澳洲鴿子石斛蘭花梗芽組織培養(yǎng)技術(shù)研究

陳和明 江南 呂復(fù)兵 肖文芳 李佐 朱根發(fā)

摘? 要：以澳洲鴿子石斛蘭（Dendrobium kingianum Bidwill）的花梗為外植體，研究花梗芽的誘導(dǎo)、增殖和生根情況。結(jié)果表明：在1號誘導(dǎo)培養(yǎng)基[MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%椰子汁（CM）]和2號誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+10% CM）中均能誘導(dǎo)出芽，盡管在誘導(dǎo)過程中70.6%帶節(jié)間的花梗莖段因不能誘導(dǎo)出側(cè)芽或側(cè)芽弱小而死亡，但為種苗生產(chǎn)和種質(zhì)資源的保護提供了一種有效途徑。在增殖培養(yǎng)過程中，2號增殖培養(yǎng)基（MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM）有利于增殖培養(yǎng);在生根壯苗過程中，生根培養(yǎng)基（1/2 MS+NAA 0.3～0.5 mg/L+10% CM）適宜澳洲鴿子石斛蘭‘金斯卡的生根培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：澳洲鴿子石斛蘭;花梗;組織培養(yǎng);誘導(dǎo);增殖;壯苗生根

中圖分類號：S682.31? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： The induction and proliferation and rooting tests of Dendrobium kingianum Bidwill were studied using pedicel shoots as the explant. The two induction media of MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10% CM and MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+10% CM could induce buds. 70.6% pedicels died without lateral buds induced or lateral buds too weak， but it provided an effective way for seedling production and germplasm resources protection. In the proliferation culture， the medium of MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM was beneficial to proliferation culture. In the rooting and growth culture， the medium of 1/2 MS+NAA 0.3-0.5 mg/L+10% CM was suitable for the rooting culture of D. kingianum ‘Jinsika （DJ）.

Keywords： Dendrobium kingianum Bidwill; pedicel; tissue culture; induction; proliferation; rooting

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.004

澳洲鴿子石斛蘭（Dendrobium kingianum Bidwill）是蘭科植物石斛屬（Dendrobium）澳洲鴿石斛組（Section Dendrocryne）中觀賞性較高的原種之一[1]，原產(chǎn)于澳大利亞東部、新加勒多尼亞島等地[2-3]。其植株長勢好、花小且色彩艷麗，抗性較強。當前，國內(nèi)外對澳洲鴿子石斛蘭的組培研究并不多，莫遠琪等[1]以澳洲鴿子石斛蘭幼嫩假鱗莖為外植體進行了組織培養(yǎng)和快速繁殖研究，Pra?ak等[4-6]利用金屬元素和光照等對澳洲鴿子石斛類原球莖的增殖和生長進行了研究，Habiba等[7-8]研究了不同化學(xué)物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑及不同光源對澳洲鴿子石斛類原球莖生長的影響等。至今，澳洲鴿子石斛蘭主要以幼嫩假鱗莖或類原球莖為外植體進行組培快繁，但利用假鱗莖作為外植體容易造成褐化且污染的發(fā)生率較高，而利用類原球莖進行繁殖，后代出現(xiàn)變異的幾率較大。因此，本研究利用花梗為外植體，研究澳洲鴿子石斛蘭花梗芽的誘導(dǎo)、增殖及生根情況，并減少對外植體的傷害及污染率，以期為澳洲鴿子石斛蘭種質(zhì)資源的保存及種苗生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

澳洲鴿子石斛蘭（Dendrobium kingianum?Bidwill）開花株由東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心從中國臺灣引入，種植于東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心和廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所的試驗溫室大棚。在開花期，選取生長健壯的花梗作為外植體，品種編號分別為‘澳0‘澳4‘澳5‘澳11‘澳12‘澳13‘金斯卡。

1.2? 方法

1.2.1? 外植體的處理? 在開花期，選取粗壯、無病害的花梗（圖1A），截取長2～3 cm帶有節(jié)間的花梗莖段（圖1B），用自來水沖洗干凈，置于超凈工作臺上用75%的酒精浸泡30 s，然后用0.1% HgCl2溶液滅菌8～10 min，無菌水沖洗5～8次后，用無菌濾紙吸干殘余水分并剖去苞片，將其兩端各切取0.5 cm，再把花梗莖段接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.2? 芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)? 1號誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%椰子汁（CM），2號誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ AC 1.0 g/L+10% CM。接種50 d后調(diào)查出芽的外植體，統(tǒng)計誘導(dǎo)出芽率，誘導(dǎo)出芽率=出芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.3? 芽的增殖培養(yǎng)? 1號增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg/L+AD 2.0 mg/L+10% CM;2號增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM;3號增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA 4.0 mg/L+AD 4.0 mg/L+ 10% CM。將誘導(dǎo)出的芽從芽的基部切下，隨機接種到各種增殖培養(yǎng)基中，每處理接種3瓶，每瓶接種4個芽，倘若誘導(dǎo)出的芽數(shù)偏少，則增殖時直接接種于2號增殖培養(yǎng)基中進行單株增殖。接種60 d后統(tǒng)計芽的數(shù)量，計算芽的增殖倍數(shù)。芽的增殖倍數(shù)=（培養(yǎng)后的芽數(shù)接種芽數(shù)）/接種芽數(shù)。

1.2.4? 生根壯苗培養(yǎng)? 1號生根培養(yǎng)基：1/2 MS+ NAA 0.1 mg/L+10% CM;2號生根培養(yǎng)基：1/2 MS+ NAA 0.3 mg/L+10% CM;3號生根培養(yǎng)基：1/2 MS+ NAA 0.5 mg/L+10% CM。將增殖到一定數(shù)量的無根苗切下，隨機接種到生根培養(yǎng)基中，每處理接種5瓶，每瓶接種10苗。接種60 d后統(tǒng)計生根率。生根率=生根的組培苗數(shù)/接種的組培苗數(shù)×100%

1.2.5? 培養(yǎng)條件? 所有培養(yǎng)基均添加3.00%蔗糖和0.70%瓊脂，培養(yǎng)基pH 5.8±0.1，培養(yǎng)溫度25～28 ℃，光照強度1500～2000 lx，光照時間12 h/d。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 澳洲鴿子石斛蘭花梗的誘導(dǎo)培養(yǎng)

從表1可看出，大部分帶有節(jié)間的花梗莖段因不能誘導(dǎo)出側(cè)芽或側(cè)芽弱小而死亡，占了所有接種數(shù)的70.6%，說明澳洲鴿子石斛的花梗節(jié)間能誘導(dǎo)出芽的效率低。在實驗中僅有‘澳0（圖2）、‘澳4（圖3）和‘金斯卡（圖4）分別在1號和2號誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出芽，而‘澳5‘澳11‘澳12‘澳13在1號和2號誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均未誘導(dǎo)出芽（圖5、圖6）。

2.2? 澳洲鴿子石斛蘭芽的增殖培養(yǎng)

2.2.1? ‘澳0‘澳4的增殖培養(yǎng)? 由于‘澳0‘澳4誘導(dǎo)出的芽數(shù)偏少且為了減少污染，均在2號增殖培養(yǎng)基進行單株增殖培養(yǎng)，其增殖結(jié)果見表2、圖7和圖8。從2表可看出，‘澳0和‘澳4的增殖倍數(shù)均為3.0，這表明6-BA和AD有利于澳洲鴿子石斛芽的增殖。

2.2.2? ‘金斯卡的增殖培養(yǎng)? 將誘導(dǎo)出的‘金斯卡芽分別接種在1號、2號和3號增殖培養(yǎng)基中，結(jié)果見表3和圖9。從表3可看出，不同增殖配方對‘金斯卡有顯著影響，其中2號和3號培養(yǎng)基之間差異不顯著，但2號、3號與1號之間差異顯著，說明2號和3號增殖培養(yǎng)基均有利于澳洲鴿子石斛芽的增殖，但高濃度的6-BA和AD對增殖無明顯效果。

2.3? 澳洲鴿子石斛蘭‘金斯卡的生根培養(yǎng)

澳洲鴿子石斛蘭‘金斯卡生根情況見表4，培養(yǎng)60 d后不同生根培養(yǎng)基對‘金斯卡的生根有影響，其中2號生根培養(yǎng)基和3號生根培養(yǎng)基差異不顯著，生根率分別為92.6%和93.2%，說明2號和3號生根培養(yǎng)基有利于澳洲鴿子石斛蘭‘金斯卡生根培養(yǎng)。同時，組培苗‘金斯卡出瓶移栽種植1 a后見圖10。

3? 討論

在已報道的蘭花組織培養(yǎng)中，利用花梗進行組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖最有效的方法[9-11]，同時在文心蘭[12-13]、樹蘭[14]和萬代蘭[15]等方面也有報道，而石斛蘭主要采用假鱗莖[1， 4-6， 16-22]和幼嫩葉片[23]為外植體進行組織培養(yǎng)和快速繁殖，但利用花梗進行組培研究的報道較少[24]。本研究采用澳洲鴿子石斛蘭花梗側(cè)芽作為外植體進行組培試驗，其中有70.6%的花梗莖段因不能誘導(dǎo)出側(cè)芽，或側(cè)芽過于弱小而死亡，僅有‘澳0‘澳4‘金斯卡的花梗側(cè)芽分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)基1號和2中誘導(dǎo)出芽，說明澳洲鴿子石斛蘭在合適的培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)出芽，但效率較低。

在澳洲鴿子石斛蘭芽的誘導(dǎo)過程中，6-BA濃度為2.0 mg/L并添加NAA 0.5 mg/L，均能誘導(dǎo)出芽，這與華海霞[25]、李金雨等[26]在蝴蝶蘭花梗芽的誘導(dǎo)和李杰等[15]在萬代蘭花梗芽的誘導(dǎo)方面的研究結(jié)果一致，即當6-BA濃度為2.0～3.0 mg/L時，添加少量NAA，芽的誘導(dǎo)效果較好。同時，誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加或不添加活性炭對試驗影響不大，主要是與花梗分泌酚類化合物較少有關(guān)[27]。

從花梗誘導(dǎo)出的芽在增殖培養(yǎng)基中，6-BA和AD均能有效地促進苗的增殖，并獲得大量的叢生芽，這與陸順教等[20]和Martin等[28]在秋石斛新生側(cè)芽增殖，以及楊錄軍等[29]在蝴蝶蘭新品種‘鄭農(nóng)火鳳凰的組培快繁的研究結(jié)果一致，即影響叢生芽增殖最大的因素是6-BA，其次是AD;莫遠琪等[1]也認為6-BA的濃度在2.0～3.0 mg/L時有利于澳洲鴿子石斛蘭叢生芽的增殖。但Jonojit等[21]、Sujjaritthurakarn等[22]、Chung等[24]認為不同濃度的TDZ能有效地誘導(dǎo)出類原球莖，同時能進行叢生芽增殖。因此，澳洲鴿子石斛蘭芽的增殖還需進一步研究。

生根壯苗在組織培養(yǎng)過程中直接影響組培苗的移栽成活率，NAA對生根具有重要作用。本研究中，0.3～0.5 mg/L NAA有利于澳洲鴿子石斛蘭‘金斯卡生根培養(yǎng)，與陸順教等[20]和張曉申等[30]的研究結(jié)果一致。

4? 結(jié)論

在澳洲鴿子石斛蘭芽的誘導(dǎo)過程中，6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L有利于花梗芽的誘導(dǎo);在增殖過程中，6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L適合于澳洲鴿子石斛蘭芽的增殖，其中由于‘澳0‘澳4‘澳5‘澳11‘澳12‘澳13的外植體數(shù)量較少，導(dǎo)致在增殖過程中誘導(dǎo)出的芽數(shù)偏少而無法做增殖梯度試驗，在接下來的研究中應(yīng)增加外植體及在獲得少量無菌不定芽的基礎(chǔ)上，再進行多次繼代培養(yǎng)，然后進行更多增殖培養(yǎng)基的篩選和生根實驗;而培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.3～ 0.5 mg/L+10% CM適宜澳洲鴿子石斛蘭‘金斯卡的生根培養(yǎng)。

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