舌癌單細胞培養(yǎng)建系與癌干細胞相關標志的檢測

姚金光　解繼勝　李俊等

[摘要] 目的 以舌癌Tca8113M1細胞系單細胞培養(yǎng)建系為基礎，觀察Tca8113M1細胞系中舌癌干細胞存在的現象及其相關標志的變化規(guī)律。方法 選取Tca8113M1細胞系，以有限稀釋法進行體外單細胞培養(yǎng)并建立細胞亞系，在證實其成瘤性的基礎上，進一步采用流式細胞術檢測癌干細胞相關標志CD44、CD184、細胞外可溶性抗原（ESA）的表

達情況，著重觀察單個細胞培養(yǎng)形成細胞克隆的形態(tài)與時間。結果 以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單個細胞，在96孔板中進行體外培養(yǎng)，獲取12個細胞亞系（獲取比例為6.25%），均有高成瘤性。癌干細胞相關標志CD44

與ESA均為高水平表達，而CD184表達則在12個細胞系之間有差異。在單個細胞培養(yǎng)中，形成完全克隆、部分克隆與旁克隆3種形態(tài)，12個細胞亞系均源于單個細胞形成的完全克隆，均可進行連續(xù)傳代與擴增，而部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡。結論 Tca8113M1細胞系中可能存在癌干細胞，而單細胞培養(yǎng)可形成完全克隆并建立細胞亞系，是進行舌癌干細胞后續(xù)研究重要的細胞培養(yǎng)模式。

[關鍵詞] 單細胞； 有限稀釋法； 舌癌干細胞； 完全克隆

[中圖分類號] Q 21 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細胞是癌組織中一小群具有干細胞特性的細胞，具有自我復制與更新的能力，而且增殖與分裂能力極強，少量細胞即可形成體外移植瘤[1]。近年

有關腫瘤發(fā)生、轉移、耐藥與復發(fā)等諸多難題均從癌干細胞的角度進行研究。這種研究的基礎和前提是明確癌干細胞的標志或分離出癌干細胞，以提供研究的靶細胞。目前已發(fā)現多種永生性癌細胞系中存在有癌干細胞，Tca8113M1舌癌細胞系同樣可能存在有癌干細胞，可以作為舌癌干細胞的研究對象。鑒于癌干細胞獨特的自我復制與更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌細胞系為研究對象，采用有限稀釋法分離出單個舌癌細胞進行體外培養(yǎng)，利用癌干細胞的自我復制能力進行分裂增殖，形成預期的單細胞克隆，進一步形成細胞亞系，以此證明Tca8113M1

舌癌細胞系中存在癌干細胞的可能性，同時檢測細胞亞系癌干細胞標志的表達情況，觀察不同細胞亞系的生物學特性，并且動態(tài)觀察單細胞培養(yǎng)中細胞克隆形成的規(guī)律，為從Tca8113M1細胞系中分離舌癌干細胞提供前期實驗依據。

1 材料和方法

1.1 舌癌細胞系來源

人舌癌細胞系Tca8113由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室建系，四川大學華西口腔醫(yī)院贈送。右江民族醫(yī)學院腫瘤分子生物學實驗室在此基礎上建立了轉移人舌癌細胞系Tca8113M1[2]。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清（Hyclone公司，美國），RPMI1640培

養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；PE標記抗人CD44抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的抗人細胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-

gen，ESA）抗體，PE/cy5標記抗人CD184抗體，同

型對照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司），流式細胞儀（BD公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日

本）。

1.3 體外單細胞培養(yǎng)、建系及細胞克隆生長的動態(tài)

觀察

采用有限稀釋法進行體外單細胞培養(yǎng)與建系。Tca8113M1細胞經復蘇后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細胞制備細胞懸液，轉移至96孔板，采用有限稀釋法保證每個孔有1個細胞，在倒置顯微鏡下觀察其生長和增殖情況，待其生長成多個細胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化轉移至6孔板擴增培養(yǎng)后，在培養(yǎng)瓶中反復傳代建立細胞亞系。此外，在此培養(yǎng)過程中動態(tài)觀察單個細胞形成細胞克隆的形態(tài)與生長情況，觀察時點分別為3 d和1、2、3周。

1.4 舌癌細胞亞系成瘤性檢測

建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養(yǎng)Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細胞亞系細胞，選取形態(tài)良好的生長期細胞，在生長旺盛時接種。具體步驟如下：消化收集舌癌細胞，800 r·min-1離心3～

5 min，棄上清液，計數細胞總量，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液按每毫升1×107個細胞的密度稀釋細胞；消毒裸鼠右腋窩的皮膚，將細胞接種于皮下，以皮下結節(jié)直徑超過1.0 cm為成瘤標準。共接種裸鼠45只，具體分組如下：1）Tca8113M1舌癌細胞亞系組，共12個亞系，每組3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌細胞組，6只，為母系細胞系對照組；3）Tca8113舌癌細胞組，3只，為來源細胞系對照組。

1.5 流式細胞術檢測舌癌細胞亞系癌干細胞相關標

志CD44、CD184、ESA的表達情況

將舌癌細胞（密度為每毫升1×106個）消化以后，800 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入D-hanks液重懸，盡量將細胞吹散，將細胞懸液分別移入試管中（每管體積為500 μL），設置對照管和樣本管。在對照管中加入同型對照抗體（分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠

IgG1與小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在樣本管中加入熒光抗體（PE標記抗人CD44、FITC標記抗人ESA、PE/cy5

標記抗人CD184）各5 μL，置于避光環(huán)境下室溫孵育30 min，然后于流式細胞儀上檢測CD44、CD184、ESA的表達情況。

2 結果

2.1 Tca8113M1細胞體外單細胞建系培養(yǎng)

Tca8113M1單細胞培養(yǎng)12 h后，細胞貼壁；24 h后部分細胞出現變大變薄、空泡樣變等老化現象；3 d后，有7個孔的細胞出現增殖分裂現象；7～10 d后有12個孔的細胞開始增殖為單個或數個完全細胞克?。寺⌒纬蛇^程見圖l）。

培養(yǎng)4～6周后，細胞基本達到穩(wěn)定生長并增殖的狀態(tài)，以癌細胞的克隆樣生長為主，細胞呈鋪路石狀，可見巨核、多核細胞，核分裂象多見。待培養(yǎng)孔接近80%鋪滿時，將細胞轉移至6孔板上擴增培養(yǎng)，1～2周后轉移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單細胞，并在96孔板中進行體外傳代建系培養(yǎng)，獲取12個細胞亞系，比例為6.25%，分別命名為Tca8113-S1～Tca8113-S12。

2.2 Tca8113M1細胞體外單細胞培養(yǎng)形成細胞克隆

的動態(tài)觀察

以3 d和1、2、3周為觀察時點，發(fā)現單個細胞形成細胞克隆的形態(tài)主要有3種：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12細胞亞系的細胞均源于單個細胞形成的完全克隆，均可以進行連續(xù)傳代與細胞培養(yǎng)擴增，而其他單個細胞培養(yǎng)形成的部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡，未能連續(xù)傳代進行細胞擴增。3種克隆在培養(yǎng)過程中的變化情況如下。1）完全克?。杭毎g緊湊密集成型，增殖速度快，其中1～2周為典型的完全克隆狀，3周時在細胞克隆中央出現細胞重疊生長現象（圖2中A1～A4）；2）部分克隆：克隆形態(tài)界于旁克隆與完全克隆之間，細胞間較疏松，其中1～2周為典型的部分克隆狀，但第3周細胞克隆疏松，形狀消散，

有轉變?yōu)榕钥寺〉内厔荩▓D2中B1～B4）；3）旁克?。?/p>

細胞間疏松不成型，第1周較典型，第2、3周后細胞老化（圖2中C1～C4）。

2.3 Tca8113M1舌癌細胞亞系成瘤情況

將舌癌細胞亞系Tca8113-S1～Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后，1周后可觸及皮下結節(jié)，表面光滑、質硬、可活動；2周后可見皮下結節(jié)生長迅速；3～4周后皮下結節(jié)最大直徑達1.0 cm以上。含對照組在內的45只裸鼠均接種成瘤，成瘤率為100%。

2.4 流式細胞術檢測細胞亞系癌干細胞相關標志

CD44、CD184、ESA表達情況

流式細胞術檢測結果見表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽性表達率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外，其余細胞亞系ESA的陽性表達率均在80%以上；各亞系CD44陽性表達率均很高，除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外，其余亞系的陽性率均在90%以上；12個亞系的CD184表達存在差異，陽性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動。

3 討論

本研究利用有限稀釋法等經典的細胞培養(yǎng)技術，以舌癌Tca8113M1細胞系為研究對象，隨機選取192個舌癌細胞，在96孔板中進行單細胞培養(yǎng)，經過長期傳代培養(yǎng)，共建立12個舌癌Tca8113細胞亞系，比例為6.25%，而且都具備很強的成瘤性。進一步檢測12個Tca8113細胞亞系的癌干細胞相關標志，結果發(fā)現：CD44與ESA均為高水平表達，陽性表達率多在90%左右，而CD184的陽性表達率則各有不同。據此結果可以結合癌干細胞的生物學特性對本實驗獲得的細胞系進行分析。

本研究發(fā)現：舌癌Tca8113M1細胞系中有6.25%的單個細胞可以進行自我分裂、增殖，形成細胞亞系。還有研究[3]發(fā)現：Tca8113細胞連續(xù)經過兩次單細胞培養(yǎng)實驗，其中具備分裂增殖活性的細胞比例為5.09%～10.85%。這提示即使在永生化細胞系中，具備持續(xù)增殖能力的細胞占整個群體的比例都較少。根據目前的文獻[4]報道，在癌細胞群或組織中，癌干

細胞比例為0.01%～5%；體外培養(yǎng)的永生化癌干細胞系中，癌干細胞的比例可能偏高一些。本研究采用經典的有限稀釋法獲取單個細胞，這種細胞表現出強大的增殖與分裂活力，而且還形成了成瘤性很強的細胞亞系。這些單個培養(yǎng)的細胞是否就是癌干細胞尚需進行單細胞水平的鑒定，但可以大膽推測的是，其中應該包含有癌干細胞。腫瘤干細胞的概念于20世紀60年代提出，并據此建立了腫瘤細胞克隆實驗。本研究在單個細胞培養(yǎng)中也發(fā)現，單細胞的增殖方式是克隆樣增殖，即形成一個細胞克隆后擴大生長，并且在周圍形成小的細胞克隆，最后融合成片，但究其細胞來源就是一個癌細胞而已，所有后續(xù)的細胞克隆與癌細胞就是源于它，所以可以認為該細胞具有癌干細胞的潛質，可以考慮從癌細胞系中篩選癌干細胞。

在12個Tca8113細胞亞系中，為明確其癌干細胞相關標志的表達情況，為后續(xù)舌癌干細胞的篩選提供前期實驗數據，本研究綜合文獻報道，選取了CD44、ESA與CD184等癌干細胞相關標志進行檢測。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結腸癌等上皮組織的癌干細胞的相關標志，CD184是胰腺癌干細胞的相關標志；ESA則是上皮來源的癌干細胞標志，而且屬于細胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個細胞亞系中，

CD44與ESA均處于高水平表達，而CD184的表達則高低不一，其中亞系間均數差值最大者接近60%。從這3個指標的表達情況來分析，可以進行如下推測：1）CD44與ESA是不同細胞亞系共有的標志，提示這些細胞亞系可能具有共同的組織起源；2）CD184的差異性表達提示Tca8113細胞系中存在細胞異質性，但從其比例來看，大致有3個等級，即15%、30%、50%以上，提示其生物學特性可能有明顯的差別，但可作為舌癌干細胞研究的候選細胞群體進行研究。

此外，在單個細胞培養(yǎng)基礎上建立細胞亞系的過程中，筆者發(fā)現單個細胞形成細胞克隆的形態(tài)與細胞最后成系關系密切。在單個細胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中，只有完全克隆能夠形成細胞亞系，而且這些細胞亞系表現出腫瘤的異質性與成瘤性，而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴增培養(yǎng)過程中逐漸老化或消亡。這一結果可進行逆向推理：將最初形成完全克隆的12個細胞確定為舌癌干細胞，而其形成的完全克隆則是癌干細胞自我更新與增殖的結果，其中可能富含癌干細胞。這一觀點也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經膠質瘤等相關研究[7-12]所證實。這些研究發(fā)現完全克隆細胞可以高表達癌干細胞標志；接種1 000個完全克隆前列腺癌細胞就可形成移植瘤；通過懸浮球培養(yǎng)的癌細胞球在消化后進行單細胞培養(yǎng)，可以形成高比例的完全克隆。有學者[13]進一步在頭頸腫瘤細胞系中發(fā)現，CD133與CD44陽性表達的癌細胞多形成完全克隆，而CD133與CD44陰性的癌細胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆，從而認為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細胞的標志。由此可見，完全克隆為癌干細胞的自我更新方式與富集、純化癌

干細胞及癌干細胞標志的研究提供了新的途徑，近年在癌干細胞研究中逐漸被應用和關注[11]。此外，針對完全克隆的研究切入時間與方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在單個細胞培養(yǎng)1～2周時形成，最好不要超過3周；擴增培養(yǎng)后，可使癌干細胞比例減少或分化細胞比例增加，從而影響對癌干細胞行為學的觀察。

本研究屬于尋找舌癌干細胞的前期性和階段性實驗，但是結果很有意義，這12個細胞亞系表明了Tca8113M1細胞系中有存在舌癌干細胞的可能性，而其最初的來源細胞系Tca8113也應存在癌干細胞。結合細胞克隆形態(tài)分析的單個癌細胞培養(yǎng)模式可為深入研究舌癌干細胞提供細胞研究平臺。

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（本文編輯 吳愛華）