荷梗對慢性應(yīng)激小鼠的抗抑郁作用及其對TPH2 和β CaMKII 表達的影響

張延紅 曹亞飛 趙亞男 平 鑫 張少丹 裴 林

（1.河北中醫(yī)學(xué)院， 河北 石家莊050031； 2.華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 河北 唐山063000； 3.河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 河北 保定071051； 4.河北省中醫(yī)藥科學(xué)院， 河北省濁毒證重點實驗室， 河北 石家莊050031）

抑郁癥是一種常見的慢性精神障礙性疾病，嚴重影響人的思維，情緒和身體健康［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WTO）預(yù)測到2030 年全球?qū)⒂?.5 億人罹患抑郁癥，且抑郁癥在各個年齡段均可患病，其特點是情緒低落，缺乏活力，睡眠障礙，并在一定程度上伴有生活或工作能力的下降［2］。然而，到目前為止抑郁癥的臨床用藥并沒有得到令人滿意的效果［3］。

荷梗屬于睡蓮科蓮亞科植物睡蓮的葉柄及花柄，又稱藕桿、蓮蓬桿、荷葉梗，味苦，性平，入脾、膀胱經(jīng)，功效通氣寬胸、和胃安胎，主治外感暑濕、胸悶不暢、妊娠嘔吐、胎動不安［4］。本課題前期臨床和實驗研究表明，含有荷梗的中藥復(fù)方具有很好的抗抑郁作用［5］；本研究采用慢性不可預(yù)見性溫和刺激復(fù)制抑郁癥小鼠模型，探索荷梗的抗抑郁效應(yīng)及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級健康雄性ICR 小鼠40 只，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（冀）2018?004，鼠齡7 周左右，體質(zhì)量（30±5）g。

1.2 試劑與藥物 荷梗（批號180901）由河北中醫(yī)藥科學(xué)院附屬醫(yī)院提供，經(jīng)河北省師范大學(xué)趙建成教授鑒定為正品，稱定100 g 于10 倍量蒸餾水中浸泡1 h，溫火煎煮2次，每次25～30 min，2 次濾液混勻后濃縮至生藥量2、1 g／mL，再次過濾、分裝，4 ℃保存?zhèn)溆茫环?汀片（20 mg，法國生產(chǎn)，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號J20170022）。Anti?TPH2 antibody（英國Abcam 公司，批號ab6336）；Anti?β CaMKII antibody（英國Abcam 公司，批號ab1806）；PV?9001 兔二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號K182430C）；PV?9003 山羊二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號K1824231）。

1.3 儀器 CX41 生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；RM2245 旋轉(zhuǎn)式切片機（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 小鼠抑郁模型制備 參照前期實驗方法［6］稍作改良。除正常組外共用14 種應(yīng)激刺激方法，分別為晝夜顛倒24 h、束縛2 h、禁食24 h、噪音2 h、禁水24 h、傾斜24 h、空籠24 h、冰水游泳5 min、異味24 h（每周不同）、搖晃5 min、潮濕24 h、熱水游泳5 min、夾尾1 min、異物24 h（每周不同）。每天隨機選取2 種進行，刺激方式不可預(yù)見，持續(xù)21 d。

2.2 分組、給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，小鼠根據(jù)糖水偏愛分數(shù)隨機分為正常組、模型組、氟西汀組及荷梗低、高劑量組，每組8 只。造模結(jié)束后，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，陽性對照組給予氟西?。?0 mg／kg）灌胃，荷梗高、低劑量濃度比為2 ∶1，分別為0.4、0.2 g／kg，每天1 次，給藥21 d。

2.3 糖水偏愛實驗 參照前期文獻報道，稍作改良［7］。小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間進行糖水訓(xùn)練，第1 天每籠均放2 瓶1%蔗糖水，第2 天一瓶為1%蔗糖水，一瓶為純水，之后禁食禁水24 h，第4 天給予一瓶1% 蔗糖水、一瓶純水，24 h后測糖水消耗，計算糖水偏好，公式為糖水偏好＝（糖水消耗／總液體消耗）×100%，正式實驗于給藥21 d 后檢測。

2.4 強迫游泳實驗 強迫游泳試驗是參照Lin 等［8］的實驗方法設(shè)計。在正式測試前1 d，小鼠放入高50 cm、長20 cm 的玻璃器皿（水溫25 ℃左右）中適應(yīng)性游泳訓(xùn)練15 min，正式實驗時記錄6 min 內(nèi)出現(xiàn)靜止不動的潛伏期和靜止不動時間（后4 min），靜止的標準是小鼠僅有頭部露出水面，或只做為保持平衡四肢微微波動的動作。

2.5 曠場實驗 參照前人研究［9］，曠場實驗需在安靜、光線暗的環(huán)境中進行。在正式試驗前，所有小鼠均需在曠場（60 cm×60 cm，正方形底面等分成5 cm×5 cm 方格）內(nèi)適應(yīng)1 h，正式實驗時從曠場中央?yún)^(qū)域放入，由動物行為分析系統(tǒng)記錄5 min 內(nèi)小鼠在中央?yún)^(qū)累計行走距離、在中央?yún)^(qū)停留時間和反復(fù)進入中央?yún)^(qū)的次數(shù)。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測 行為學(xué)測試結(jié)束后，所有小鼠用10%水合氯醛（5 mg／kg）腹腔麻醉，生理鹽水透心灌流至肝臟發(fā)白后用4%多聚甲醛灌注，取全腦組織用于免疫組化，石蠟切片透明、脫蠟至水，經(jīng)微波加熱抗原修復(fù)，山羊血清室溫封閉30 min，分別對應(yīng)腦部位滴加Anti?TPH2抗體（1 ∶300）和Anti?β CaMKII 抗體（1 ∶200），置于4 ℃冰箱中12 h，PBS 洗3 次，5 min／次，分別對應(yīng)滴加山羊抗兔IgG 和兔抗山羊IgG（二抗稀釋倍數(shù)均為1 ∶200），室溫下孵育30 min，PBS 溶液沖洗3 次，5 min／次，DAB顯色反應(yīng)3～5 min，水洗10 min 終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，封片，CX41 顯微照相系統(tǒng)觀察，每只小鼠取5 張腦片，計數(shù)各組中縫背核TPH2 和外側(cè)韁核CaMKII β 的免疫陽性細胞數(shù)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩兩比較如果方差齊則采用SNK?q 檢驗，如果方差不齊則采用Kruskal?Wallis 非參數(shù)檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 糖水偏愛 與正常組相比，模型組糖水偏愛分數(shù)減少（P＜0.01）；與模型組相比，氟西汀組及荷梗高劑量組糖水偏愛分數(shù)增加（P＜0.01），而且荷梗劑高劑量組與氟西汀組相比無差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠糖水偏愛分數(shù)的比較（， n＝8）

表1 各組小鼠糖水偏愛分數(shù)的比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 強迫游泳 與正常組相比，模型組小鼠強迫游泳不動時間延長，潛伏期縮短（P＜0.01）；與模型組相比，荷梗各劑量組、氟西汀組小鼠迫游泳不動時間縮短，潛伏期延長（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠強迫游泳不動時間和潛伏期的比較（，n＝8）

表2 各組小鼠強迫游泳不動時間和潛伏期的比較（，n＝8）

注：與正常組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 曠場實驗 與正常組相比，模型組小鼠在中央?yún)^(qū)行走距離、中央?yún)^(qū)停留時間減短，反復(fù)進入中央?yún)^(qū)次數(shù)減少（P＜0.01）；與模型組相比，荷梗各劑量組、氟西汀組小鼠在中央?yún)^(qū)行走距離、在中央?yún)^(qū)停留時間增長，反復(fù)進入中央?yún)^(qū)的次數(shù)增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠中央?yún)^(qū)行走距離、中央?yún)^(qū)停留時間、反復(fù)進入中央?yún)^(qū)次數(shù)的比較（， n＝8）

表3 各組小鼠中央?yún)^(qū)行走距離、中央?yún)^(qū)停留時間、反復(fù)進入中央?yún)^(qū)次數(shù)的比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 相應(yīng)腦區(qū)TPH2、β CaMKII 表達 與正常組相比，模型組小鼠中縫背核TPH2 的陽性細胞數(shù)量減少，外側(cè)韁核β CaMKII 的陽性細胞數(shù)量增多（P＜0.01）；與模型組相比，荷梗各劑量組和氟西汀組小鼠中縫背核TPH2 陽性細胞數(shù)量增多（P＜0.01），外側(cè)韁核βCaMKII 的陽性細胞數(shù)量減少（P＜0.05）。見表4、圖1。

4 討論

一般認為，應(yīng)激是誘發(fā)抑郁癥的一個重要因素，慢性不可預(yù)見性溫和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）［10］建立小鼠的抑郁模型是一種常見的動物模型，該模型動物的行為表現(xiàn)與人類抑郁癥的表現(xiàn)高度相似。本研究觀察到，模型組小鼠的糖水偏愛分數(shù)顯著降低，證實造模成功，且模型組小鼠的強迫游泳不動時間明顯增加，強迫游泳潛伏期顯著縮短，用臨床上公認的西藥氟西汀作為陽性對照藥，來驗證中藥荷梗的抗抑郁作用。曠場實驗可檢測小鼠在新異環(huán)境中的探究行為、緊張恐懼狀態(tài)和對新環(huán)境的警覺性。本研究中，運動能力和探索行為能力的下降是抑郁癥小鼠出現(xiàn)的典型表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，中藥荷梗組尤其高劑量組小鼠在中央?yún)^(qū)累計行走距離及在中央?yún)^(qū)停留時間顯著增長，反復(fù)進入中央?yún)^(qū)的次數(shù)顯著增多，且與氟西汀組相當，說明荷梗可以改善動物抑郁樣行為和認知。

表4 各組小鼠TPH2、β CaMKII 陽性細胞數(shù)的比較（， n＝8）

表4 各組小鼠TPH2、β CaMKII 陽性細胞數(shù)的比較（， n＝8）

注：與正常組相比，??P ＜0.01；與模型組相比，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖1 各組小鼠TPH2、β CaMKII 表達（免疫組化染色，×200）

研究表明，5?羥色胺（5?HT）系統(tǒng)異常與抑郁癥、焦慮癥、厭食癥、失眠、晝夜節(jié)律紊亂、內(nèi)分泌功能障礙等密切相關(guān)［11］。色氨酸羥化酶（TPH）是5?HT 合成途徑中的限速酶，色氨酸羥化酶2（TPH2）是色氨酸羥化酶（TPH）的一個亞型，是5?TH 神經(jīng)元的特異性標志物之一［12］。據(jù)報道，TPH2 在中縫背核（DRN）中特異性表達，其含量減少會直接影響5?TH 的代謝功能，導(dǎo)致情感障礙和自殺行為［13］。韁核是邊緣前腦和邊緣中腦聯(lián)系的重要節(jié)點，可分為內(nèi)側(cè)韁核（Medial habenula，MHb）和外側(cè)韁核（Lateral habenula，LHb）。鈣／鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II亞單位β（β CaMKII）是一種鈣依賴性蛋白激酶，在部位表達上具有韁核特異性。LHb 和DRN 在調(diào)節(jié)抑郁中發(fā)揮重要作用。這兩個區(qū)域在結(jié)構(gòu)和功能上有著密切的聯(lián)系。LHb 在應(yīng)激條件下過度活躍，向下游的投射信號增強，可直接投射到DRN，抑制5?HT 的釋放，從而導(dǎo)致抑郁的發(fā)生［14］。而LHb 在應(yīng)激條件下被過度活化，可能是由于突觸前膜谷氨酸釋放增加，上調(diào)β CaMKII，提高興奮性突觸在AMPA 型受體的傳播，而且LHb 可以直接控制DRN，并直接影響多巴胺能和5?HT 能的大腦系統(tǒng)，這些系統(tǒng)涉及多種大腦功能和神經(jīng)精神疾病，比如抑郁癥。目前認為韁核是調(diào)節(jié)厭惡行為和逃避行為的關(guān)鍵腦區(qū)，中縫背核是調(diào)節(jié)獎賞行為的關(guān)鍵腦區(qū)。外側(cè)韁核和中縫背核之間有往返纖維，這表明對于某種刺激，小鼠選擇厭惡性逃避還是進一步探索，可能是上述腦區(qū)協(xié)同調(diào)節(jié)的結(jié)果。如果外側(cè)韁核神經(jīng)元有更多活化，對中縫背核的抑制可能增加，表現(xiàn)為探索行為減少。反之，獎賞環(huán)路活化，探索行為增加。實驗結(jié)果表明，與正常組相比，模型組小鼠腦內(nèi)β CaMKII 的表達明顯增多，TPH2 的表達顯著減少，此結(jié)果與之前報道吻合［15］。與模型組相比，中藥荷梗各劑量組小鼠腦內(nèi)β CaMKII的表達明顯減少，TPH2 的表達顯著增多，且荷梗高劑量組的表達水平與西藥氟西汀組相當。由此推斷荷梗的抗抑郁作用機制可能與調(diào)節(jié)外側(cè)韁核中β CaMKII 及中縫核中TPH2 水平的表達有關(guān)。

綜上所述，荷梗對CUMS 小鼠具有抗抑郁作用，而通過抑制β CaMKII 的過度活化，從而減少對TPH2 的抑制可能是其作用機制之一。