• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    澳洲堅(jiān)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選

    2020-09-26 12:41:03楊倩楊子平周婭麗陳東泉劉恒
    熱帶作物學(xué)報(bào) 2020年8期
    關(guān)鍵詞:澳洲堅(jiān)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR穩(wěn)定性分析

    楊倩 楊子平 周婭麗 陳東泉 劉恒

    摘? 要:澳洲堅(jiān)果是重要的熱區(qū)經(jīng)濟(jì)作物,目前國內(nèi)外尚無關(guān)于澳洲堅(jiān)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析內(nèi)參基因的報(bào)道。選擇合適的內(nèi)參基因是提高實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析準(zhǔn)確性的先決條件。為篩選澳洲堅(jiān)果實(shí)時(shí)定量PCR最適內(nèi)參基因,以澳洲堅(jiān)果的根、莖、葉、果皮、果仁為材料,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),對18S rRNA,Actin,CYP,EF1a,EF1b,GAPDH,MDH,TUBa,TUBb,UBQ,UBC等11個(gè)常用的內(nèi)參基因在澳洲堅(jiān)果不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。geNorm軟件分析的最適內(nèi)參基因數(shù)目為2,最穩(wěn)定內(nèi)參組合為MDH和EF1b,TUBa基因的穩(wěn)定性最差。BestKeeper分析結(jié)果認(rèn)為,MDH基因表達(dá)最穩(wěn)定,EF1b次之,與geNorm結(jié)果一致。NormFinder軟件穩(wěn)定性分析顯示,GAPDH最穩(wěn)定,其次是CYP基因;TUBa基因表達(dá)最不穩(wěn)定。ΔCt算法結(jié)果表明,18S基因表達(dá)最穩(wěn)定,其次是GAPDH基因,MDH和EF1b排第3和第4。RefFinder綜合排序?yàn)椋篗DH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ> TUBa。因此,MDH基因在澳洲堅(jiān)果不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定,初步確認(rèn)可以作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的校正內(nèi)參基因,在澳洲堅(jiān)果的基因表達(dá)模式分析中具有重要意義。

    關(guān)鍵詞:澳洲堅(jiān)果;內(nèi)參基因;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;穩(wěn)定性分析

    中圖分類號:S664.9? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    Abstract: Macadamia nut is an important economics crop in subtropical areas of China. The selection of a suitable reference gene is an important prerequisite for successful gene expression analysis by real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR). In order to select the appropriate reference genes, we investigated the expression stability of 11 candidate genes (18S rRNA, Actin, CYP, EF1a, EF1b, GAPDH, MDH, TUBa, TUBb, UBQ, UBC) in RT-qPCR experiments in different tissues, including kernel, peel, roots, stem, leaf from Macadamia with geNorm, NormFinder, BestKeeper, ΔCt, RefFinder program software packages. As determined by geNorm, MDH/EF1b were the most stable reference genes, TUBa was the least stable gene. BestKeeper revealed that MDH was the most stables reference gene, and EF1b ranked the second. The rank in BestKeeper was similarly with that in geNorm. The result by NormFinder showed GAPDH was the most stable gene, CYP ranks the second, the least stable gene was TUBa. ΔCt algorithm demonstrated that18S was the most stable gene, GAPDH ranks the second, MDH and EF1b ranked the third and fourth. To obtain a consensus result of the most stable reference genes according to the RefFinder approach, the geometric mean of the four algorithms corresponding rankings for each candidate gene were calculated: MDH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ>TUBa. The result showed that MDH was the most suitable reference gene for macadamia in different tissues.

    Keywords: Macadamia integrifolia; reference genes; real-time fluorescence quantitative PCR; stability analysis

    DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.001

    澳洲堅(jiān)果(Macadamia integrifolia),又稱夏威夷果、澳洲胡桃、昆士蘭栗,屬山龍眼科(Pro teaceae)澳洲堅(jiān)果屬(Macadamia F. Muell)常綠喬木果樹,原產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭州東南部和新南威爾士東北部沿岸的亞熱帶雨林地區(qū)[1]。澳洲堅(jiān)果果實(shí)營養(yǎng)豐富,風(fēng)味獨(dú)特,被譽(yù)為“堅(jiān)果之王”,具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3]。近年來,我國云南、廣西、廣東、貴州等南方各?。▍^(qū))大面積推廣引種試種澳洲堅(jiān)果優(yōu)良品種,種植面積達(dá)16萬hm2,占世界種植面積的61.05%(數(shù)據(jù)來源:中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶作物辦公室)。雖然我國澳洲堅(jiān)果的果仁產(chǎn)量逐漸遞增,但是全球市場的需求量更大,因此澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景[4]。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì),熒光物質(zhì)能夠與PCR產(chǎn)物反應(yīng),隨著PCR產(chǎn)物不斷增加,熒光信號也成比例增強(qiáng),所以PCR每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)的熒光值代表了PCR產(chǎn)物量的變化。利用qRT-PCR對目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算時(shí),需要以管家基因的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正和均一化。理想狀態(tài)下,所選內(nèi)參基因在不同的處理?xiàng)l件下、不同組織器官中、細(xì)胞的不同發(fā)育時(shí)期中都能穩(wěn)定表達(dá),而且其表達(dá)水平與目的基因表達(dá)水平相近[5]。然而,不斷有研究表明,實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中并不存在任何一種內(nèi)參基因能夠在任何條件、任何細(xì)胞類型和組織都能夠穩(wěn)定表達(dá)[6],因此直接使用未經(jīng)篩選的內(nèi)參基因,會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,影響目的基因表達(dá)水平結(jié)果的可靠性,所以有必要對內(nèi)參基因進(jìn)行篩選。

    近年來,隨著分子生物學(xué)研究手段逐漸被應(yīng)用到各個(gè)研究領(lǐng)域,分子生物學(xué)研究中的基因表達(dá)和調(diào)控機(jī)制研究成為熱點(diǎn)?;虻谋磉_(dá)分析需要內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化,而目前關(guān)于澳洲堅(jiān)果內(nèi)參基因的研究還未見報(bào)道。Actin是常見的內(nèi)參基因,是微絲的結(jié)構(gòu)成分,也是細(xì)胞骨架的主要成分。在魚的研究中發(fā)現(xiàn),環(huán)境中的激素刺激會影響Actin基因的表達(dá)穩(wěn)定性[7]。18S rRNA是真核生物體內(nèi)含量最多的核糖體RNA,常被用來做內(nèi)參基因,但是在楊樹的不同發(fā)育時(shí)期,18S rRNA的表達(dá)穩(wěn)定性最差,并不適合作為內(nèi)參基因[8]。GAPDH是糖酵解、糖異生及光合作用碳固定循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶。但是在豬的不同組織中的表達(dá)水平和穩(wěn)定性表達(dá)變化都很大,是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因[9]。蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase, MDH)是一類廣泛存在動植物中的酶,參與植物體的多個(gè)代謝途徑,研究證實(shí)細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因也可作內(nèi)參基因[10]。延伸因子(elongation factor, eEF)是一類多功能調(diào)控蛋白,可以催化氨基酸鏈在核糖體上的延伸,從而調(diào)控相關(guān)蛋白的合成[11-13]。在植物中,真核生物延伸因子1(eEF1)家族包含eEF1A和eEF1B蛋白[14-16],延伸因子(elongation factor, eEF)家族基因常被選作內(nèi)參基因[14,17]。因此,本研究以澳洲堅(jiān)果根、莖、葉、果皮、果仁為材料,對18S rRNA,Actin,親環(huán)蛋白(CYP),EF1a和EF1b,GADPH,MDH,微管蛋白(TUBa和TUBb),多聚泛素酶(UBQ),泛素連接蛋白(UBC)等11個(gè)常用內(nèi)參基因分別用geNorm[18]、NormFinder[19]、BestKeeper[20]和ΔCt法等不同算法進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析,最后根據(jù)RefFinder[21]綜合分析篩選最適合的內(nèi)參基因。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖呛Y選出澳洲堅(jiān)果不同組織器官中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因,以期為澳洲堅(jiān)果的基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)研究提供合適的內(nèi)參基因。

    1? 材料與方法

    1.1? 植物材料

    選取‘南亞1號澳洲堅(jiān)果品種作為實(shí)驗(yàn)材料,分別摘取成熟的果實(shí)、幼嫩葉片、枝條和根,清洗干凈后用液氮速凍,80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2? 內(nèi)參基因的選擇和引物設(shè)計(jì)

    在植物實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究中多采用肌動蛋白(Actin)、18S核糖體RNA(18S rRNA),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)等常用看家基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行定量。本研究擬選擇11個(gè)常用內(nèi)參基因(18S rRNA, Actin, CYP, EF1a, EF1b, GAPDH, MDH, TUBa, TUBb, UBC, UBQ)作為候選內(nèi)參基因。這11個(gè)候選內(nèi)參基因cDNA序列部分已經(jīng)從澳洲堅(jiān)果的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得。登錄實(shí)時(shí)定量引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站,在候選內(nèi)參基因的保守區(qū)域,使用在線軟件設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物。網(wǎng)站地址:https://sg.idtdna.com/pages/products/qpcr-and- pcr/custom-primers,每個(gè)基因設(shè)計(jì)5對引物。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

    1.3? 不同組織RNA的提取和cDNA的合成

    澳洲堅(jiān)果葉片總RNA的提取按照Plant Total RNA Isolation Kit Plus(FOREGENE Biotech, Chengdu, China)方法進(jìn)行。mRNA使用凝膠電泳檢測,Nanodrop測定濃度。反轉(zhuǎn)錄按照NOVA All-in-one First-Strand Synthesis Master Mix(Yugong Biolabs, Jiangsu, China)操作。反應(yīng)體系20 μL,以1000 ng RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?5 ℃ 60 min;85 ℃ 1 min。

    1.4? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)采集在羅氏(Roche)Light Cycler 480Ⅱ上完成,熒光試劑盒選用Taq SYBR Green qPCR Premix ROXⅠ(NOVA)。將根、莖、葉、果皮、果仁等5個(gè)不同組織的樣品等體積混合,5倍梯度稀釋,分別以50 、51 、52、53、54 、55作為模板制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,每個(gè)樣品重復(fù)3次。3次生物學(xué)重復(fù)。

    RT-PCR擴(kuò)增體系:SYBR Premix ExTaqⅡ(2),10 L;PCR Forward Primer(10 mol/L),1 L;PCR Reverse Primer(10 mol/L),1 L;cDNA,1 L;dH2O,7 L;總體積20 L。標(biāo)準(zhǔn)曲線和斜率(slope)由稀釋倍數(shù)和熒光定量Cp值在Excel中計(jì)算得出。擴(kuò)增效率計(jì)算公式:E=(5[1/slope]1)100%。

    PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;然后94 ℃變性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,45個(gè)循環(huán);在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熒光信號的采集,所有循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析(65~95 ℃)。

    1.5? 數(shù)據(jù)分析

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)值可利用Light Cycler 480Ⅱ(Roche)的分析軟件直接獲得Cp值。分別采用geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt算法4個(gè)不同的程序,比較分析澳洲堅(jiān)果中候選內(nèi)參基因在不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性,最后通過RefFinder計(jì)算出較為一致的穩(wěn)定內(nèi)參基因。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 澳洲堅(jiān)果RNA的分離與純化和內(nèi)參引物的篩選

    1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA結(jié)果顯示,不同器官組織的RNA電泳條帶清晰,28S rRNA帶亮度約為18S rRNA的1.5~2倍(圖1),無拖尾,表明RNA的完整性良好,純度較高,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)溶解曲線和熒光定量PCR的Cp值對每個(gè)候選內(nèi)參基因的5對引物進(jìn)行篩選,選取質(zhì)量最好的一對常用內(nèi)參基因引物(表1)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.2? 內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線

    將澳洲堅(jiān)果根、莖、葉、果皮、果仁等樣品cDNA等量混合,依次連續(xù)5倍稀釋為50,51,52,53,54,55共6個(gè)梯度,隨后以6個(gè)不同濃度的混合樣品為模板分別對11個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR。在Excel數(shù)據(jù)處理軟件中,以實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)獲得的Cp值為縱坐標(biāo),5的稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo),自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:除18S(R2=0.963)外,其余候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)都在0.99附近(表1),擴(kuò)增效率為91.9%~102.5%,說明引物、模板、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的要求(90%~105%)。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物具有熒光信號,隨著溫度升高雙鏈DNA降解,這個(gè)過程的熒光信號被采集生成熔解曲線,可以用來確定PCR的反應(yīng)產(chǎn)物。熔解曲線分析通常是在qRT-PCR擴(kuò)增程序的所有循環(huán)結(jié)束后,設(shè)置一個(gè)由65 ℃上升至95 ℃的反應(yīng)程序,每升溫0.5 ℃測定1次熒光信號,共采集60次。熒光定量熔解曲線數(shù)據(jù)顯示,11個(gè)候選內(nèi)參基因的都為單一銳鋒,不存在非特異擴(kuò)增,Tm值為80~85 ℃(圖2),說明篩選的這些候選內(nèi)參基因的引物特異性強(qiáng),符合RT-qPCR分析的要求。

    2.3? 不同組織內(nèi)參基因的篩選

    以澳洲堅(jiān)果根、莖、葉、果仁、果皮不同組織的cDNA為模板,對11個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

    2.3.1? geNorm分析澳洲堅(jiān)果不同組織中候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性? geNorm軟件算法利用M值和標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異V值確定候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和適合內(nèi)參的數(shù)量。M值的閾值為1.5,小于1.5說明該基因適合做內(nèi)參,反之則不適合做內(nèi)參;且M值越小則內(nèi)參基因的表達(dá)就越穩(wěn)定。由圖3可見,本實(shí)驗(yàn)中11個(gè)候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5,說明所有基因的表達(dá)都比較穩(wěn)定。其中EF1b和MDH的M值最低(圖3A),其他基因的表達(dá)穩(wěn)定性依次為18S>GAPDH>UBC> Actin>CYP>EF1a>TUBb>UBQ>TUBa,TUBa的M值最高。因此,geNorm軟件分析認(rèn)為EF1b、MDH的穩(wěn)定性最好,TUBa的穩(wěn)定性最差。geNorm程序還可計(jì)算引入1個(gè)新基因后標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異V值,并根據(jù)Vn/Vn+1值來確定所需最適內(nèi)參基因的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,在11個(gè)檢測的候選內(nèi)參基因中,V2/3的比值為0.131,小于推薦值0.15,說明本次實(shí)驗(yàn)供試的澳洲堅(jiān)果不同組織器官中,最適合的內(nèi)參基因數(shù)目是2(圖3B)。因此,根據(jù)geNorm分析認(rèn)為,EF1b和MDH為最穩(wěn)定內(nèi)參基因。

    2.3.2? ΔCt算法分析澳洲堅(jiān)果不同組織內(nèi)參基因的穩(wěn)定性? ΔCt算法根據(jù)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)值(STDEV)確定基因表達(dá)的穩(wěn)定性[22],標(biāo)準(zhǔn)偏差越小則基因越穩(wěn)定。使用ΔCt分析結(jié)果顯示(表2),18S為最穩(wěn)定內(nèi)參基因,其次為GAPDH基因,MDH和EF1b基因排在中間,TUBa為最不穩(wěn)定基因。

    2.3.3? NormFinder分析澳洲堅(jiān)果不同組織中候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性? NormFinder程序的穩(wěn)定性分析同geNorm分析一樣,也是基于候選內(nèi)參基因的相對定量表達(dá)數(shù)據(jù),穩(wěn)定性數(shù)值越小,基因表達(dá)越穩(wěn)定[23]。NormFinder算法不但可以估計(jì)候選內(nèi)參基因的整體表達(dá)差異,還可以計(jì)算樣品組間的變異,但是只能篩選出一個(gè)最合適的內(nèi)參基因[24]。本研究使用NormFinder程序分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性排序見表2。分析認(rèn)為,GAPDH為最穩(wěn)定基因,其次是CYP、EF1a和18S,然后才是MDH和EF1b,TUBa為最不穩(wěn)定基因。

    2.3.4? BestKeeper分析澳洲堅(jiān)果不同組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性? BestKeeper程序是以每個(gè)樣品的原始Cp值進(jìn)行配對相關(guān)分析。計(jì)算Cp值得到標(biāo)準(zhǔn)差(SD)、變異系數(shù)(CV)、配對相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient),如果SD和CV越小,該內(nèi)參基因越穩(wěn)定,反之穩(wěn)定性越差。一般認(rèn)為,候選內(nèi)參基因SD小于1的被認(rèn)為是最穩(wěn)定表達(dá),由表3可見,除TUBa(2.38)和UBQ(1.108)基因外,本研究中其他的9個(gè)候選內(nèi)參基因SD值都小于1,說明這些基因的表達(dá)都比較穩(wěn)定。MDH和EF1b的SD分別為0.361和0.411,這個(gè)結(jié)果與geNorm的分析結(jié)果一致。

    2.3.5? RefFinder綜合排序分析? 由于各個(gè)算法原理不同,得到最穩(wěn)定基因的結(jié)果差異較大。本實(shí)驗(yàn)使用RefFinder程序?qū)ι鲜?種算法的排序結(jié)果進(jìn)行綜合分析[21],數(shù)值越小,則基因越穩(wěn)定;反之穩(wěn)定性越差。結(jié)果見表3,MDH表達(dá)最穩(wěn)定,其次為18S rRNA,TUBa基因的穩(wěn)定性最差。

    2.4? 澳洲堅(jiān)果SAD基因的表達(dá)分析和內(nèi)參基因的驗(yàn)證

    植物硬脂酰-?;d體蛋白脫飽和酶(SAD)是一種質(zhì)體中存在的催化硬脂酸烴鏈脫飽和合成油酸的可溶性酶,是植物中形成不飽和脂肪酸的前提。已有研究表明,澳洲堅(jiān)果SAD能以18∶0-ACP和16∶0-ACP為底物催化生成單不飽和脂肪酸——油酸和棕櫚油酸,并且對底物18∶0- ACP的酶反應(yīng)速率高于底物16∶0-ACP[25]。為了分析SAD基因在澳洲堅(jiān)果不同組織中的表達(dá)情況,分別用MDH和18S rRNA(最穩(wěn)定內(nèi)參)、TUBa基因(最不穩(wěn)定內(nèi)參)作為參照基因歸一化定量。結(jié)果顯示,以MDH和18S rRNA為參照時(shí),基因在各個(gè)組中的表達(dá)量呈下降的趨勢;以TUBa基因作為參照時(shí)莖和葉片中基因表達(dá)上調(diào),果皮和果仁中基因上調(diào)表達(dá),而UBQ則相反;因此,如果采用UBQ和TUBa作為內(nèi)參基因,那么則會得到完全相反的定量結(jié)果(圖4)。結(jié)果表明,選擇合適的內(nèi)參基因直接影響基因的表達(dá)準(zhǔn)確性,在本實(shí)驗(yàn)中,MDH基因最適合作為澳洲堅(jiān)果不同組織中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的內(nèi)參基因。

    3? 討論與結(jié)論

    使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析基因的表達(dá)情況是理解生物學(xué)調(diào)控機(jī)制研究中常用的重要手段。但實(shí)際情況是,常用內(nèi)參基因的表達(dá)在不同組織器官中、不同處理?xiàng)l件下、不同類型細(xì)胞中和不同發(fā)育階段中并不是恒定表達(dá),也會隨著條件改變[26]。因此,為了獲得更為準(zhǔn)確的定量結(jié)果,通常會選擇一個(gè)或多個(gè)持家基因作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化,故選擇合適的內(nèi)參基因是獲得準(zhǔn)確定量結(jié)果的關(guān)鍵[27]。

    在本研究中,選擇了傳統(tǒng)的11個(gè)常用看家基因,包括18S rRNA,Actin,CYP,EF1a,EF1b,GAPDH,MDH,TUBa,TUBb,UBQ,UBC等基因,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt算法分析這些候選內(nèi)參基因在不同組織器官中的表達(dá)穩(wěn)定性。由于各個(gè)程序的計(jì)算方法原理不同,各軟件得出的穩(wěn)定性結(jié)果基本一致,但仍舊有些差異。geNorm分析程序根據(jù)各個(gè)候選內(nèi)參基因在每個(gè)樣品中表達(dá)情況的相似度進(jìn)行排序,不考慮其他內(nèi)參基因,故不適于區(qū)分表達(dá)模式類似的基因。而NormFinder是以組內(nèi)方差與組間方差進(jìn)行排序,綜合考慮其他基因之后,對候選內(nèi)參基因進(jìn)行打分。本試驗(yàn)對4種算法數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn):geNorm和BestKeeper軟件得到的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序基本一致,MDH和EF1b表達(dá)最穩(wěn)定,TUBa表達(dá)最不穩(wěn)定。而NormFinder的分析認(rèn)為:GAPDH的表達(dá)最穩(wěn)定,TUBa表達(dá)最不穩(wěn)定,MDH和EF1b的穩(wěn)定性排第5和第6,與geNorm和BestKeeper分析結(jié)果差異較大。ΔCt算法分析結(jié)果表明,18S rRNA基因表達(dá)最穩(wěn)定,其次是GAPDH,MDH和EF1b的穩(wěn)定性排第3和第4。最后,我們通過幾何平均算法對上述4種結(jié)果綜合排序:MDH>18S rRNA>GADPH> EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ>TUBa。因此,在本研究中,可以初步選擇MDH作為澳洲堅(jiān)果實(shí)根、莖、葉、果皮、果仁不同組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

    魏永贊等[28]認(rèn)為,β-Actin在荔枝果實(shí)發(fā)育不同階段和外源生長調(diào)節(jié)劑處理下表達(dá)穩(wěn)定性較好,但是,在114份香蕉品種中比較發(fā)現(xiàn)Actin表達(dá)最不穩(wěn)定,在本實(shí)驗(yàn)中,Actin基因的表達(dá)沒有MDH基因穩(wěn)定。蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase, MDH)是一類廣泛存在動植物中的酶,參與植物體的多個(gè)代謝途徑,根據(jù)輔酶專一性、亞細(xì)胞定位和生理功能。在小麥的研究中發(fā)現(xiàn):TaMDH基因在不同物種間高度保守,推測cyMDH可能由一個(gè)共同的祖先進(jìn)化而來,并且可能屬于管家基因[29-30]。在黃花大苞姜花粉母細(xì)胞不同的發(fā)育時(shí)期進(jìn)行qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn):MDH的表達(dá)最穩(wěn)定,可以作為內(nèi)參基因[31]。本研究結(jié)果表明:MDH基因在澳洲堅(jiān)果不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性最好,適合做內(nèi)參基因?qū)Π闹迗?jiān)果不同組織中的基因進(jìn)行歸一化分析。

    MiSAD基因是澳洲堅(jiān)果的合成和積累不飽和脂肪酸的關(guān)鍵基因,本研究分別以最穩(wěn)定基因MDH和最不穩(wěn)定基因TUBa分別作為內(nèi)參對MiSAD基因進(jìn)行歸一化分析。研究結(jié)果表明:MDH和18S rRNA為參照時(shí),基因在各個(gè)組中的表達(dá)量呈下降的趨勢;以TUBa基因作為參照時(shí),在莖葉中呈上調(diào)表達(dá),果皮和果仁中則表達(dá)量降低,而UBQ則相反;如果采用UBQ和TUBa作為內(nèi)參基因,那么則會得到完全相反的定量結(jié)果。因此,如果在進(jìn)行基因表達(dá)分析前,沒有對候選內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析,盲目使用內(nèi)參基因,會導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。由于不同的環(huán)境條件,如生物脅迫和非生物脅迫都會影響內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性,接下來將進(jìn)一步對不同處理?xiàng)l件下,澳洲堅(jiān)果中內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行深入研究。

    參考文獻(xiàn)

    Russ Stephenson. Macadamia: Domestication and commercialization[J]. Chronica Horticulture, 2005, 45(2): 11-15.

    Manohar L G, Robert J B, Ron B H W. Macadamia nut consumption lowers plasma total and LDL cholesterol level in hypercholesterolemic men[J]. The Journal of Nutrition, 2003, 133(4): 1060-1063.

    Duxbury D D. Lipid scientists shake healthy macadamia nut tree[J]. Food Processing, 2003(6): 83.

    杜? 杉. 云南已成澳洲堅(jiān)果種植老大——第八屆國際澳洲堅(jiān)果大會將首次走進(jìn)中國[J]. 時(shí)代金融, 2018(19): 52-54.

    Dheda K, Huggett J F, Bustin S A, et al. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR[J]. Biotechniques, 2004, 37(4): 112-119.

    孫美蓮, 王云生, 楊冬青, 等. 茶樹實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 植物學(xué)報(bào), 2010, 45(5): 579-587.

    Amy L F, Charles R T. Appropriate “housekeeping” genes for use in expression profiling the effect of environmental estrogens in fish[J]. BMC Molecular Biology, 2007(8): 10.

    Gutierrez L, Mauriat M, Guénin S, et al. The lack of a systematic validation of reference genes: a serious pitfall undervalued in reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis in plants[J]. Plant Biotechnology Journal, 2008, 6(6): 609-618.

    Nygard A B, J?rgensen C B, Cirera S, et al. Selection of reference genes for gene expression studies in pig tissues using SYBR green qPCR[J]. BMC Molecular Biology, 2007(8): 67.

    Tomaz T, Bagard M, Pracharoenwattana I, et al. Mitochondrial malate dehydrogenase lowers leaf respiration and alters photorespiration and plant growth in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2010, 154(3): 1143-1157.

    楊彩霞, 雒? 軍, 王引權(quán), 等. 當(dāng)歸延伸因子AsEF-1β基因的克隆及脅迫應(yīng)答分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2019, 39(8): 1371-1378.

    王? 芳, 董美玲, 董? 樂, 等. 蓖麻延伸因子基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2019, 33(3): 464-472.

    JeeNa H, Chang-Sik O, Byoung-Cheorl K. Translation elongation factor 1B (eEF1B) is an essential host factor for Tobacco mosaic virus infection in plants[J]. Virology, 2013, 439(2): 105-114.

    常鵬杰, 申亞梅, 董? 彬, 等. 玉蘭鹽脅迫下qRT-PCR分析中內(nèi)參基因的篩選[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2018, 26(9): 1611-1620.

    朱海生, 劉建汀, 溫文旭, 等. 印度南瓜延伸因子基因CmEF1a的克隆與分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2019, 33(6): 1096-1104.

    陳曉榮, 陳昶旭, 施力銘, 等. 植物翻譯延伸因子eEF1A的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)技服務(wù), 2019, 36(2): 64-67.

    袁? 偉, 萬紅建, 楊悅儉. 植物實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的特點(diǎn)及選擇[J]. 植物學(xué)報(bào), 2012, 47(4): 427-436.

    Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology, 2002, 3(7): 1-11.

    Andersen C L, Jensen J L, Rbtoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research, 2004, 64 (15): 5245-5250.

    Pfaffl M W, Tichopad A, Prgomet C, et al. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letters, 2004, 26(6): 509-515.

    Xie F, Xiao P, Chen D, et al. miRDeepFinder: a miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small RNAs[J]. Plant Molecular Biology, 2012, 80(1): 75-84.

    Silver N, Best S, Jiang J. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR[J]. BMC Molecular Biology, 2006, 7(33): 1-9.

    Fan C, Ma J, Guo Q. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in bamboo (Phyllostachys edulis)[J]. PLoS One, 2013(8): e56573.

    Pérez S, Royo L J, Astudillo A, et al. Identifying the most suitable endogenous control for determining gene expression in hearts from organ donors[J]. BMC Molecular Biology, 2007, 8(1): 1-23.

    Rodríguez M F, Sánchez-García A, Salas J J, et al. Characterization of soluble acyl-ACP desaturases from Camelina sativa, Macadamia tetraphylla and Dolichandra unguis-cati[J]. Journal of Plant Physiology, 2015, 178: 35-42.

    Chervoneva I, Li Y, Schulz S, et al. Selection of optimal reference genes for normalization in quantitative RT-PCR[J]. BMC Bioinformatics, 2010, 11(1): 1-15.

    Suzuki T, Higgins P J, Crawford D R. Reviews-control selection for RNA quantitation[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 332-337.

    魏永贊, 賴? 彪, 胡福初, 等. 用于荔枝qPCR分析的內(nèi)參基因克隆及穩(wěn)定性分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 33(3): 301-306.

    Chen L, Zhong H Y, Kuang J F, et al. Validation of reference genes for RT-qPCR studies of gene expression in banana fruit under different experimental conditions[J]. Planta, 2011, 234(2): 377-390.

    Ding Y, Ma Q H. Characterization of a cytosolic malate dehydrogenase cDNA which encodes an isozyme toward oxaloacetate reduction in wheat[J]. Biochimie, 2004, 86(8): 509-518.

    張俊平, 王英強(qiáng). 黃花大苞姜花藥發(fā)育qRT-PCR內(nèi)參基因篩選[J]. 廣西植物, 2018, 38(1): 76-83.

    猜你喜歡
    澳洲堅(jiān)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR穩(wěn)定性分析
    丹參蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表達(dá)分析
    淺談耿馬縣澳洲堅(jiān)果病蟲害發(fā)生及其防治方法
    雞卵清蛋白啟動子慢病毒載體構(gòu)建及熒光定量PCR檢測重組慢病毒滴度
    1—脫氧野尻霉素對家蠶中腸BmSuc1基因表達(dá)及其酶活性的影響
    澳洲堅(jiān)果種植管理技術(shù)要點(diǎn)分析
    綠色科技(2016年23期)2017-03-15 20:24:34
    高聳鋼結(jié)構(gòu)施工關(guān)鍵控制技術(shù)分析
    αB—crystallin在喉癌組織中的表達(dá)及臨床意義
    框架預(yù)應(yīng)力錨桿邊坡支護(hù)結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用分析
    澳洲堅(jiān)果優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的栽培措施
    淺談邊坡穩(wěn)定性地質(zhì)問題的解決措施
    麻豆成人午夜福利视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品99久久久久久久久| 一个人看视频在线观看www免费| 成年免费大片在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 黄色日韩在线| 日本三级黄在线观看| 婷婷色av中文字幕| 亚洲四区av| 亚洲四区av| 少妇 在线观看| 一级av片app| av线在线观看网站| 涩涩av久久男人的天堂| 夜夜爽夜夜爽视频| 少妇的逼水好多| 另类亚洲欧美激情| 黄色配什么色好看| 九九爱精品视频在线观看| 如何舔出高潮| 97超碰精品成人国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产黄a三级三级三级人| 久久国内精品自在自线图片| 国产色爽女视频免费观看| 欧美最新免费一区二区三区| 高清日韩中文字幕在线| 日本欧美国产在线视频| 可以在线观看毛片的网站| 色网站视频免费| 日韩伦理黄色片| 亚洲色图综合在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 大香蕉久久网| 国产成人91sexporn| 六月丁香七月| 亚洲人成网站高清观看| 日本免费在线观看一区| 国产亚洲91精品色在线| 国产片特级美女逼逼视频| 观看免费一级毛片| 国产永久视频网站| 青青草视频在线视频观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 18禁在线播放成人免费| 成人二区视频| 亚洲在久久综合| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 伊人久久精品亚洲午夜| 精华霜和精华液先用哪个| 日韩成人av中文字幕在线观看| 性色av一级| 国产毛片在线视频| 在线观看一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 97在线人人人人妻| 麻豆久久精品国产亚洲av| 高清在线视频一区二区三区| 在线精品无人区一区二区三 | 搡老乐熟女国产| 秋霞在线观看毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 性色avwww在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 最近中文字幕2019免费版| 99热网站在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 国产一区有黄有色的免费视频| av.在线天堂| 99久久中文字幕三级久久日本| 男插女下体视频免费在线播放| videos熟女内射| 国产精品久久久久久久电影| 欧美国产精品一级二级三级 | 国内精品宾馆在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 2021天堂中文幕一二区在线观| 成人漫画全彩无遮挡| 成年免费大片在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 少妇丰满av| 91精品伊人久久大香线蕉| 内地一区二区视频在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 777米奇影视久久| 国产人妻一区二区三区在| 少妇的逼水好多| 2021天堂中文幕一二区在线观| 天美传媒精品一区二区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品三级大全| 国产精品伦人一区二区| 女人久久www免费人成看片| 久久久成人免费电影| 国产在视频线精品| 看黄色毛片网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 在线观看美女被高潮喷水网站| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美+日韩+精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品久久久久久久久亚洲| 国产成人a∨麻豆精品| 国产在线一区二区三区精| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 亚洲电影在线观看av| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲成人一二三区av| 精品酒店卫生间| 亚洲国产精品专区欧美| 免费黄色在线免费观看| 欧美+日韩+精品| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩免费高清中文字幕av| 涩涩av久久男人的天堂| 又爽又黄a免费视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久鲁丝午夜福利片| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品.久久久| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 看十八女毛片水多多多| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品一二三区在线看| 日本熟妇午夜| 免费电影在线观看免费观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲欧洲日产国产| 国产亚洲一区二区精品| 免费av不卡在线播放| 在线观看三级黄色| 国产精品蜜桃在线观看| 永久网站在线| 免费观看性生交大片5| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日日啪夜夜撸| 亚洲综合精品二区| 色5月婷婷丁香| 亚洲av成人精品一二三区| 2021少妇久久久久久久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 深夜a级毛片| 丰满少妇做爰视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产亚洲5aaaaa淫片| 男男h啪啪无遮挡| 成人综合一区亚洲| 少妇人妻 视频| 久久久色成人| 女人久久www免费人成看片| 精品午夜福利在线看| 国产精品国产三级国产专区5o| 五月开心婷婷网| xxx大片免费视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美最新免费一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 高清在线视频一区二区三区| 日韩欧美精品v在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 97超视频在线观看视频| 国产精品久久久久久久久免| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| videossex国产| 日韩欧美一区视频在线观看 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 观看美女的网站| 又爽又黄a免费视频| 久久精品人妻少妇| 色播亚洲综合网| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲国产色片| 成年版毛片免费区| 搡老乐熟女国产| 又爽又黄a免费视频| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲精品影视一区二区三区av| 99久久精品一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| a级毛片免费高清观看在线播放| 内地一区二区视频在线| 国产精品成人在线| 久久久久九九精品影院| 不卡视频在线观看欧美| 国国产精品蜜臀av免费| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产黄频视频在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 黄色配什么色好看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲av在线观看美女高潮| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产免费视频播放在线视频| 尾随美女入室| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 晚上一个人看的免费电影| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美成人a在线观看| 赤兔流量卡办理| 草草在线视频免费看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品少妇久久久久久888优播| 男人添女人高潮全过程视频| 看非洲黑人一级黄片| 在线 av 中文字幕| 欧美区成人在线视频| 青春草亚洲视频在线观看| videos熟女内射| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产片特级美女逼逼视频| 国产毛片a区久久久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av二区三区四区| 精品一区在线观看国产| 亚洲在线观看片| 在线观看一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲人成网站在线观看播放| 五月玫瑰六月丁香| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产有黄有色有爽视频| 精品少妇久久久久久888优播| 精品视频人人做人人爽| 亚洲精品色激情综合| 香蕉精品网在线| av在线蜜桃| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 看黄色毛片网站| 亚州av有码| 晚上一个人看的免费电影| 国产乱人视频| 99久国产av精品国产电影| 久久久久国产网址| 视频中文字幕在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 身体一侧抽搐| 插阴视频在线观看视频| av天堂中文字幕网| 免费观看无遮挡的男女| 一个人看视频在线观看www免费| 色哟哟·www| 最近最新中文字幕大全电影3| 22中文网久久字幕| 国产精品爽爽va在线观看网站| 五月天丁香电影| 欧美97在线视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 最近手机中文字幕大全| 免费av不卡在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 精品久久久久久久久av| 成人综合一区亚洲| xxx大片免费视频| 国产在线一区二区三区精| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一级毛片电影观看| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩视频在线欧美| 日韩人妻高清精品专区| 99久久精品国产国产毛片| 久久久久久久久久久免费av| 欧美激情在线99| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线观看国产h片| 男女无遮挡免费网站观看| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲国产精品国产精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲四区av| 最近中文字幕2019免费版| 91久久精品国产一区二区成人| 国产伦理片在线播放av一区| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久精品综合一区二区三区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 男女边吃奶边做爰视频| 秋霞伦理黄片| 亚洲欧洲日产国产| 午夜视频国产福利| 亚洲精品色激情综合| 国产亚洲一区二区精品| 九草在线视频观看| 国产成人免费观看mmmm| 能在线免费看毛片的网站| 成人综合一区亚洲| 91aial.com中文字幕在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 另类亚洲欧美激情| 欧美bdsm另类| 日本欧美国产在线视频| 国产毛片在线视频| 一级毛片 在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 精品亚洲乱码少妇综合久久| 在线观看av片永久免费下载| 国产高清有码在线观看视频| 免费少妇av软件| 免费电影在线观看免费观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久99热这里只有精品18| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品一区二区免费观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品一及| 一级爰片在线观看| 一级片'在线观看视频| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲av男天堂| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品一及| 国产日韩欧美在线精品| 国产男人的电影天堂91| 一级毛片aaaaaa免费看小| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲伊人久久精品综合| 丝袜喷水一区| 亚洲国产欧美在线一区| 国产淫语在线视频| 91久久精品国产一区二区三区| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 久久这里有精品视频免费| 精品久久久久久久久av| 国产精品人妻久久久久久| av一本久久久久| 午夜视频国产福利| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 在线播放无遮挡| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 免费av毛片视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日本三级黄在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 国产91av在线免费观看| 少妇人妻久久综合中文| 一级爰片在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 久久这里有精品视频免费| 国产精品三级大全| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 69人妻影院| 欧美日本视频| 深爱激情五月婷婷| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品一区二区在线观看99| 大片免费播放器 马上看| 亚洲av二区三区四区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 久久久久精品性色| 亚洲真实伦在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 久久99蜜桃精品久久| 女人被狂操c到高潮| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品久久久久久久久免| 99久久精品热视频| 在线观看一区二区三区激情| 国产黄a三级三级三级人| 少妇的逼水好多| 嫩草影院精品99| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产av国产精品国产| 亚洲色图av天堂| 97热精品久久久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 大香蕉97超碰在线| 日韩人妻高清精品专区| 免费看av在线观看网站| 一区二区av电影网| 国产成人精品一,二区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲三级黄色毛片| 青春草亚洲视频在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美最新免费一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 国产黄色免费在线视频| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品av视频在线免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 午夜免费观看性视频| 我要看日韩黄色一级片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 内地一区二区视频在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久久精品一区二区三区| 我要看日韩黄色一级片| 五月开心婷婷网| 亚洲va在线va天堂va国产| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产人妻一区二区三区在| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品视频人人做人人爽| 青青草视频在线视频观看| 青春草视频在线免费观看| 久久久久久国产a免费观看| 色5月婷婷丁香| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品久久久久久久电影| 最近的中文字幕免费完整| 欧美日韩在线观看h| 中文字幕制服av| 精品久久久久久电影网| 国产一区有黄有色的免费视频| 夫妻午夜视频| 看黄色毛片网站| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美潮喷喷水| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产毛片a区久久久久| 国产综合精华液| 色5月婷婷丁香| 男男h啪啪无遮挡| 欧美xxⅹ黑人| 天堂俺去俺来也www色官网| 男女下面进入的视频免费午夜| 高清在线视频一区二区三区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 美女内射精品一级片tv| 日韩欧美 国产精品| 韩国高清视频一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 成人美女网站在线观看视频| 激情 狠狠 欧美| 精品酒店卫生间| 亚洲四区av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲人成网站在线播| 亚洲av免费在线观看| 看黄色毛片网站| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲精品第二区| 国产一区二区在线观看日韩| 免费少妇av软件| 欧美性感艳星| 国产高清不卡午夜福利| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久精品国产自在天天线| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产欧美亚洲国产| 在线 av 中文字幕| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久久精品94久久精品| 精品酒店卫生间| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲自拍偷在线| 中文在线观看免费www的网站| 成人特级av手机在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲不卡免费看| 高清av免费在线| 亚洲在久久综合| 禁无遮挡网站| 欧美日韩在线观看h| 老女人水多毛片| 在线观看国产h片| 国产男女超爽视频在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 视频区图区小说| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产高清有码在线观看视频| 1000部很黄的大片| 亚洲国产成人一精品久久久| 一边亲一边摸免费视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲在线观看片| 色视频在线一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 我的女老师完整版在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 性色avwww在线观看| 久久99精品国语久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美区成人在线视频| a级毛色黄片| 高清日韩中文字幕在线| 91狼人影院| 国产亚洲av嫩草精品影院| av播播在线观看一区| 国产色爽女视频免费观看| 深爱激情五月婷婷| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 超碰97精品在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品99久久久久久久久| 老司机影院成人| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久韩国三级中文字幕| 男人舔奶头视频| 伊人久久国产一区二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲电影在线观看av| 免费看日本二区| xxx大片免费视频| 天天一区二区日本电影三级| 在线 av 中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 成人午夜精彩视频在线观看| 成人无遮挡网站| 久久99蜜桃精品久久| 国产日韩欧美在线精品| 欧美激情在线99| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 新久久久久国产一级毛片| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品一区二区性色av| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲内射少妇av| 免费av不卡在线播放| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人免费观看mmmm| 内射极品少妇av片p| 久久久久网色| 又大又黄又爽视频免费| 免费av观看视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 成人黄色视频免费在线看| 成人欧美大片| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | av在线播放精品| 中文天堂在线官网| 97在线人人人人妻| 午夜免费鲁丝| 久久久久久九九精品二区国产| 97在线人人人人妻| 日本av手机在线免费观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩强制内射视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲国产欧美人成| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美3d第一页| 亚洲欧洲日产国产| 国产有黄有色有爽视频| 欧美 日韩 精品 国产| 激情五月婷婷亚洲| av.在线天堂| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲最大成人av| 国内精品美女久久久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 国产综合精华液| av网站免费在线观看视频| 国产爽快片一区二区三区| 一级二级三级毛片免费看| 大话2 男鬼变身卡| 直男gayav资源| 日本av手机在线免费观看| 久久精品人妻少妇| 亚洲av成人精品一区久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲欧美精品专区久久| 一级毛片aaaaaa免费看小|