經(jīng)皮穿刺抽取大鼠腦脊液方法的改良*

李家卉，張 敏，付子豪，李勇枝，王佳平，高 峰，董 玲△

(1. 中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系, 陜西 西安 710032; 2. 中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心, 北京 100094)

腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)是一種循環(huán)于腦室、蛛網(wǎng)膜下腔和脊髓中央管內(nèi)并包繞大腦和脊髓的復(fù)雜液體，其成分主要來(lái)源于脈絡(luò)叢和腦間質(zhì)液。因此，腦脊液經(jīng)常被用作藥效學(xué)和預(yù)后生物標(biāo)志物的來(lái)源，以反映大腦內(nèi)發(fā)生的生化變化[1]。在實(shí)驗(yàn)研究中，大鼠腦脊液采樣點(diǎn)通常選擇側(cè)腦室、小腦延髓池(cisterna magna，CM)、蛛網(wǎng)膜下腔以及腰大池。但側(cè)腦室取樣需打開(kāi)顱骨，且借助腦定位儀進(jìn)行精密定位[2, 3]。并且蛛網(wǎng)膜下腔腦脊液收集量少，腰大池操作繁瑣、耗時(shí)、損傷大，且穿刺成功率低于小腦延髓池穿刺法，故實(shí)驗(yàn)中仍常用小腦延髓池穿刺法[4, 5]。經(jīng)小腦延髓池穿刺采集大鼠腦脊液通常有以下幾種方法：(1)經(jīng)皮穿刺取樣法[6]；(2)直視下經(jīng)硬脊膜采樣法[7-9]；(3)立體定位儀輔助結(jié)合負(fù)壓裝置取樣法[10-12]；(4)置管法[13]。由于大鼠小腦延髓池內(nèi)血管豐富，腔隙狹小，很容易刺破血管及延髓，導(dǎo)致血液混雜及動(dòng)物死亡，無(wú)法進(jìn)行重復(fù)采樣。并且腦脊液采集多采用立體定位儀輔助進(jìn)行穿刺抽取，需兩人配合，且操作相對(duì)復(fù)雜、用時(shí)長(zhǎng)。相比較而言，經(jīng)皮穿刺抽取腦脊液技術(shù)具有所需器材簡(jiǎn)單、單人可操作完成，且創(chuàng)面小、不易感染、利于重復(fù)取樣等優(yōu)點(diǎn)。但存在經(jīng)皮穿刺技術(shù)難度較高，不熟練時(shí)很容易刺破血管及腦組織導(dǎo)致出血及動(dòng)物死亡等問(wèn)題。同時(shí)，如實(shí)驗(yàn)需要間斷重復(fù)采集腦脊液進(jìn)行分析，因此尋找一種安全性高，方便快捷的腦脊液收集方法非常必要。在參考傳統(tǒng)經(jīng)皮穿刺取腦脊液方法基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改良，建立一種適合單人操作、不需要特殊儀器、成功率高、重復(fù)采集動(dòng)物存活率高的腦脊液收集技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)Sprague-Dawley (SD)大鼠90只，雄性，體重230～250 g，6周齡左右。由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(陜)2019-001]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行[SYXK(陜)2019-001]。實(shí)驗(yàn)所有操作遵循空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理道德委員會(huì)指導(dǎo)原則。

1.2 儀器和試劑

1 ml注射器(注射針規(guī)格： 0.45 mm×16 mm)，橡皮筋，直剪，戊巴比妥鈉，碘伏消毒液，無(wú)菌棉球，鑷子，離心機(jī)(Eppendorf 5418R，德國(guó))。

1.3 改良經(jīng)皮穿刺抽取腦脊液法

將1 ml注射器針頭剪斷，保留針頭約0.7 cm左右，打磨針頭使其不至于過(guò)鈍。將針管用直剪從中部剪斷，在活塞柱上纏繞橡皮筋，調(diào)整橡皮筋位置位于實(shí)驗(yàn)者無(wú)名指和小拇指之間。用大拇指與食指固定前端針筒，剩余三指反復(fù)旋轉(zhuǎn)抽動(dòng)活塞使活塞在針筒內(nèi)移動(dòng)更加靈活，以盡量減少抽取腦脊液時(shí)移動(dòng)活塞帶來(lái)的瞬時(shí)負(fù)壓。用2%戊巴比妥鈉(0.3 ml/100 g 腹腔注射)麻醉大鼠，頭項(xiàng)部毛剔除干凈。操作者左手將大鼠頭部固定，酒精或碘伏消毒，抬高至與軀干成135°[14]，另一只手觸及枕骨大孔，尋找并標(biāo)記最佳進(jìn)針點(diǎn)：在枕骨隆凸中下 0.6～0.7 cm, 第一頸椎上0.3～0.4 cm處，進(jìn)針深度在0.8～1.2 cm范圍內(nèi)[6]，右手手心向下橫臥針筒，針頭斜面朝下，大拇指和食指握住針筒近端順大鼠頭部平行稍向上角度小心控制緩慢進(jìn)針。當(dāng)感受到第2次突破感時(shí)(先刺破皮下再突破黃韌帶，但大鼠組織較薄，有時(shí)只能感受到一次突破感，需注意控制進(jìn)針深度)立即停止進(jìn)針并緩慢抽取腦脊液，抽取腦脊液過(guò)程中緩慢抽動(dòng)活塞，并小心調(diào)整進(jìn)針深度不超過(guò)0.3～0.5 cm為宜。腦脊液抽取完畢，迅速拔針(圖1)。觀(guān)察腦脊液液體是否清亮，肉眼無(wú)血液混雜為成功采集標(biāo)準(zhǔn)[6，15]。采集后可向小腦延髓池內(nèi)注射補(bǔ)充稍少量生理鹽水。重復(fù)采集時(shí)，動(dòng)物手術(shù)時(shí)使用加熱墊保溫，動(dòng)物復(fù)蘇后狀態(tài)良好，觀(guān)察3 d以上未見(jiàn)異常再進(jìn)行下一次取樣。最后一次取樣24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，生理鹽水灌注后迅速斷頭取出穿刺部位腦干組織，放置于4%多聚甲醛中固定24 h，按HE染色步驟進(jìn)行染色觀(guān)察損傷情況。

Fig. 1 The modified percutaneous cisterna magna puncture

A： Classical percutaneous cisterna magna puncture； B： Modified percutaneous cisterna magna puncture； C： The improved syringe and puncture site； D、E： The modified syringe

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,動(dòng)物存活率的比較采用2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重、進(jìn)食量結(jié)果

三次取樣結(jié)束后，測(cè)量對(duì)照組、傳統(tǒng)組、改良組大鼠體重。發(fā)現(xiàn)三組大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。每次取樣前一日測(cè)定大鼠日進(jìn)食量，三組進(jìn)食量無(wú)顯著差異(P> 0.05，表1)。進(jìn)食量和體重三組未見(jiàn)顯著區(qū)別，提示經(jīng)皮穿刺取腦脊液對(duì)于存活大鼠生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)顯著影響。

Tab. 1 Body weight and feed intake of rats in three different

2.2 單次腦脊液采樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用傳統(tǒng)采集方法取樣30只大鼠，其中19只大鼠成功采集合格腦脊液，其中6只采集到血性腦脊液，其中5只未采集出腦脊液，成功率為63.33%，腦脊液采集量為(83.53±41.39)μl。按照固定大鼠頭部開(kāi)始計(jì)時(shí)，平均采樣用時(shí)為(114.07±11.19)s。應(yīng)用改良經(jīng)皮穿刺法取樣30只大鼠，26只大鼠成功采集合格腦脊液，其中3只采集到血性腦脊液，其中1只未采集出腦脊液，成功率為86.67%，腦脊液采集量為(98,70±26.15)μl。按照固定大鼠頭部開(kāi)始計(jì)時(shí)，平均采樣用時(shí)(116.97±12.46)s(與傳統(tǒng)采集方法取樣法比較，P均>0.05)。與傳統(tǒng)法相比，改良法可提高采樣成功率，而采樣量與采樣用時(shí)兩組無(wú)顯著差異。

2.3 腦脊液重復(fù)采樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果

第一次取樣后傳統(tǒng)組存活18只，改良組存活24只；第二次取樣后，傳統(tǒng)組存活10只，改良組存活18只；第三次取樣后傳統(tǒng)組剩余3只，改良組存活15只。三次取樣存活率依次為10%和50%。二次重復(fù)采集累積存活率經(jīng)過(guò)卡方檢驗(yàn)(2= 4.286,P<0.05)，三次重復(fù)采集存活率經(jīng)卡方檢驗(yàn)(2=11.429,P< 0.01，表2)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示傳統(tǒng)法和改良法在重復(fù)采集累積存活率上有顯著差異，改良法可明顯提高動(dòng)物腦脊液重復(fù)采樣累積存活率。

Tab. 2 Survival rates of rats in the two groups (%)

2.4 病理組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察

HE染色結(jié)果提示改良穿刺組和正常對(duì)照組均無(wú)任何損傷或神經(jīng)退行性變。穿刺區(qū)域腦組織未見(jiàn)水腫，無(wú)壞死和膠質(zhì)細(xì)胞增生。結(jié)果表明改良組穿刺手法安全，對(duì)動(dòng)物的損傷小(圖2)。

Fig. 2 Representative brain stem sections from the region of CM puncture(HE ×5)

3 討論

腦脊液主要存在于腦室和蛛網(wǎng)膜下腔，環(huán)繞大腦和脊髓，主要由脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞分泌,經(jīng)蛛網(wǎng)膜吸收入血循環(huán)。其主要成分為葡萄糖、微量蛋白質(zhì)及少量淋巴細(xì)胞。因腦脊液成分的變化常反映腦組織內(nèi)細(xì)胞代謝及病理指標(biāo)變化,因此腦脊液分析是針對(duì)中樞系統(tǒng)研究的常用技術(shù)。但是，大鼠腦脊液量少。已有文獻(xiàn)報(bào)道，體重為300 g左右大鼠其腦脊液體積約為580 μl[13]，而能從小腦延髓池內(nèi)單次采集獲得的腦脊液僅為100 ～ 120 μl[13]。除此之外，采集過(guò)程通常還由于穿刺位置空間狹小，極易傷及血管及腦組織等困難[7, 11]。同時(shí)，很多實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)采樣，因此尋找一個(gè)可靠便捷、動(dòng)物存活率高的采集方法非常必要[16]。

經(jīng)皮穿刺法選取小腦延髓池處進(jìn)行穿刺，該部位骨性結(jié)構(gòu)明顯，尋找穿刺點(diǎn)較為簡(jiǎn)單。但由于穿刺部位緊鄰延髓、小腦、下丘腦等處，是神經(jīng)中樞聚集地，具有重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)及神經(jīng)分泌功能[17]，如操作不當(dāng)極易導(dǎo)致動(dòng)物死亡。傳統(tǒng)經(jīng)皮穿刺法技術(shù)難度較高，需多次反復(fù)練習(xí)才能把握好穿刺角度、穿刺位置以及進(jìn)針力度。其中，穿刺力度由于單手反握更難以控制，容易因穿透時(shí)力度控制不到位或角度偏移導(dǎo)致針尖刺入過(guò)深，傷及小腦、延髓導(dǎo)致動(dòng)物存活率低及腦功能損傷，或刺破血管導(dǎo)致腦脊液污染，重復(fù)取樣困難大。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮穿刺小腦延髓池取樣法相較于其他方法最為方便、快捷。具有對(duì)設(shè)備要求低，方便單人操作，動(dòng)物創(chuàng)面小，反復(fù)取樣動(dòng)物存活率高的優(yōu)點(diǎn)。

本文經(jīng)過(guò)對(duì)傳統(tǒng)經(jīng)皮穿刺抽取腦脊液方法進(jìn)行改良，將“反握法”調(diào)整為“正握法”，且進(jìn)一步對(duì)穿刺針筒進(jìn)行改進(jìn)，增大了手部對(duì)進(jìn)針深度的控制力度，有效減少突破黃韌帶時(shí)刺入過(guò)深導(dǎo)致出血和傷及延髓的情況。需注意的要點(diǎn)：(1)穿刺角度與進(jìn)針力度：大鼠頭部抬高至135°，左手固定時(shí)注意將皮膚向下拉扯固定，防止皮膚肌肉組織滑動(dòng)，進(jìn)針時(shí)可與桌面保持平行進(jìn)針，進(jìn)針力度不可過(guò)大，需感到有穿刺感后再小心突破黃韌帶；(2)針尖移動(dòng)：刺入黃韌帶后立即停止進(jìn)針，右手中指無(wú)名指小指控制活塞施加微小負(fù)壓，仔細(xì)觀(guān)察針尖是否有清亮液體進(jìn)入，若無(wú)，保持針筒內(nèi)活塞位置，根據(jù)實(shí)際進(jìn)針角度略微向后或上下移動(dòng)針頭(向前極易傷及腦組織)；(3)腦脊液收集：抽取腦脊液時(shí)負(fù)壓不可過(guò)高，且緩慢小心抽取，看到有清亮液體進(jìn)入針頭后，保持針管內(nèi)負(fù)壓直至液體不再流入時(shí)緩慢移動(dòng)活塞進(jìn)行吸引，吸引量不宜超過(guò)100 μl，否則出血風(fēng)險(xiǎn)大，造成操作失??；(4)血液混雜處理：若收集末觀(guān)察有少許血液進(jìn)入針頭，立即拔針，棄掉針頭，收集針管內(nèi)剩余液體；若對(duì)樣品純度要求稍低，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)混有微量血液的樣品進(jìn)行4℃ 1 000 r/min 10 min離心處理；(5)反復(fù)采樣：需反復(fù)采樣時(shí)，單次采樣不宜過(guò)多，采樣后可向小腦延髓池內(nèi)注射等量生理鹽水。同時(shí)，采樣間隔不宜過(guò)短。為提高動(dòng)物存活率及觀(guān)察采樣后動(dòng)物存活情況，本文研究時(shí)重復(fù)采樣均間隔3 d以上；(6)動(dòng)物麻醉方式：為提高腦脊液采集成功率及動(dòng)物遠(yuǎn)期存活率，本文選擇2%戊巴比妥鈉(0.3 ml/100 g 腹腔注射)麻醉方式，該方法經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道心血管反應(yīng)小、遠(yuǎn)期不良反應(yīng)少、動(dòng)物存活率高，因此利于重復(fù)采樣[18, 19]。(7)存在缺陷：不可否認(rèn)本文所提供方法仍存在一定局限性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本文所述方法因操作力度較為溫和不適合體型稍大動(dòng)物，其黃韌帶過(guò)硬則較難穿刺。但該方法與立體定位儀固定法相比優(yōu)勢(shì)，操作更為簡(jiǎn)單，用時(shí)短，且設(shè)備需求低，同時(shí)避免微量進(jìn)樣器采樣時(shí)交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)經(jīng)皮穿刺能最大限度保留原有肌肉結(jié)構(gòu)，減少直視下經(jīng)硬脊膜穿刺時(shí)肌肉出血導(dǎo)致的樣品污染，肌肉組織在退針后的自然封閉可以有效避免腦脊液外漏，減少傷口感染，能更加有效保證動(dòng)物存活與恢復(fù)，利于重復(fù)采樣。綜上所述，本文建立的改良經(jīng)皮穿刺抽取腦脊液技術(shù)成功率高，方便快速，重復(fù)采樣研究動(dòng)物存活率高，是一種簡(jiǎn)便易行的適合單人操作的腦脊液收集技術(shù)。