山地五月茶提取物對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的抑制活性研究

馬伏寧 黃東梅 宋順 吳斌 郭剛 王達新 譚琳

摘? 要：為深入了解海南島熱帶野生植物的保健功能及其活性成分，用CCK-8法檢測山地五月茶（Antidesma montanum）果和葉的乙醇提取物對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的抑制活性。結果表明，山地五月茶果和葉的乙醇提取物作用72 h對細胞的半數抑制濃度（IC50）分別為483 μg/mL和306 μg/mL。葉的乙醇提取物分別經石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，比較各有機溶劑萃取相及剩余水相對乳腺癌細胞抑制增殖活性，結果顯示乙酸乙酯相表現出較高的活性，其處理細胞72 h的IC50為150.5 μg/mL。劃痕實驗和Transwell檢測結果表明，乙酸乙酯相提取物具有抑制MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的能力。流式細胞儀檢測結果表明，乙酸乙酯相提取物能夠使MDA-MB-231細胞周期S期顯著延長。UPLC-MS/MS分析結果顯示，乙酸乙酯相含有穗花杉雙黃酮活性成分。穗花杉雙黃酮處理MDA-MB-231細胞72 h的抑制增殖IC50為192.6 μg/mL，表明其是山地五月茶抑癌活性成分之一。

關鍵詞：天然產物;活性成分;乳腺癌;山地五月茶

中圖分類號：R284.2? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： In order to understand the health function and active components of tropical wild plants in Hainan Island the ethanol extract of the fruits and leaves of Antidesma montanum inhibiting the proliferation of breast cancer cells MDA-MB-231 by the CCK-8 method was studied in this research. The IC50 were 483 μg/mL and 306 μg/mL after 72 h treatment. The ethanol extract of the leaves of A. montanum was separated by petroleum ether， ethyl acetate， n-butanol and water respect. The ethyl acetate phase showed higher inhibitory activity than other phases， and the inhibition proliferation IC50 was 150.5 μg/mL after 72 h treatment. Through the wound healing and transwell test， the ethyl acetate phase showed inhibition in migration and invasion activity of MDA-MB-231 cells. The active components could make the S phase in cell division delayed by flow cytometry detection. One of the components was identified as amentoflavone analyzed by UPLC-MS/MS. The IC50 of amentoflavone inhibition proliferation of MDA-MB-231 cells was 192.6 μg/mL after 72 h treatment， which showed its one of the active ingredients in the leaves of A.montanum.

Keywords： natural products; active ingredients; breast cancer; Antidesma montanum

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.025

山地五月茶（Antidesma montanum）屬大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠亞科（Phyllanthoideae Ascherson）五月茶屬（Antidesma）植物。該屬植物廣泛分布于東半球熱帶地區(qū)，常被作為綠化觀賞樹種。五月茶屬植物全球約170種，我國有16種，主要分布于廣東、廣西、福建、貴州、云南和海南等地[1]。五月茶的果實可用于制造果醬、果汁和紅酒等，在泰國、菲律賓、印度尼西亞等國是重要的經濟作物，其嫩葉還可代茶沖泡飲用或作為蔬菜食用[2]。我國傳統(tǒng)醫(yī)藥書籍記載五月茶的根、果、葉均可入藥，《常用中草藥彩色圖譜》中記載五月茶具有“收斂，止瀉，止渴生津，行氣活血”的藥用活性，能“治津液少，消化不良，跌打損傷”[3]。國內外研究結果顯示，五月茶的莖葉中含有酚酸、環(huán)肽和三萜類成分，在抗氧化、抗病毒、抗抑郁等方面具有較好的藥理活性[4-8]。

當今世界乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥，每年全世界約有50萬婦女死于乳腺癌[9]。MDA- MB-231是一種惡性乳腺癌細胞，具有轉移快、侵襲性高、局部復發(fā)早、預后差等特點?；熓窃擃惢颊吣壳拔ㄒ挥行У闹委熓侄?，急需尋找新的治療藥物及治療方法[10]。從植物中發(fā)掘治療腫瘤的活性藥物一直是全球醫(yī)藥科研工作者研究的方向，來自植物的紫杉醇（paclitaxel）是治療乳腺癌和卵巢癌廣泛使用的藥物，但存在水溶性低、不良反應大等缺點[11]。本研究通過分離鑒定海南山地五月茶果和葉中抑制乳腺癌細胞增殖的活性成分，為山地五月茶葉的深入開發(fā)提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 山地五月茶（A. montanum）的果和鮮葉均采自海南省萬寧市興隆鎮(zhèn)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所南藥園。采集的果和葉于40 ℃烘干后粉碎，過40目篩，加入5倍體積的80%乙醇浸泡24 h，超聲輔助提取3次，每次30 min。提取液經過減壓旋轉蒸發(fā)濃縮近干，以超純水溶解后，依次用石油醚（30～60 ℃沸程）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取相經減壓旋轉蒸發(fā)濃縮去除溶劑，冷凍干燥后20 ℃冰箱保存。

乳腺癌細胞MDA-MB-231，購自中國科學院昆明細胞庫。用含有10%新生胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的DMEM 高糖型培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%二氧化碳。取對數生長期細胞進行后續(xù)實驗。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司;結晶紫、羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、穗花杉雙黃酮標準品（HPLC≥98%），上海源葉生物科技有限公司;胰酶細胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液、PBS緩沖液，合肥Biosharp生物科技公司;RNase A溶液，北京索萊寶科技有限公司;細胞核染料PI染色液，江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.1.2? 儀器與設備? Thermo 3111二氧化碳培養(yǎng)箱、MUTiskan GO酶標儀，美國Thermo Fisher公司;Axiovert 40 CFL熒光倒置顯微鏡，德國Zeiss公司;BD FACSCalibur流式細胞儀，美國BD Bioscience公司;UltiMate? 3000高分辨液質聯用儀UPLC-MS/MS，美國Thermo Fisher公司;SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國Agilent Technologies公司。

1.2? 方法

1.2.1? 抑制增殖活性檢測（CCK-8法）? 在96孔板中接種對數生長期的MDA-MB-231細胞，每孔接種2000個，待細胞貼壁后加入不同濃度提取物的DMEM培養(yǎng)基（含0.25%HEPES），以0.1% DMSO的DMEM培養(yǎng)基為空白對照。在處理72 h后，吸除舊培養(yǎng)基，加入10 μL的CCK-8及90 μL培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱靜置1 h后，用酶標儀讀取405 nm吸光度。按照下列公式計算細胞活力：

細胞活力=（A空白組A處理組）/A空白組

用Graphpad Prism 8軟件以提取物濃度的對數值log （X）為橫坐標，提取物的吸光度與對照吸光度的百分比值為縱坐標，做非線性回歸分析，獲得抑制細胞增殖的IC50。

1.2.2? 細胞遷移活性檢測（劃痕實驗）? 在24孔板中接種對數生長期的MDA-MB-231細胞，每孔2×105個細胞，二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后用槍頭劃痕，用PBS緩沖液洗去漂浮細胞，加入不同濃度提取物，24 h后用結晶紫染色細胞，在顯微鏡下拍照，用ImageJ軟件統(tǒng)計處理前后劃痕面積變化，計算抑制遷移率。

1.2.3? 細胞侵襲實驗? 山地五月茶葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相分別配置成25、50、100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基，用含有不同濃度提取物的培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231細胞24 h，經胰酶消化細胞脫壁，用不含牛血清的培養(yǎng)基制備成4×104個/mL 的細胞懸液加入 Transwell小杯（置于24孔板中），Transwell的下層加入含10%牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去孔內細胞，75%乙醇固定0.5 h后用結晶紫染色1 h，洗去多余染液，在顯微鏡下隨機選取5個視野拍照，并計數細胞個數，取5個視野的平均數表示腫瘤細胞的體外遷移和侵襲數。

1.2.4? 流式細胞儀檢測細胞周期變化? 用6孔板，每孔接種5×105個對數生長期的MDA-MB- 231細胞，以含50 g/mL的山地五月茶葉乙酸乙酯萃取相的培養(yǎng)基處理24 h后，以不含EDTA的胰蛋白酶使細胞脫壁，經預冷的PBS洗2遍，1500 r/min離心5 min，棄上清并用預冷的PBS洗2遍，用預冷的70%乙醇固定，20 ℃冰箱過夜。檢測前用預冷的PBS洗2遍，離心、棄上清，加入2 μL濃度為1 mg/mL的核糖核酸酶（RNaseA），37 ℃水浴30 min，加入400 μL PI染色液，暗處反應30 min后，用流式細胞儀檢測提取物對細胞周期的影響。

1.2.5? UPLC-MS/MS分析? 將活性組分進行UPLC-MS/MS分析，以甲醇（A）和0.5%甲酸水

溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～10 min，40%～ 60%A;15～25 min，80%A;25～30 min，40% A）。流速0.4 mL/min，柱溫28 ℃，進樣體積10 μL。質譜檢測條件：電噴霧離子源（ESI），正負離子模式，霧化N2體積流量為800 L/h，脫溶劑氣溫度為400 ℃，錐孔氣流量為50 L/h，離子源溫度100 ℃，毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓40 V，離子噴霧電壓（ESI）2200 V和（ESI+）3000 V;MSE掃描模式檢測，掃描范圍m/z 100～1500 。

1.3? 數據分析

所有實驗均設3次以上重復，采用Graphpad Prism 8.0.1軟件進行數據處理，并進行差異顯著性分析。

2? 結果與分析

2.1? 提取物對乳腺癌細胞增殖的抑制

分別將山地五月茶的果和葉乙醇提取物用DMSO溶解，DMEM培養(yǎng)基稀釋至一定濃度，測試其對MDA-MB-231乳腺癌細胞的增殖抑制活性，結果見圖1。乙醇提取物抑制MDA-MB-231細胞增殖的活性，隨濃度增加而增強。果和葉的乙醇提取物對MDA-MB-231細胞72 h的IC50分別為483 、306 μg/mL，葉提取物的抑制增殖活性高于果的提取物。

分別將山地五月茶葉乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取相及水相提取物的濃度稀釋至200 μg/mL，檢測其對MDA-MB-231細胞增殖的抑制活性。結果表明，在幾種萃取相中，乙酸乙酯萃取相的抑制細胞增殖活性最高，水相的活性最低（圖1C）。進一步分析乙酸乙酯萃取相在不同濃度時對MDA-MB-231細胞增值的抑制作用（圖1D），計算得出其作用72 h的IC50為150.5 μg/mL。

2.2? 提取物對細胞遷移的影響

考察山地五月茶葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相對MDA-MB-231細胞遷移活性的影響，結果表明100 μg/mL的乙酸乙酯萃取相處理MDA- MB-231細胞24 h后，與對照相比提取物對細胞遷移的平均抑制率達86%（圖2）。本研究還考察了更低濃度提取物處理對細胞遷移活性的影響，結果顯示隨著提取物濃度的降低，其對細胞遷移的抑制率也逐漸減小。

2.3? 提取物對細胞侵襲的影響

不同濃度山地五月茶葉提取物的乙酸乙酯萃取相處理乳腺癌MDA-MB-231細胞，圖3結果表明，隨著濃度的提高，乙酸乙酯萃取相提取物對MDA- MB-231細胞遷移抑制活性也提高。25、50、100 μg/mL提取物處理后的穿過膜孔的細胞數量分別為對照的69.9%、37.6%和34.3%，表明五月茶葉提取物的乙酸乙酯萃取相中含有抑制MDA- MB-231細胞侵襲的活性成分。

2.4? 提取物對細胞周期的影響

通過流式細胞儀檢測山地五月茶葉提取物乙酸乙酯萃取相對MDA-MB-231細胞周期的影響，結果見圖4。由結果可知，以50 μg/mL的乙酸乙酯萃取相處理細胞24 h，能增加G0/G1期和S期細胞的數量，減少G2期的細胞數量。與空白對照相比，G0/G1期細胞的數量平均由54.5%增加到55.6%，S期細胞數由25.6%增加到32.0%，G2期細胞數量由14.5%減少到6.5%。說明山地五月茶乙酸乙酯萃取相活性成分能夠阻滯MDA-MB- 231細胞周期在S期，從而抑制其增殖。

2.5? 提取物活性成分的UPLC-MS/MS分析

經過UPLC-MS/MS分析山地五月茶葉乙酸乙酯萃取相活性組分組成，在22.3 min出峰的成分經質譜鑒定為穗花杉雙黃酮（圖5）。穗花杉雙黃酮的分子量為538.4579，分子式為C30H18O10，實際質譜檢測其分子離子峰m/z 539.1001為[M+H]+，m/z 615.1444為[M+Na]+離子特征峰（圖6）。穗花杉雙黃酮標準品的液相出峰時間及質譜信息與山地五月茶葉乙酸乙酯萃取相活性組分中一致，認定其為同一種物質。

2.6? 活性成分抑制細胞增殖活性

穗花杉雙黃酮標準品配制成濃度為500、250、125、62.50、31.25 μg/mL的DMEM細胞培養(yǎng)液，處理MDA-MB-231細胞72 h的抑制細胞增殖IC50為192.6 μg/mL，說明穗花杉雙黃酮化合物具有抑制MDA-MB-231細胞增殖的活性（圖7）。

3? 討論

本研究對山地五月茶（A. montanum）果實及葉提取物抑制MDA-MB-231細胞增殖的作用進行了研究，山地五月茶葉提取物主要活性物質在乙酸乙酯萃取相，其對細胞的抑制增殖作用具有劑量依賴性，可將乳腺癌細胞S期延長，導致細胞不能增殖。劃痕實驗和Transwell實驗結果證明，山地五月茶葉的提取物能有效抑制MDA- MB-231細胞的遷移和侵襲。

國外早期研究顯示，五月茶（A. bunus）葉和果實的甲醇粗提物對鹵蟲藻（Artemia salina）有細胞毒活性[12]。五月茶全株含有多種維生素如硫胺素（thiamine）、核黃素（riboflavine）、煙酸（nicotinic acid）[13]，果實中含有較多的沒食子酸（gallic acid）、（-）-表兒茶素[（-）-epicatechin]、（+）-焦兒茶酸[（+）-catechin]、矢車菊素（cyanidin-3-O- glucoside）[14]。研究表明，山地五月茶（A. montanum）地上植株含有黃酮類、甾萜類、生物堿類、酚類、蒽醌類成分，乙酸乙酯相提取物有抗炎活性[15-16]。

本研究的結果也表明，山地五月茶（A. montanum）葉提取物抑制MDA-MB-231細胞增殖的活性成分主要在乙酸乙酯萃取相，乙酸乙酯萃取相中主要活性成分是一種黃酮類物質——穗花杉雙黃酮（amentoflavone），該萃取相其他組分的化學結構及細胞活性有待進一步研究。

穗花杉雙黃酮最早是從卷柏（Selaginella tamariscina）中分離的一種多酚化合物[17]，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、降血糖及抗腫瘤等多種生物學活性[18-19]。Lee等[20]研究表明穗花杉雙黃酮通過抑制脂肪酸合成酶而抑制SK-BR-3乳腺癌細胞的增殖。本研究發(fā)現，山地五月茶（A. montanum）的葉中含有穗花杉雙黃酮，是其抑制乳腺癌細胞增殖的活性成分之一。

通常癌癥的形成需要幾十年的時間，在飲食中注意長期持續(xù)攝取具有抑制癌細胞生長的食物是預防癌癥的一種可取的生活方式。山地五月茶能夠抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲活性，有望開發(fā)為具有預防和治療乳腺癌功能的保健茶產品。

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