巴西橡膠樹(shù)小孢子單細(xì)胞顯微分離研究

楊星星 王英 莊南生 高和瓊 王宇翔

摘? 要：巴西橡膠樹(shù)是一種重要的熱帶作物。以巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97處于減數(shù)分裂四分體時(shí)期的幼嫩雄花為試驗(yàn)材料來(lái)獲取單細(xì)胞，利用5%纖維素酶、5%果膠酶、5% β-葡聚糖酶、5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶4種酶液，探索酶解四分體胼胝質(zhì)的最佳方案。結(jié)果表明：在37 ℃條件下酶解1 h，5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶的酶解效果最佳，可得到品質(zhì)良好的小孢子單細(xì)胞。通過(guò)對(duì)拉制針尖細(xì)長(zhǎng)度、磨針斜口直徑以及顯微操作分離體系的不斷探索與試驗(yàn)，成功建立一套適合巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97小孢子單細(xì)胞的顯微分離技術(shù)體系。小孢子單細(xì)胞是減數(shù)分裂的直接產(chǎn)物，對(duì)小孢子單細(xì)胞進(jìn)行分離并分析可精確解析橡膠樹(shù)減數(shù)分裂過(guò)程中基因的重組與交換，確定橡膠樹(shù)基因組的變異情況。該研究結(jié)果將為橡膠樹(shù)單細(xì)胞全基因組測(cè)序提供理論與技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹(shù);顯微分離;單細(xì)胞;四分體

中圖分類號(hào)：Q943? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Hevea brasiliensis is an important tropical crop. In this study， the young male flowers of ‘Reyan 7-33-97 in the meiotic tetrad period were used as the experimental materials to obtain single cells. Four enzymatic solutions， 5% cellulose， 5% pectinase， 5% β-glucanase， 5% cellulase and 4% pectinase mixed enzyme solution， were used in the experiment to explore the best scheme for the degradation of tetrad callose. As a result， under the condition of 1 h and 37 ℃， 5% cellulase and 4% pectinase mixed enzyme solution had the best enzymatic hydrolysis effect， and the single microspore with good quality could be obtained. Through the continuous exploration and experiment on the fine length of the needle tip， the diameter of the sharpening of the needle and the micro-operation separation system， a set of microdissection technology system suitable for the single microspore of ‘Reyan 7-33-97 was successfully established. Single-microspores were the direct products of meiosis. The separation and analysis of single cells could accurately resolve gene recombination and exchange during the meiosis of rubber trees， and determine the genomic variation. The study would provide theoretical and technical support for single-cell whole genome sequencing of H. brasiliensis.

Keywords： Hevea brasiliensis; microdissection; single cell; tetrad

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.003

顯微操作分離技術(shù)是利用倒置顯微鏡、顯微操作器，結(jié)合電動(dòng)機(jī)械控制的毛細(xì)玻璃針進(jìn)行分離單個(gè)細(xì)胞或者單染色體的技術(shù)[1-2]，操作具有靈活取樣、目標(biāo)明確、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是一種較常用的分離技術(shù)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自顯微分離技術(shù)建立以來(lái)，就因其優(yōu)勢(shì)在動(dòng)物遺傳學(xué)[3-5]、醫(yī)學(xué)[6-7]、微生物學(xué)[8-10]等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而，由于植物細(xì)胞的特異性，這項(xiàng)技術(shù)在植物中的應(yīng)用受到限制，技術(shù)進(jìn)展緩慢。隨著植物細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展及研究者在技術(shù)上的不斷追求與創(chuàng)新，植物顯微操作分離技術(shù)被日益完善，也相繼實(shí)現(xiàn)了植物染色體[10-11]、體細(xì)胞[12-13]等的分離。在植物中的單細(xì)胞分離技術(shù)是實(shí)現(xiàn)植物單細(xì)胞水平研究的基礎(chǔ)[14]，可為構(gòu)建SNP細(xì)胞遺傳圖譜、植物分子育種等研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。近年來(lái)，在測(cè)序時(shí)，研究者采用的樣品多是細(xì)胞群體或是大量細(xì)胞的混合DNA，這樣獲得的全基因組序列信息，僅是多數(shù)占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞所表達(dá)的某些明顯的序列信息，而忽視了少數(shù)細(xì)胞表達(dá)的差異性[15-18]。世界上不可能存在2個(gè)完全相同的細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞間的表達(dá)調(diào)控同樣存在差異[19]，為了獲得細(xì)胞異質(zhì)性表達(dá)的微量序列信息，單細(xì)胞全基因組測(cè)序應(yīng)運(yùn)而生。目前，關(guān)于植物單細(xì)胞的分離研究已有少量報(bào)道，如2015年李響[20]利用顯微分離技術(shù)成功分離出玉米小孢子單細(xì)胞，解析了玉米減數(shù)分裂重組機(jī)制，構(gòu)建了玉米SNP圖譜;Kubo等[21]利用顯微分離技術(shù)成功分離出小立碗蘚葉片的單細(xì)胞，建立了單細(xì)胞數(shù)字基因表達(dá)，完成單細(xì)胞測(cè)序。

2.3? 4種酶液對(duì)巴西橡膠樹(shù)雄花四分體胼胝質(zhì)的酶解效果

小孢子母細(xì)胞發(fā)育到減數(shù)分裂后期，胼胝質(zhì)包裹著四分體。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)若要得到小孢子單細(xì)胞，通過(guò)物理手段難以實(shí)現(xiàn)。本研究對(duì)4種酶液在不同溫度及時(shí)間條件下的巴西橡膠樹(shù)雄花四分體胼胝質(zhì)的酶解效果進(jìn)行探索，結(jié)果見(jiàn)表3和圖3。從表3可見(jiàn)，同種酶液在相同的酶解時(shí)間內(nèi)，溫度對(duì)四分體胼胝質(zhì)的酶解情況影響不大。圖3展示的是37 ℃條件下4種酶液在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)四分體胼胝質(zhì)的酶解情況。綜合分析表3和圖3可知，（1）酶解1 h時(shí)，5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶完全酶解四分體胼胝質(zhì)，釋放出小孢子單細(xì)胞，酶解率為100%（圖3A），其余3種酶液均未釋放出小孢子單細(xì)胞;其中，5%纖維素酶開(kāi)始酶解四分體外圍胼胝質(zhì)，酶解率約為65%～75%（圖3B），而5%果膠酶、5%β-葡聚糖酶均未酶解胼胝質(zhì)，酶解率為0（圖3C、D）。（2）酶解3 h時(shí)，5%纖維素酶基本酶解四分體外圍胼胝質(zhì)，酶解率約為88%～90%;5%果膠酶開(kāi)始起作用，出現(xiàn)釋放小孢子單細(xì)胞現(xiàn)象，酶解率約為25%～ 32%;5% β-葡聚糖酶未酶解胼胝質(zhì)，酶解率為0（圖3E～G）。（3）酶解6 h時(shí)，5%纖維素酶完全酶解掉外圍胼胝質(zhì)，酶解率達(dá)到95%～98%，但四分體的4個(gè)小孢子單細(xì)胞仍然相連;5%果膠酶酶解釋放出多個(gè)小孢子單細(xì)胞，但仍有胼胝質(zhì)殘留，酶解率約80%～85%;5% β-葡聚糖酶的酶解率僅有20%～25%，可使胼胝質(zhì)層變薄，但不能釋放出小孢子單細(xì)胞（圖3H～J）。研究結(jié)果表明：在37 ℃條件下，采用5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶，酶解時(shí)間為1 h時(shí)是酶解巴西橡膠樹(shù)雄花四分體胼胝質(zhì)的最佳方案。在適宜溫度內(nèi)，橡膠樹(shù)四分體胼胝質(zhì)的酶解效果與酶液種類與酶解時(shí)間有關(guān)，其酶解效率見(jiàn)表3。

2.4? 巴西橡膠樹(shù)小孢子單細(xì)胞的顯微分離技術(shù)體系

借助已建立的巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97單個(gè)四分體的顯微分離技術(shù)體系，分離出單個(gè)四分體，利用酶解四分體釋放出的4個(gè)小孢子單細(xì)胞，建立適合于分離巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97小孢子單細(xì)胞的顯微分離技術(shù)體系。具體體系如下：（1）37 ℃條件下，采用5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶酶解1 h，釋放出4個(gè)小孢子單細(xì)胞;步驟（2）～（8）參照已建立的巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97單個(gè)四分體的顯微分離技術(shù)體系（1）～（7），其中步驟（3）因?yàn)榉蛛x材料的不同，略有改動(dòng)，磨出的斜口直徑調(diào)整為30～40 μm;（9）重復(fù)步驟（6）～（8），直至將4個(gè)小孢子單細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移于含有10 μL 27%山梨醇緩沖液的PCR管內(nèi)，4 ℃冰箱中保存。利用該技術(shù)體系，先后成功分離出582個(gè)小孢子單細(xì)胞，成功率約為90%，其中完整的來(lái)自同一個(gè)四分體的4個(gè)單細(xì)胞的成功率為70%～80%。巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97小孢子單細(xì)胞的顯微分離過(guò)程如圖4所示。

3? 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在制備巴西橡膠樹(shù)雄花的四分體標(biāo)本時(shí)，未經(jīng)染色的巴西橡膠樹(shù)雄花在相差顯微鏡下無(wú)法觀察到四分體細(xì)胞，所以需要在制備四分體懸液前對(duì)雄花進(jìn)行染色。改卡寶品紅主要應(yīng)用于減數(shù)分裂、染色體染色，具有染色效果好、時(shí)間短、染色穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是很好的細(xì)胞染色劑[30]，故采用改卡寶品紅染色液對(duì)橡膠樹(shù)雄花進(jìn)行染色處理。在制備標(biāo)本過(guò)程中，為了盡量避免外源污染，對(duì)試驗(yàn)中所用試劑、載玻片、鑷子等試驗(yàn)器具進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理，整個(gè)制備過(guò)程在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。在標(biāo)本制備中，筆者發(fā)現(xiàn)初制備的細(xì)胞懸液在一定程度上含有花藥壁等雜質(zhì)，因此我們利用移液器對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單的細(xì)胞稀釋與挑選，有利于后期利用顯微分離獲得干凈、無(wú)雜質(zhì)的橡膠樹(shù)單個(gè)四分體。

胼胝質(zhì)是一種以β-1，3鍵結(jié)合形成的線性葡聚糖[31-32]，廣泛存在于高等植物的細(xì)胞壁中[33]，在植物的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其合成與分解可直接影響植物正常的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。四分體是花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂后形成的產(chǎn)物，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂前期開(kāi)始形成胼胝質(zhì)，在早四分體時(shí)期達(dá)到最厚，形成雄配子體前胼胝質(zhì)未解體[34]。本研究為了得到來(lái)源于同一四分體的4個(gè)小孢子單細(xì)胞，筆者利用顯微分離得到的單個(gè)四分體，對(duì)其進(jìn)行酶解因素的探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在37 ℃條件下酶解1 h，利用5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶降解四分體胼胝質(zhì)的效果最佳，這與高和瓊等[27]在制備橡膠樹(shù)染色體標(biāo)本時(shí)所達(dá)到的試驗(yàn)結(jié)果類似。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)5%纖維素酶和5%果膠酶也具備酶解胼胝質(zhì)作用，但2種酶液的酶解方式有所不同，纖維素酶從四分體外部逐漸溶解胼胝質(zhì)，但不具備釋放4個(gè)單細(xì)胞的作用，5%果膠酶則直接作用于小孢子單細(xì)胞所在部位的胼胝質(zhì)，逐一釋放小孢子單細(xì)胞，雖可達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康模钑r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，建議不采用，纖維素酶與果膠酶酶解四分體胼胝質(zhì)的方式與鄧秀新等[35]報(bào)道的酶解柑桔四分體原生質(zhì)體的方式相同。

本研究利用顯微操作技術(shù)分離單個(gè)四分體和小孢子單細(xì)胞。在操作前使用乙醇脫脂棉對(duì)拉針儀、磨針儀以及倒置顯微鏡等儀器設(shè)備進(jìn)行酒精消毒，試驗(yàn)所用試劑、工具等進(jìn)行嚴(yán)格滅菌處理，盡量減少在試驗(yàn)過(guò)程中可能產(chǎn)生的外源污染，這與王發(fā)明等[36]、殷卉等[37]在顯微分離植物單染色體試驗(yàn)中減少污染的方法相同。為了建立一套適合分離橡膠樹(shù)單個(gè)四分體和小孢子單細(xì)胞的顯微分離技術(shù)體系，筆者對(duì)試驗(yàn)體系進(jìn)行了嚴(yán)格的分析與摸索。筆者發(fā)現(xiàn)，拉針時(shí)，拉針儀的熱值越高，針尖越長(zhǎng)，口徑越細(xì)，為保證針尖部位的細(xì)長(zhǎng)，設(shè)置80 ℃高溫，以避免毛細(xì)玻璃針在磨取針尖部位后，管壁口徑太大，影響視野;分離單個(gè)四分體時(shí)，因四分體直徑大小約60 μm，毛細(xì)玻璃針磨取的斜口直徑需>60 μm，分離小孢子單細(xì)胞時(shí)，考慮到小孢子單細(xì)胞直徑大小過(guò)小約30 μm，因此在磨制玻璃針時(shí)，調(diào)整斜口直徑為30～40 μm;利用5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶獲得的小孢子單細(xì)胞，為避免有酶液殘留，在分離過(guò)程中需要多次更換27%山梨醇緩沖液的液體環(huán)境，反復(fù)進(jìn)行吸取與吹打，保證最終分離保存的小孢子單細(xì)胞無(wú)酶液殘留。通過(guò)總結(jié)顯微分離經(jīng)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)分離單個(gè)四分體的成功率可達(dá)100%，但分離小孢子單細(xì)胞的成功率約為90%，其中來(lái)自同一個(gè)四分體的4個(gè)單細(xì)胞的成功率僅為70%～80%。分析出現(xiàn)這種情況的原因：一方面是小孢子單細(xì)胞過(guò)小，在分離過(guò)程中會(huì)丟失;另一方面是操作者的分離技術(shù)。因此，操作者應(yīng)熟練掌握分離技術(shù)，提高操作水平，是保證試驗(yàn)成功的基礎(chǔ)。

馮素萍， 李維國(guó)， 于? 飛， 等. 巴西橡膠樹(shù)SSR遺傳圖譜的構(gòu)建[J]. 遺傳， 2010， 32（8）： 857-863.

劉正林， 莊南生， 王? 英， 等. 巴西橡膠樹(shù)HbWRKY基因家族10個(gè)成員在染色體上的定位[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2018， 19（6）： 1170-1179.

Tang C R， Yang M， Fang Y J， et al. The rubber tree genome reveals new insights into rubber production and species adaptation[J]. Nature Plants， 2016， 2（6）： 16073.

孫愛(ài)花， 李? 哲， 黃天帶. 橡膠樹(shù)花藥的培養(yǎng)[J]. 植物生理通訊， 2006， 42（4）： 785-789.

馮? 斗， 王建嶺， 席世麗， 等. 木薯根尖染色體的觀察技術(shù)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 36（9）： 3711-3712.

高和瓊， 王? 英， 金? 鴿， 等. 橡膠樹(shù)葉片染色體制片方法的優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009， 30（5）： 565-569.

陳學(xué)俊， 王? 英， 高和瓊， 等. 巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97單染色體顯微分離與擴(kuò)增[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2014， 30（13）： 29-33.

張?jiān)丛矗?李國(guó)華， 龍青姨， 等. 橡膠樹(shù)不同品種雌花分布和座果規(guī)律研究[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 31（3）： 242-247.

劉曉瑞， 陳祖鏗， 劉家熙. 植物小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中胼胝質(zhì)染色的新方法[J]. 植物學(xué)通報(bào)， 2008， 25（4）： 455-458.

王元軍. 植物體內(nèi)的胼胝質(zhì)[J]. 生物學(xué)通報(bào)， 2005（1）： 18-19.

郝建華， 強(qiáng)? 勝. 被子植物有性和無(wú)融合生殖過(guò)程中胼胝質(zhì)壁的動(dòng)態(tài)變化及其生物學(xué)意義[J]. 植物生理通訊， 2006， 42（1）： 141-147.

Chen X Y， Kim J Y. Callose synthesis in higher plants[J]. Plant Signal Behavior， 2009， 4（6）： 489-492.

謝石文， 邱德勃， 王哲魁， 等. 橡膠樹(shù)花藥和小孢子發(fā)生與發(fā)育過(guò)程的觀察[J]. 華南植物學(xué)報(bào)， 1993（1）： 25-30.

鄧秀新， 章文才. 柑桔四分體小孢子原生質(zhì)體的分離[J]. 中國(guó)柑桔， 1990（1）： 7-8.

王發(fā)明， 王? 平， 唐? 琦， 等. 柚（Citrus grandis Osbeck）單染色體LA-PCR-AFLP技術(shù)體系中外源污染的防控[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（12）： 2135-2141.

殷? 卉， 王? 英， 高和瓊， 等. 巴西橡膠樹(shù)單染色體顯微分離及其兩種體外擴(kuò)增方法比較[J]. 分子植物育種， 2015，? 13（11）： 2584-2589.