GmPYL20/21均發(fā)生片段復(fù)制，且片段復(fù)制使基因數(shù)目增多，尤其是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類群的基因數(shù)目。在對擬南芥、大豆和苜蓿3個物種的直系同源基因進(jìn)行對比分析，結(jié)果（圖6-B）發(fā)現(xiàn)，擬南芥與大豆直系同源基因?qū)?shù)量多于擬南芥與苜蓿直系同源基因?qū)?shù)量，說明PYLs基因的基因組復(fù)制事件可能發(fā)生在豆科植物分化以后，且3個物種間直系同源基因?qū)?shù)量較多，也間接表明同源基因序列間高度的保守性和相似性。

2. 5 GmPYLs基因家族的啟動子區(qū)序列分析結(jié)果

為了預(yù)測GmPYLs基因家族的功能，對其啟動子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果（圖7）顯示，GmPYLs基因家族的啟動子序列主要包含響應(yīng)逆境脅迫、調(diào)節(jié)生長發(fā)育及響應(yīng)植物激素的順式作用元件。其中，響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件主要包括創(chuàng)傷響應(yīng)元件、防御和壓力響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件和干旱響應(yīng)元件，說明GmPYLs基因家族在響應(yīng)非生物脅迫方面存在廣泛的潛在機(jī)制，如GmPYL15基因啟動子區(qū)包含6個參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點，說明GmPYL15蛋白可能調(diào)節(jié)某些MYB相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，以響應(yīng)干旱脅迫。調(diào)節(jié)生長發(fā)育的順式作用元件包括種子特異性調(diào)控元件、頂端分生組織表達(dá)元件、晝夜節(jié)律調(diào)控元件及參與類黃酮生物合成基因調(diào)控的MYB結(jié)合位點，如GmPYL9和GmPYL12基因啟動子區(qū)包含種子特異性調(diào)控元件，GmPYL17基因啟動子區(qū)包含參與類黃酮生物合成基因調(diào)控的MYB結(jié)合位點。說明GmPYL9和GmPYL12基因可能在種子發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，而GmPYL17基因可能參與類黃酮合成。GmPYLs基因家族共含有5種植物激素響應(yīng)元件，包括ABA響應(yīng)元件、赤霉素（GAs）響應(yīng)元件、生長素（IAA）響應(yīng)元件、響應(yīng)茉莉酸甲酯（MeJA）應(yīng)答的元件和水楊酸（SA）響應(yīng)元件。其中，以含ABA響應(yīng)元件的GmPYLs基因數(shù)量最多，為15個，其次是含MeJA響應(yīng)元件的GmPYLs基因數(shù)量，為14個;GmPYL2、GmPYL16和GmPYL20基因均包含4個激素響應(yīng)元件，GmPYL13、GmPYL14、GmPYL17和GmPYL19基因均包含3個激素響應(yīng)元件，說明這7個基因在激素響應(yīng)方面可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2. 6 GmPYLs蛋白理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

GmPYLs蛋白理化性質(zhì)如表4所示。GmPYLs蛋白的分子量為19457.11～29105.43 Da，理論等電點（pI）4.82～7.23，均為親水蛋白，但穩(wěn)定性存在明顯差異，由此推測其在不同微環(huán)境中行使的功能。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，GmPYLs蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)（圖8-A）。利用SOPMA預(yù)測GmPYLs蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖8-B）表明GmPYLs蛋白二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其次是β-折疊，β-轉(zhuǎn)角最少。GmPYLs蛋白三級結(jié)如圖8-C所示，位于系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹節(jié)支點的GmPYLs蛋白具有類似三級結(jié)構(gòu)，如GmPYL1～GmPYL4具有相似三級結(jié)構(gòu)，GmPYL5～ GmPYL8也存在相似的三級結(jié)構(gòu)，因此推測三級結(jié)構(gòu)相似的GmPYLs蛋白具有相似的生物學(xué)功能。

2. 7 GmPYLs基因家族的表達(dá)特異性分析結(jié)果

鑒于幼苗子葉期是大豆受非生物脅迫最敏感的階段，本研究選取2個代表性的大豆品種Williams 82和Jack分析其GmPYLs基因家族成員在子葉期幼苗的頂端分生組織、真葉、上胚軸、下胚軸和根中的表達(dá)模式。品種間的表達(dá)量差異分析結(jié)果（圖9）顯示，品種間基因表達(dá)量差異極顯著（P<0.01）的基因包括頂端分生組織中的GmPYL1、GmPYL15和GmPYL19基因，真葉中的GmPYL4、GmPYL9、GmPYL10、GmPYL11、GmPYL16和GmPYL19基因，上胚軸中的GmPYL1、GmPYL2、GmPYL3和GmPYL9基因，下胚軸中的GmPYL1、GmPYL3、GmPYL4、GmPYL9、GmPYL10、GmPYL11和GmPYL15基因，以及根中的GmPYL1、GmPYL3、GmPYL4、GmPYL9、GmPYL10、GmPYL11、GmPYL13、GmPYL14、GmPYL15、GmPYL16和GmPYL19基因。組織特異性表達(dá)結(jié)果（圖10）顯示，GmPYLs基因具有組織表達(dá)特異性，Williams 82中的GmPYL1和GmPYL9基因分別在上胚軸和真葉表達(dá)，且其表達(dá)量均高于其他器官，Jack中的GmPYL10基因在根中表達(dá)量均高于其他器官，說明GmPYL9和GmPYL10基因不僅具有組織器官特異性，還在品種間差異表達(dá);GmPYL19基因在5個組織中的表達(dá)量均表現(xiàn)為Jack高于Williams 82，說明GmPYL19基因可能在Jack品種響應(yīng)非生物脅迫方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。此外，Williams 82和Jack品種間在根中的差異表達(dá)基因居多，且大多數(shù)基因表達(dá)量表現(xiàn)為Jack高于Williams 82，說明這2個品種根中的工作基因存在明顯差異;GmPYL5、GmPYL6、GmPYL7、GmPYL8、GmPYL20和GmPYL21在2個品種中的表達(dá)量非常低，說明這些基因功能可能已冗余，或不在子葉期表達(dá)。

3 討論

本研究中GmPYLs基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化和序列保守性分析結(jié)果顯示，21個GmPYLs基因分成四大組，同一組中的基因結(jié)構(gòu)較相似，且系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中同一節(jié)支點內(nèi)保守motif和三級結(jié)構(gòu)也高度相似，故推測同組基因具有類似的調(diào)控功能。前人的研究也發(fā)現(xiàn)，AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2和AtPYL3基因均能促進(jìn)ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉（Nishimura et al.，2010;Wang et al.，2013;Yin et al.，2013）。本研究的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，GmPYL1、GmPYL2、GmPYL3、GmPYL4與AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2、AtPYL3基因直系同源，暗示這些基因可能也具有促進(jìn)ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉生物學(xué)功能。GmPYLs蛋白均包含Pfam：Bet_v_1、Pfam：Polyketide_cyc和Pfam：Polyketide_cyc2結(jié)構(gòu)域，其中，Pfam：peroxidase是GmPYL14基因所特有，說明GmPYL14蛋白可能在GmPYLs基因家族中具有除響應(yīng)ABA信號以外的其他功能。由于Pfam：peroxidase結(jié)構(gòu)域在植物中主要負(fù)責(zé)清除葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中的過氧化氫及其他氧化有毒化合物，且參與細(xì)胞壁生物合成、傷害防御反應(yīng)、IAA分解代謝及乙烯生物合成等（http：//pfam.xfam.org/family/peroxidase），故推測GmPYL14蛋白也具有相似功能。Pfam：Polyketide_cyc和Pfam：Polyketide_cyc2是START結(jié)構(gòu)域超家族成員，其蛋白折疊具有保守的配體結(jié)合模式，以適應(yīng)各種催化活性和非催化調(diào)節(jié)功能;Pfam：Bet_v_1是樺樹花粉蛋白結(jié)構(gòu)域（Ma et al.，2009），與Pfam：Polyketide_cyc結(jié)構(gòu)域同源（Iyer et al.，2001），且在位置上互相重疊。這些結(jié)構(gòu)域是PYL蛋白作為ABA直接受體的關(guān)鍵，通過結(jié)合PP2C而負(fù)調(diào)控ABA核心信號通路（Fujii et al.，2009）。由于大豆是古四倍體生物，在基因家族中存在一定程度上的功能冗余，對同一組別的GmPYLs基因進(jìn)行多基因編輯，有利于高效實現(xiàn)研究目標(biāo)。

本研究的GmPYLs基因啟動子順式作用元件分析結(jié)果顯示，Ⅲ組中的GmPYL17、GmPYL18和GmPYL19基因位于系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹同一節(jié)支點上，均包含IAA響應(yīng)元件。而前人的研究結(jié)果表明，AtPYL8以不依賴于ABA核心信號通路（PYL-PP2C-SnRK2）的方式促進(jìn)響應(yīng)IAA的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而解除ABA核心信號通路對側(cè)根生長的抑制，促進(jìn)側(cè)根生長（Zhao et al.，2014）。本研究中不同物種的PYLs基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，GmPYL17、GmPYL18和GmPYL19基因與AtPYL8基因歸于Ⅲ類群，表明四者親緣關(guān)系較近。由此推測，GmPYL17、GmPYL18和GmPYL19基因可能在大豆中也參與調(diào)控側(cè)根生長。本研究還發(fā)現(xiàn)，所有GmPYLs基因至少包含1個植物激素響應(yīng)元件，而植物激素信號是響應(yīng)干旱或水分不足的關(guān)鍵，故推測GmPYLs基因家族在干旱響應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

PYL作為ABA的直接受體，參與植物多種非生物脅迫響應(yīng)。前人的研究結(jié)果表明，AtPYL5基因過表達(dá)可降低干旱脅迫下植株的蒸騰速率，減少水分損失，減輕氧化脅迫傷害，進(jìn)而提高光合作用（Quan et al.，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，GmPYL9基因在葉中的表達(dá)量較高，在今后的研究中可深入探究其表達(dá)量與光合速率和蒸騰速率的相關(guān)性。此外，AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2和AtPYL3基因過表達(dá)可提高擬南芥的抗旱性和水分利用率（Li et al.，2018）。在本研究構(gòu)建的不同物種PYLs基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，GmPYL1～GmPYL8基因與上述基因同歸于Ⅰ類群，故推測這些基因也具有類似的生物學(xué)功能，可提高大豆的抗旱性和水分利用率。本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，GmPYLs基因家族具有組織表達(dá)特異性，且品種間的表達(dá)模式也存在差異。與大豆不同器官轉(zhuǎn)錄組在線數(shù)據(jù)（http：//bar.utoronto.ca/eplant/）（Libault et al.，2010）相比，本研究中GmPYLs基因家族成員具有相似的表達(dá)模式，證明本研究結(jié)果的可靠性。

PYLs是植物中復(fù)雜且龐大的基因家族。通過對模式植物擬南芥在逆境脅迫下的生理和分子水平進(jìn)行分析，研究人員揭示了植物如何通過ABA應(yīng)對干旱脅迫，包括對基因表達(dá)進(jìn)行重新編程、關(guān)閉氣孔及調(diào)節(jié)滲透等，最終實現(xiàn)植株適應(yīng)性生長發(fā)育（Gong et al.，2020）?；谏鲜鲋参锟鼓娣肿訖C(jī)理研究對重要經(jīng)濟(jì)作物進(jìn)行遺傳改良，從而獲得高抗逆性植物材料。本研究利用大豆基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對GmPYLs基因家族進(jìn)行全面分析，為研究GmPYLs基因響應(yīng)非生物脅迫和生長發(fā)育的機(jī)制及GmPYLs基因的定向研究提供了理論依據(jù)。在后續(xù)研究中，應(yīng)對GmPYLs基因家族成員進(jìn)行多重基因編輯，分析其對大豆生長發(fā)育及應(yīng)對非生物脅迫具體表型效應(yīng)影響。

4 結(jié)論

GmPYLs基因家族成員在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化上較保守，其基因組復(fù)制事件可能發(fā)生在豆科植物分化以后，且大部分GmPYLs基因被保留，在響應(yīng)非生物脅迫中存在廣泛的潛在機(jī)制，尤其與激素響應(yīng)密切相關(guān)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）

收稿日期：2020-05-13

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31801444）

作者簡介：*為通訊作者，解莉楠（1977-），博士，副教授，主要從事植物抗逆生物學(xué)研究工作，E-mail：linanxie@nefu.edu.cn。張兆涵（1994-），研究方向為大豆抗逆生物學(xué)，E-mail：zhangzhaohan@nefu.edu.cn