富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域1（LRIG1）基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)、信號(hào)通路及其與預(yù)后的關(guān)系

黃 鑫， 滑 峰

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因，吸煙被認(rèn)為是主要的危險(xiǎn)因素，吸煙者占所有肺癌患者的70%～90%[1]。雖然肺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并受多因素影響，但環(huán)境和遺傳因素在肺癌的發(fā)病中起重要作用[2]。

肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。SCLC起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，約占所有原發(fā)性肺癌的15%。NSCLC一般起源于支氣管或肺泡細(xì)胞，是最常見(jiàn)的原發(fā)性肺癌。肺癌患者預(yù)后較差，5年生存率較低，重要原因是大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已發(fā)展至晚期，往往不能通過(guò)手術(shù)切除達(dá)到治愈的目的[3]。因此，探尋NSCLC患者預(yù)后的影響因素，是目前NSCLC的研究熱點(diǎn)。既往認(rèn)為，NSCLC的臨床分期、病理類型是影響患者生存期的重要因素[4]。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，眾多腫瘤預(yù)后影響因子被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)研究顯示，富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域1（LRIG1）基因高表達(dá)可能與腫瘤的預(yù)后較好有關(guān)[5]。而LRIG1在NSCLC中的研究鮮有報(bào)道，其與NSCLC預(yù)后的關(guān)系不清。本研究首先采用生物信息方法分析LRIG1基因在NSCLC中的表達(dá)、相關(guān)生物學(xué)功能及其與患者生存期的關(guān)系，然后采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)96例NSCLC組織標(biāo)本，對(duì)生物信息分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 LRIG1表達(dá)水平分析 檢索癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)比各組織及人體各種惡性腫瘤中LRIG1基因的mRNA表達(dá)水平。檢索分析條件為“肺癌” “非小細(xì)胞肺癌” “肺鱗癌”“肺腺癌”“LRIG1”，物種為人類。

1.2 LRIG蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用蛋白相互作用（STRING）數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建LRIG1蛋白相互作用的蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)，LRIG1蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為置信度大于0.9，相互作用來(lái)源為共表達(dá)、基因功能和比鄰關(guān)系[6]。

1.3 LRIG1基因功能富集 對(duì)LRIG1基因相互作用蛋白功能進(jìn)行富集，富集包括生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分。分別計(jì)數(shù)上述過(guò)程的基因數(shù)量和背景基因數(shù)量及其P值。富集過(guò)程應(yīng)用在線分析軟件WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit進(jìn)行[7]，富集條件為基因計(jì)數(shù)不少于3個(gè)，P<0.05。

1.4 免疫組化檢測(cè)LRIG1蛋白表達(dá) 選取在我院手術(shù)治療的NSCLC患者96例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法按試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)NSCLC患者癌組織和癌旁組織中LRIG1蛋白表達(dá)水平，探討其表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系。

1.5 LRIG1蛋白高低表達(dá)判斷 在顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察。染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色(0分)、淺黃(1分)、棕黃(2分)、棕褐色(3分)；陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性<10%(0分)；陽(yáng)性10%～25%(1分)；陽(yáng)性26%～50%(2分)；陽(yáng)性51～75%(3分)及陽(yáng)性>75%(4分)。總體評(píng)分值=陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分。最終評(píng)判：<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用軟件GEPIA進(jìn)行在線分析，定量數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，比較采用卡方檢驗(yàn)，依據(jù)LRIG1基因mRNA在癌組織中表達(dá)的中位數(shù)將本組患者分為高表達(dá)組、低表達(dá)組，繪制兩組患者生存曲線，log-rank檢驗(yàn)比較兩組總生存期和無(wú)疾病進(jìn)展生存期，P<0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LRIG1基因表達(dá) 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，胰腺、腦皮質(zhì)和直腸等組織中LRIG1基因表達(dá)水平較高，而在骨髓、淋巴細(xì)胞和胸腺等組織中表達(dá)水平較低，圖1A；在腫瘤患者中，LRIG1基因在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和前列腺癌中表達(dá)水平較高，圖1B；在NSCLC組織中，LRIG1基因在癌旁正常組織中表達(dá)水平較高，而在癌組織中表達(dá)較低，圖1C。

圖1 不同組織中的LRIG1基因mRNA表達(dá)水平比較

2.2 LRIG1蛋白-蛋白相互作用 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)建立與LRIG1蛋白相互作用的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，選取了與LRIG1蛋白相互作用較為緊密的10個(gè)基因編碼蛋白10個(gè)，蛋白間相互作用關(guān)系edge=45，區(qū)域聚類指數(shù)為0.874，與LRIG1蛋白相互作用較為緊密的10蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)富集顯著（P<0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 與LRIG1蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

2.3 LRIG1基因共表達(dá) TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)LRIG1基因共表達(dá)基因進(jìn)行了分析[8]（圖3），其中CACNA1D基因與LRIG1基因正向共表達(dá)最為明顯（r=0.51，P<0.05），而RGS20基因與LRIG1基因負(fù)向共表達(dá)最為明顯（r=–0.49,P<0.05），圖4。

圖3 LRIG1基因共表達(dá)分析

圖4 LRIG1共表達(dá)正負(fù)相關(guān)基因散點(diǎn)圖

2.4 功能富集 LRIG1基因生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能主要分別富集于表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控、胞質(zhì)囊泡部和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶活性等，見(jiàn)表1。

表1 LRIG1及其共表達(dá)基因相關(guān)生物學(xué)過(guò)程

2.5 京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路 LRIG1基因相關(guān)信號(hào)通路主要富集于癌癥中的蛋白多糖、內(nèi)吞作用、MAPK信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、RAP1信號(hào)通路、癌癥的途徑和ras信號(hào)通路等，見(jiàn)圖5。

2.6 生存分析 LRIG1基因mRNA高表達(dá)組患者的總生存期高于低表達(dá)組（HR=0.74,P<0.05），而兩組的無(wú)疾病進(jìn)展生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=1.0,P=0.97），見(jiàn)圖 6。

2.7 LRIG1蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 LRIG1蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞漿，陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)棕褐色顆粒，均勻分布[9]，圖7。LRIG1蛋白在NSCLC癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為57.3%（55/96），低于癌旁正常組織中的81.3%（78/96）（P<0.05）。LRIG1蛋白高表達(dá)與NSCLC患者臨床分期、腫瘤大小和縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），見(jiàn)表2。

圖5 LRIG1及相關(guān)基因KEGG信號(hào)通路氣泡圖

圖6 LRIG1基因mRNA表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者總生存期和無(wú)疾病進(jìn)展生存期的關(guān)系

圖7 免疫組化檢測(cè)LRIG1蛋白在NSCLC癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況

表2 LRIG1蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

人類富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（LRIG）基因家族由LRIG1、LRIG2、LRIG共3個(gè)基因組成[10]。以往多項(xiàng)研究表明LRIG1可能在人類癌癥中起到抑癌作用。LRIG1與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）相互作用，增強(qiáng)其配體刺激的泛素化和降解[11-12]。因此，LRIG1負(fù)性調(diào)節(jié)EGFR，并增加膀胱癌和食管癌對(duì)鉑類抗癌藥物的敏感性。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、宮頸癌及口咽癌中，高LRIG1表達(dá)與患者預(yù)后較好有關(guān)，并與更長(zhǎng)的無(wú)病生存期和（或）總生存期相關(guān)[13]。

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因，每年占新增病例13%和死亡病例18%的肺癌被診斷為NSCLC，占所有肺癌病例的80%以上[14]。LRIG1在肺癌中的研究報(bào)道較少，LRIG1蛋白在正常人肺細(xì)胞中有表達(dá)，但與相應(yīng)的正常組織相比，某些腫瘤細(xì)胞株的LRIG1表達(dá)下調(diào)。而LRIG1在肺癌患者組織中表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系研究報(bào)道較少。

An等[15]采用定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組化法證實(shí)LRIG1 mRNA及蛋白在NSCLC患者中的表達(dá)與腫瘤的病理類型、分化程度和分期有關(guān)。生存分析顯示LRIG1是NSCLC患者總生存期的獨(dú)立影響因素，LRIG1高表達(dá)患者預(yù)后較好。而房艷紅等[16]研究顯示LRIG1基因高表達(dá)患者的臨床分期較晚，預(yù)后不良。因此LRIG1與NSCLC患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系存在爭(zhēng)議。本研究發(fā)現(xiàn)LRIG1mRNA在癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織，與LRIG1在肺癌細(xì)胞系中的研究結(jié)果一致。且LRIG1蛋白高表達(dá)與NSCLC患者臨床分期、腫瘤大小及縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。LRIG1高表達(dá)患者的總生存期較長(zhǎng)。

綜上，LRIG1在NSCLC患者癌組織中呈高表達(dá)并可作為NSCLC患者預(yù)后較好的分子標(biāo)志物。同時(shí)，上調(diào)NSCLC患者LRIG1基因表達(dá)水平，可能成為NSCLC靶向藥物研發(fā)的方向。