神經(jīng)酰胺合酶-神經(jīng)酰胺通路在青蒿琥酯抑制肝纖維化中的作用*

阮建佳，杜 巖

(1. 天津市薊州區(qū)人民醫(yī)院綜合內(nèi)科，2. 天津市薊州區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，天津 301900)

肝纖維化[1]是肝臟受到損傷后自我修復過程的代償反應，其中肝星狀細胞的活化增殖與肝纖維化密切相關，正常肝臟中肝星狀細胞呈靜息的狀態(tài)，當受到損傷后，便出現(xiàn)活化增殖，轉(zhuǎn)變成肌成纖維細胞，細胞外基質(zhì)增多，促使肝纖維化形成，故而治療肝纖維化的重點在于阻礙肝星狀細胞增殖以及加速其凋亡。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性衍生物，具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、解毒保肝等藥理作用，青蒿琥酯(artesunate, Art)具有抗肝纖維化作用，能降低羥脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)的含量，應用青蒿琥酯后肝星狀細胞中神經(jīng)酰胺(ceramide, Cer)的水平發(fā)生變化，神經(jīng)酰胺[2-4]為神經(jīng)鞘脂類，與細胞的分化、增殖、凋亡活動密切相關，神經(jīng)酰胺合酶為神經(jīng)酰胺合成中的關鍵酶，選用神經(jīng)酰胺合酶阻斷劑伏馬菌素B1(fumonisin B1, FB1)來阻斷神經(jīng)酰胺合酶的合成，進而探討青蒿琥酯抑制肝纖維化過程中神經(jīng)酰胺合酶-神經(jīng)酰胺通路的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

人源肝星狀細胞株 LX-2由天津醫(yī)科大學提供。

1.2 主要試劑及儀器

青蒿琥酯由桂林南藥有限公司提供；神經(jīng)酰胺購自Sigma公司；Fumonisin B1購自Sigma公司；Caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology公司；神經(jīng)酰胺合酶2(homo sapiens longevity assurance homologue 2, LASS2)抗體購自SANTA CRUZ公司；羥脯氨酸測定試劑盒購自南京建成試劑公司；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ, PPAR-γ) 購自Santa cruz公司； DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀購自北京市六一儀器廠；B600型低速自動平衡離心機購自河北省安新縣白洋離心機廠；HZS-H型水浴振蕩器購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司。

1.3 實驗設計及實驗分組

將LX-2細胞放置在37℃飽和濕度，5 %CO2細胞培養(yǎng)箱里進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至約80%融合時，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，再加入0.25%胰蛋白酶1 ml消化1 min，然后進行細胞傳代，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。實驗分為四組：(1)Control組：細胞用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，不進行任何處理；(2)Art處理組：細胞用Art 350 μmol/L處理24 h；(3)FB1處理組：細胞用FB1 6 μmol/L處理24 h；(4)Art 與FB1聯(lián)合處理組：細胞用Art 350 μmol/L+FB1 6 μmol/L處理24 h。各組均設計7個復孔，作用24 h結(jié)束后，收集LX-2細胞及細胞上清液進行檢測。

1.4 Western blot檢測LASS2、PPAR-γ 及Caspase-3蛋白的表達

將LX-2細胞接種于6孔板中，按上述實驗設計進行處理，提取細胞蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白的濃度。取35 μg上樣，30%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h后，全濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，分別加入LASS2(1∶500)、PPAR-γ(1∶500)及Caspase-3(1∶1 000)抗體于4℃孵育一夜，TBST洗膜3次，室溫下孵育二抗2 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色之后曝光。采用Quantity One軟件進行條帶灰度值分析。

1.5 HPLC-FLD法測定神經(jīng)酰胺的含量

將LX-2細胞接種于96孔板中，各組根據(jù)實驗設計進行處理，作用24 h后，收取上清液100 μl，加入等量的乙腈，13 000 r·min-1離心3 min。吸取上清液儲存于4℃冰箱中，檢測方法參考文獻[5](測定生物樣本中神經(jīng)酰胺含量的HPLC-FLD法)。

1.6 MTT法檢測LX-2的增殖情況

將LX-2細胞接種于96孔板中，各組根據(jù)實驗設計進行處理，作用24 h后，每孔加入MTT 10 μl，作用4 h后，棄凈培養(yǎng)基并吸干，每孔加入二甲基亞砜200 μl，置于酶標儀中570 nm測定各孔吸光度值(A值)，按以下公式計算細胞抑制率(Inhibition Rate，IR)，抑制率(%)=[(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值]×100%。

1.7 測定羥脯氨酸含量

將LX-2細胞接種于96孔板中，各組根據(jù)實驗設計進行處理，作用24 h后，留取細胞上清液，按照羥脯氨酸測定試劑盒說明書操作。計算公式：羥脯氨酸濃度(μg/ml)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×標準管濃度(5 μg/ml)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 Art對LX-2細胞LASS2蛋白表達的影響

與細胞對照組比較，Art可以增加LX-2細胞LASS2的表達，F(xiàn)B1可減少LX-2細胞LASS2的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Art單用組比較，F(xiàn)B1與Art合用組LX-2細胞的LASS2的表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 Art對LX-2細胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白表達的影響

與細胞對照組比較，Art可顯著增加LX-2細胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白的表達，F(xiàn)B1處理組，LX-2細胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白表達減少，具有顯著性差異(P<0.05)。與Art單用組比較，F(xiàn)B1減弱Art對LX-2細胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白表達升高的作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

2.3 Art對LX-2細胞分泌神經(jīng)酰胺的影響

與細胞對照組比較，Art可以增加LX-2細胞神經(jīng)酰胺的分泌，F(xiàn)B1可減少LX-2細胞神經(jīng)酰胺的分泌，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Art單用組比較，F(xiàn)B1與Art合用組LX-2細胞的神經(jīng)酰胺的分泌顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

2.4 Art和FB1對LX-2細胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示：與細胞對照組比較，Art對LX-2細胞的增殖有顯著的抑制作用，F(xiàn)B1可促進LX-2細胞的增殖，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Art單用組比較，F(xiàn)B1與Art合用組，可降低Art對LX-2細胞的增殖抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05，表2)。

2.5 Art和FB1對LX-2細胞羥脯氨酸水平的影響

與細胞對照組比較，Art可降低LX-2細胞羥脯氨酸的分泌，F(xiàn)B1增加LX-2細胞羥脯氨酸的分泌，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Art單用組比較，F(xiàn)B1與Art合用可以減弱Art對LX-2細胞羥脯氨酸分泌的抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05，表2)

3 討論

肝星狀細胞的增殖與活化是肝纖維化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)，抑制其增殖，促進其凋亡是我們研究的重點，前期實驗青蒿琥酯作用于肝星狀細胞后，其增殖受到抑制，并在實驗中發(fā)現(xiàn)應用青蒿琥酯后神經(jīng)酰胺的水平發(fā)生變化[6]。青蒿琥酯如何調(diào)控神經(jīng)酰胺的水平進而發(fā)揮抗肝纖維化的作用成為研究的關鍵。神經(jīng)酰胺[7]，是細胞膜中神經(jīng)鞘磷脂經(jīng)水解產(chǎn)生的脂質(zhì)分子，可參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡等活動，調(diào)控神經(jīng)酰胺的關鍵酶是：(1)酸性、中性、堿性鞘磷脂酶，可通過參與鞘磷脂水解過程產(chǎn)生神經(jīng)酰胺；(2)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(serine palmitoyl transferase, SPT)是神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的關鍵酶；(3)神經(jīng)酰胺酶可參與神經(jīng)酰胺向鞘氨醇的轉(zhuǎn)化；(4)神經(jīng)酰胺合酶[8]可促進鞘氨醇向神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化。在哺乳動物中神經(jīng)酰胺合酶存在六種類型，LASS1-6，其中LASS2對神經(jīng)酰胺的合成最為重要，且在肝臟中含量很高，故本實驗選用LASS2為神經(jīng)酰胺合酶的研究對象，選用神經(jīng)酰胺合酶抑制劑Fumonisin B1[9]來阻斷神經(jīng)酰胺合酶研究青蒿琥酯抑制肝纖維化中神經(jīng)酰胺合酶-神經(jīng)酰胺信號通路對肝星狀細胞增殖及凋亡的影響。

實驗結(jié)果顯示應用神經(jīng)酰胺合酶阻斷劑FB1后，與細胞對照組比較，LX-2細胞的神經(jīng)酰胺合酶LASS2的表達減少并且神經(jīng)酰胺水平下調(diào)，青蒿琥酯可提高LX-2細胞LASS2的表達并提高神經(jīng)酰胺水平，且FB1與Art合用，發(fā)現(xiàn)FB1可以減弱Art對LX-2細胞LASS2蛋白表達及神經(jīng)酰胺水平升高的作用，證實Art發(fā)揮抗肝纖維化的作用與神經(jīng)酰胺合酶-神經(jīng)酰胺通路有關，揭示Art可能是通過調(diào)控神經(jīng)酰胺合酶蛋白表達，進而影響LX-2細胞的增殖及凋亡。

PPAR-γ屬核受體家族成員，正常肝臟的肝星狀細胞中PPAR-γ表達增加，當受到損傷或發(fā)生炎癥時，隨著肝星狀細胞的持續(xù)活化，PPAR-γ的表達逐漸減弱[10-11]，PPAR-γ對抑制肝星狀細胞的增殖活化有調(diào)節(jié)作用。并有研究證實神經(jīng)酰胺可促進PPAR-γ的表達，進而減少肝臟脂肪病變[12]。神經(jīng)酰胺能夠增加肝癌細胞PPAR-γ的轉(zhuǎn)錄活性，細胞周期阻滯，抑制肝癌細胞生長[13]。本實驗旨在研究肝纖維化中神經(jīng)酰胺對于肝星狀細胞增殖及凋亡的調(diào)控，實驗結(jié)果顯示Art可顯著增加LX-2細胞PPAR-γ、Caspase-3的蛋白表達，F(xiàn)B1與Art合用組與Art單用組比較，LX-2細胞PPAR-γ、Caspase-3的表達上調(diào)作用明顯減弱，驗證Art可通過神經(jīng)酰胺合酶-神經(jīng)酰胺通路上調(diào)PPAR-γ及Caspase-3蛋白的表達，抑制LX-2細胞的增殖并促進其凋亡。

Tab. 1 Effects of Art and FB1 on the expressions of LASS2, PPAR-γ and Caspase-3 protein n = 7)

Tab. 2 Effects of Art and FB1 on the concentration of ceramide, the inhibition rate of LX-2 and the level of hydroxyproline n = 7)