PM2.5鼻腔滴注致小鼠海馬組織損傷的炎性機(jī)制*

方 振，胡西厚，李 康，韓 潔,3，田 蕾，閆 峻，張 偉，來(lái)文慶，林本成，劉曉華,3△，襲著革△

(1. 濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000； 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050；3. 天津體育學(xué)院，天津 301617)

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)和人口快速增長(zhǎng)以及工業(yè)和交通快速發(fā)展，我國(guó)的大氣環(huán)境污染日益嚴(yán)重化，其中霧霾污染的范圍、持續(xù)時(shí)間和危害日益增加，顆粒物污染已經(jīng)成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。細(xì)顆粒物(fine particulate matter, PM2.5)是霧霾的主要成分之一，是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于等于2.5 μm的顆粒物，具有粒徑小，比表面積大，懸浮時(shí)間長(zhǎng)，輸送距離遠(yuǎn)且易于攜帶鉛、多環(huán)芳烴等有毒有害物質(zhì)的特性。PM2.5能夠通過(guò)鼻腔、呼吸道進(jìn)入肺泡乃至支氣管，最后通過(guò)血?dú)饨粨Q進(jìn)入血液作用全身，PM2.5主要作用于呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，易引起哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病和心肌梗死等心血管系統(tǒng)疾病[1-2]，同時(shí)PM2.5也可通過(guò)血腦屏障，嗅神經(jīng)進(jìn)入腦部導(dǎo)致腦損傷以及神經(jīng)系統(tǒng)損害[3]。

目前針對(duì)小鼠的PM2.5染毒方法主要有霧化吸入法、鼻腔滴注法、暴露式氣管滴注法、非暴露式氣管滴注法等[4]。PM2.5鼻腔滴注染毒可以通過(guò)嗅神經(jīng)進(jìn)入嗅球，最后進(jìn)入大腦其它組織，稱為嗅腦通路。目前關(guān)于嗅腦通路的研究較少，而嗅腦通路在PM2.5致神經(jīng)毒性的作用機(jī)制研究也相對(duì)較少，因此本研究通過(guò)對(duì)小鼠鼻腔滴注PM2.5進(jìn)行染毒暴露，后續(xù)觀察小鼠肺組織和海馬組織病理學(xué)改變，測(cè)定小鼠血清中的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)水平以及通過(guò)抗體芯片技術(shù)測(cè)定海馬組織炎性因子水平的變化來(lái)探討鼻腔滴注PM2.5致小鼠海馬組織損傷的炎性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2030型中流量智能TSP采樣器(青島嶗應(yīng)，中國(guó))，玻璃纖維濾膜(青島嶗應(yīng)，中國(guó))，超聲波清洗器KQ-500E(昆山超聲儀器,中國(guó))，離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，真空冷凍干燥儀(Martin Christ，德國(guó))，-80℃冰箱(Thermo，美國(guó))，酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國(guó))。TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特，中國(guó))、小鼠炎性因子抗體芯片 (Raybiotech，美國(guó))。

1.2 PM2.5采集、表征和處理

于2015年選擇霧霾天氣嚴(yán)重，顆粒物(particulate matter, PM)較為豐富的1月至3月，在位于天津市中心城區(qū)的環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所5樓陽(yáng)臺(tái)，利用2030型中流量智能TSP采樣器采集PM2.5，采樣流量為100 L/min，每天24 h連續(xù)采樣。將采集的PM2.5通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析16種多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)，通過(guò)電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)量9種元素，PM2.5成分分析的結(jié)果見文獻(xiàn)[5]。

將采集有PM2.5的濾膜剪成1 cm2大小的碎片，置于干凈的燒杯中，加超純水浸泡，超聲震蕩15 min，重復(fù)3次，工作頻率500 W。用1200目分樣篩過(guò)濾，將濾出液置于-80℃冰箱冷凍過(guò)夜，之后在真空冷凍干燥機(jī)中凍干，稱重后-80℃避光保存。稱取適量PM2.5干粉，經(jīng)紫外照射30 min，然后在超凈臺(tái)中加入生理鹽水配制成1 mg/ml的PM2.5懸液，以備動(dòng)物染毒使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及PM2.5鼻腔滴注染毒

將30只小鼠隨機(jī)分為3組(n=10)：對(duì)照組(Control)、低劑量組(Low dose)、高劑量組(High dose)。實(shí)驗(yàn)組染毒劑量分別為1.5 mg/kg BW PM2.5和 7.5 mg/kg BW PM2.5，對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，隔天染毒一次，共12次。動(dòng)物染毒前超聲處理PM2.5懸液20 min，待充分混勻后開始染毒。稱取并記錄小鼠體重后，用微量移液器分別吸取相應(yīng)劑量的震蕩搖均后的PM2.5懸液，緩慢勻速滴入小鼠鼻腔進(jìn)行染毒。

1.4 肺組織和海馬組織形態(tài)學(xué)觀察

取各組肺組織和大腦海馬組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm切片行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)改變。

取各組海馬組織經(jīng)1%鋨酸固定液固定，用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗，經(jīng)梯度乙醇、1∶1的90%乙醇和90%丙酮和梯度丙酮脫水處理，純丙酮加包埋液包埋后固化，LKB-1型超薄切片機(jī)切片50～60 nm后3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，日本電子JEM-1011透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)變化。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清中炎性因子水平

各組小鼠全血樣品于室溫放置2 h后于1628 r/min離心20 min，取上清。在96孔板中，每孔加入100 μl上清液，嚴(yán)格按照TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)血清中炎性因子變化。

1.6 蛋白芯片檢測(cè)海馬組織炎性因子表達(dá)變化

利用Raybiotech公司生產(chǎn)的小鼠炎性因子抗體芯片G1檢測(cè)海馬組織中40種炎性因子的表達(dá)變化。各組小鼠處死后，取250～500 mg海馬組織，加1 ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑，勻漿后抽提總蛋白。按照蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明，測(cè)定樣品濃度?？贵w芯片在封閉緩沖液中封閉30 min，然后與蛋白樣品室溫孵育1～2 h，抗體芯片經(jīng)洗滌緩沖液清洗，加入生物素標(biāo)記的抗體，室溫孵育1～2 h。抗體芯片經(jīng)洗滌緩沖液清洗，加入熒光素耦合的鏈霉親和素，熒光信號(hào)直接使用Axon掃描儀掃描。蛋白信號(hào)強(qiáng)度通過(guò)熒光掃描值定量獲得原始信號(hào)值，通過(guò)減去Axon掃描儀測(cè)得的背景值做修正，并用中值做標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值的組間比較，比值≥1.50或≤0.66為差異表達(dá)的蛋白。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PM2.5染毒對(duì)小鼠血清中炎性因子的影響

與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均無(wú)顯著差異(表1，P>0.05)。結(jié)果表明，鼻腔滴注PM2.5未誘導(dǎo)小鼠發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。

Tab. 1 Changes of serum TNF-α, IL-1β, IL-6 in mice exposed to different concentrations of PM2.5 (pg/ml, n=10)

2.2 PM2.5染毒對(duì)小鼠肺組織形態(tài)的影響

對(duì)照組小鼠肺組織整體結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁無(wú)明顯增厚(圖1A)；低劑量組和高劑量組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比未見顯著差異，肺泡壁無(wú)明顯增厚，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B、C)。結(jié)果表明，鼻腔滴注PM2.5沒有誘導(dǎo)肺組織出現(xiàn)比較明顯的病理性損傷(圖1，見彩圖頁(yè)Ⅳ)。

2.3 PM2.5染毒對(duì)小鼠海馬組織形態(tài)的影響

海馬組織經(jīng)HE染色后，對(duì)照組小鼠海馬CA3區(qū)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A)；低劑量組小鼠海馬CA3區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元輕度排列紊亂(圖2B)；高劑量組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元排列明顯紊亂(圖2C，圖2見彩圖頁(yè)Ⅳ)。

海馬組織超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠海馬區(qū)結(jié)構(gòu)基本完整，神經(jīng)元細(xì)胞分布比較密集，高倍鏡下可見結(jié)構(gòu)良好的突觸小體，小血管內(nèi)襯完整內(nèi)皮細(xì)胞，外側(cè)有完整基底膜結(jié)構(gòu)(圖3A)；低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞周圍的突觸數(shù)量較少，部分突觸小體水腫，小血管周圍水腫，形成水腫裂隙，周圍神經(jīng)髓鞘變性(圖3B)；高劑量組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較常見，神經(jīng)元細(xì)胞周圍的突觸數(shù)量較少，少數(shù)有水腫變性，小血管周圍水腫(圖3C)。以上結(jié)果表明：鼻腔滴注PM2.5可以誘導(dǎo)小鼠海馬組織發(fā)生以神經(jīng)元細(xì)胞損傷和小血管周圍水腫為主的病理性損傷。

Fig. 3 Representative photographs of hippocampus of mice from various groups on the 12th exposure after nasal instillation (3% uranyl acetate-lead lead citrate double staining，A,C ×5 000，B ×10 000)

A： Control group； B： Low dose PM2.5group； C： High dose PM2.5group

2.4 PM2.5染毒對(duì)小鼠海馬組織炎性因子的表達(dá)的影響

利用抗體芯片檢測(cè)海馬組織中20種炎性因子的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露后差異表達(dá)炎性因子的聚類圖見圖4，表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2(圖4見彩圖頁(yè)Ⅳ)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，PM2.5暴露使低劑量組海馬組織中的炎性因子CX3CL1、CSF2、IFN-γ、IL-2、IL-17A、CSF1、SDF-1、TECK、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-12p70、MCP1和TCA-3顯著升高(P<0.05)，MIG和sTNFR1顯著降低(P<0.05)；高劑量組海馬組織中的炎性因子CX3CL1、CSF2、IFN-γ、IL-2、IL-17A、CSF1、SDF-1、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-12p70和MCP1顯著升高(P<0.05)，Leptin、MIG、FASLG、MIP-1、sTNFR1和CD30LG顯著降低(P<0.05)。

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL-2、IL-10、IL-6、IL-12p70和IL-17A)、TNF-α、IFN-γ、集落刺激因子(CSF1和CSF2)，趨化因子(CX3CL1, SDF-1、MCP1)顯著升高(P<0.05)；趨化因子(MIG和sTNFR1)顯著降低(P<0.05)，它們的變化與暴露劑量不相關(guān)。另外，趨化因子TECK僅在低劑量組顯著升高(P<0.05)，趨化因子TCA-3僅在高劑量組顯著升高(P<0.05)，而趨化因子(MIP-1，F(xiàn)ASLG，CD30LG和Leptin)僅在高劑量組顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明，海馬組織中的TNF-α、IL-6等促炎因子的顯著升高和sTNFR1 、FASLG等炎性疾病標(biāo)志物的顯著降低，這可能為鼻腔滴注PM2.5誘導(dǎo)海馬組織損傷的炎性機(jī)制。

Tab. 2 Changes of inflammatory cytokines in mice hippocampus after exposed with different concentrations of PM2.5(ng/ml, n=10)

3 討論

流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有很強(qiáng)的相關(guān)性，長(zhǎng)期接觸PM2.5會(huì)增加癡呆、阿爾茨海默病、自閉癥譜系障礙、帕金森病等的患病風(fēng)險(xiǎn)[6]。體外實(shí)驗(yàn)認(rèn)為PM2.5具有神經(jīng)細(xì)胞毒性，其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[7]。PM2.5可以通過(guò)神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元死亡等途徑致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。其中海馬組織對(duì)學(xué)習(xí)和記憶至關(guān)重要，而海馬組織的損傷與癡呆，認(rèn)知障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)[8]。因此本研究通過(guò)對(duì)小鼠肺組織和海馬組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和抗體芯片技術(shù)檢測(cè)小鼠海馬組織炎性因子的表達(dá)變化來(lái)初步探討PM2.5的神經(jīng)細(xì)胞毒性。

一般認(rèn)為PM2.5進(jìn)入大腦主要有三條途徑，一是PM2.5通過(guò)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入肺后，通過(guò)血?dú)饨粨Q進(jìn)入血液，最后通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦；二是PM2.5可以通過(guò)嗅神經(jīng)進(jìn)入嗅球，最后進(jìn)入大腦其它組織；三是PM2.5通過(guò)神經(jīng)周圍的細(xì)胞外間隙進(jìn)入腦脊液，最終進(jìn)入大腦[9]。本研究通過(guò)鼻腔滴注PM2.5來(lái)驗(yàn)證PM2.5是否可以引起海馬組織損傷。因本實(shí)驗(yàn)未對(duì)PM2.5進(jìn)行相關(guān)標(biāo)記，故PM2.5轉(zhuǎn)歸路徑無(wú)法確定。通過(guò)海馬組織的顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)研究結(jié)果證實(shí)通過(guò)鼻腔滴注PM2.5可以致海馬組織出現(xiàn)明顯的損傷。通過(guò)血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平和肺組織的顯微結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼻腔滴注PM2.5并沒有誘導(dǎo)肺組織出現(xiàn)比較明顯的病理性損傷，表明可能鼻腔滴注PM2.5通過(guò)呼吸系統(tǒng)以及血?dú)饨粨Q這條途徑進(jìn)入海馬組織的PM2.5較少，而大部分PM2.5可能通過(guò)嗅腦通路進(jìn)入海馬組織。因此PM2.5鼻腔滴注致海馬組織損傷的主要作用途徑可能為嗅腦通路。

許多研究通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行PM2.5染毒發(fā)現(xiàn)，可引起大鼠肺部的炎性損傷，而在本研究中肺組織并沒有出現(xiàn)比較明顯的病理性損傷，其原因可能有其它研究多為氣管滴注，而本研究為鼻腔滴注。例如田程遠(yuǎn)等采用氣管滴注法對(duì)雄性SD大鼠進(jìn)行PM2.5染毒發(fā)現(xiàn)可引起大鼠肺部的炎性損傷[10]；羅斌等采用氣管滴注法對(duì)雄性Wistar大鼠進(jìn)行PM2.5染毒發(fā)現(xiàn)其不僅引起大鼠心肌組織氧化損傷和抗氧化功能的抑制，還引起心臟的炎癥反應(yīng)[11]。以上研究表明通過(guò)氣管滴注適量濃度的PM2.5可以引起大鼠肺部和心臟的炎性損傷；另外可能與本研究濃度相對(duì)較低有關(guān)。

PM2.5主要作用于呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，本研究通過(guò)抗體芯片檢測(cè)海馬組織炎性因子的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的炎性因子可分為8類炎性因子。其中與對(duì)照組比較，低劑量組和高劑量組海馬組織中都顯著升高的炎性因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可以作為炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)志物有IL-2、IL-10、IL-6、IL-12p70和IL-17A等白細(xì)胞介素類和腫瘤壞死因子TNF-α[12]；有主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的干擾素IFN-γ[12]；有作為炎癥調(diào)節(jié)因子具有良好的抗細(xì)胞凋亡和較強(qiáng)的抗炎作用的菌落刺激因子CSF1和CSF2[13]；有與中樞炎癥有著密切的聯(lián)系，可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生或作為促炎趨化因子的CX3CL1, SDF-1、MCP1等趨化因子[14-16]；與對(duì)照組比較低劑量組和高劑量組海馬組織中都顯著降低的炎性因子有誘導(dǎo)活化T細(xì)胞的趨化因子MIG，診斷炎癥性疾病重要標(biāo)志物的腫瘤壞死因子TNF受體sTNFR1[17-18]。與對(duì)照組比較只在低劑量組顯著升高的炎性因子有參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、白細(xì)胞調(diào)節(jié)的趨化因子TECK[19]，沒有只在低劑量組顯著降低的炎性因子；與對(duì)照組比較只在高劑量組顯著升高的炎性因子有來(lái)源自活化的T淋巴細(xì)胞，作為巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的重要趨化因子TCA-3[15]，而只在高劑量組顯著降低的炎性因子有發(fā)揮激活及趨化單核細(xì)胞的作用,進(jìn)而引起炎癥等機(jī)體反應(yīng)的趨化因子MIP-1[20]，參與全身炎癥因子調(diào)節(jié)作用，屬于腫瘤壞死因子TNF超家族的配體FASLG[21]和CD30LG[22]，廣泛調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞的分化、 成熟、遷移、細(xì)胞因子分泌的瘦素Leptin[23]。

綜上所述，鼻腔滴注PM2.5可誘導(dǎo)小鼠海馬損傷，作用途徑可能為嗅腦通路，炎性機(jī)制可能與海馬組織中的TNF-α、IL-6等促炎因子的顯著升高和sTNFR1 、FASLG等炎性疾病標(biāo)志物的顯著降低有關(guān)。