不同產(chǎn)地茯苓中7種三萜類成分含量的測定及聚類分析

萬鳴 黃超 楊玉瑩 羅心遙 葉曉川 丁影 董瓊 陳樹和

摘 要 目的：建立同時測定茯苓藥材中7種三萜類成分含量的方法，并比較不同產(chǎn)地茯苓藥材中上述成分的差異性，為茯苓藥材的質(zhì)量控制提供參考。方法：以不同產(chǎn)地的36批茯苓藥材為樣品，采用高效液相色譜法測定去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸的含量。色譜柱為Thermo Acclaim 120 C18，流動相為乙腈-磷酸水（梯度洗脫），流速為1 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對36批不同產(chǎn)地茯苓藥材進行聚類分析。結(jié)果：7種三萜類成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好（r均不低于0.999 0），平均加樣回收率為96.74%～104.04%（RSD為0.54%～1.55%，n=6）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗的RSD均小于3.0%（n=6）;耐用性試驗的RSD均小于5.0%（n=2）。不同產(chǎn)地樣品之間7個指標(biāo)成分的單一含量均存在一定差異，但總體差異不明顯（多數(shù)樣品總含量分布在1.3～1.9 mg/g之間）。經(jīng)聚類分析，36批樣品共聚為5類，即S27單獨聚為第Ⅰ類，S30、S34聚為第Ⅱ類，S2、S8、S9聚為第Ⅲ類，S10、S11、S12、S14聚為第Ⅳ類，其余26批樣品聚為第Ⅴ類。結(jié)論：該方法操作簡單，精密度、重復(fù)性、耐用性均良好，可用于同時測定茯苓藥材中上述7種三萜類成分的含量。各產(chǎn)地茯苓藥材的質(zhì)量總體差異不顯著，大部分產(chǎn)區(qū)的茯苓含量均一、質(zhì)量穩(wěn)定，僅少部分存在差異。

關(guān)鍵詞 茯苓;三萜類成分;高效液相色譜法;含量測定;聚類分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the content determination of 7 kinds of triterpenoids in Poria cocos， and to compare the differences of the above components in P. cocos from different habitats， so as to provide reference for the quality control of P. cocos. METHODS： Using 36 batches of P. cocos from different habitats as samples， HPLC method was used for content determination of dehydrotomorphic acid， polyporhinic acid C， 3-epidehydrotomorphic acid， 3-O-acetyl-16α-hydroxy-hydrogenolysaccharic acid， dehydrotomorphic acid， pachymic acid and dehydrotrametenolic acid. The column was performed on Thermo Acclaim 120 C18 with mobile phase consisted of acetonitrile-phosphoric acid water （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm. The column temperature was 30 ℃， and the injection volume was 20 μL. SPSS 21.0 statistical software was used for cluster analysis of 36 batches of P. cocos from different habitats. RESULTS： The linearity of 7 triterpenoids was good in the range of their mass concentration （all r≥0.999 0）; average recoveries were 96.74%-104.04% （RSD=0.54%-1.55%， n=6）. RSDs of precision， and reproducibility stability （24 h） tests were all lower than 3.0% （n=6）. RSD of durability test was lower than 5.0% （n=2）. There were some differences in the single content of 7 indicator components among samples from different habitats， but the total content difference was not obvious （the total content of most samples was in the range of 1.3-1.9 mg/g）. After cluster analysis， 36 batches of sample were clustered into 5 categories， i.e. S27 was clustered into class Ⅰ; S30 and S34 were clustered into class Ⅱ; S2， S8 and S9 were clustered into class Ⅲ; S10， S11， S12 and S14 were clustered into class Ⅳ; and the remaining 26 batches of samples were clustered into class Ⅴ. CONCLUSIONS： The method is simple， and has good precision， repeatability and durability. It can be used for the simultaneous determination of above 7 components in P. cocos. There has no significant difference in the quality of P. cocos from different habitats. The content of P. cocos in most producing areas is uniform in content and stable in quality， only a few of them are different.

KEYWORDS Poria cocos; Triterpenoids; HPLC; Content determination; Cluster analysis

茯苓為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos （Schw.）Wolf]的干燥菌核，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其味甘、淡，性平，具有健脾補中、養(yǎng)心安神、利水滲濕的功效，主要用于水腫尿少、痰飲眩悸、脾虛食少、便溏泄瀉、心神不安、驚悸失眠等癥[1-2]。茯苓中主要有效成分為多糖類和三萜類[3]。在三萜類化合物中，去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸含量較高，且具有抗癌、利尿、神經(jīng)伸展促進、免疫抑制、抗炎等藥理活性[4-6]。

目前，茯苓中三萜類成分的含量測定方法有比色法和高效液相色譜（HPLC）法，但由于比色法的自身局限性，所以更多的是采用HPLC法進行測定。以往采用HPLC法進行多成分測定的研究中，一般是考慮茯苓中含量較高或易得的三萜類成分，最多的測了6種三萜類成分[7-11]。近期，田雙雙等[12]同時測定了茯苓中10種三萜類成分的含量，其中平均含量大于萬分之一的僅有5種。本研究以不同產(chǎn)地（湖北、安徽、云南、貴州等）的茯苓為樣品，采用 HPLC法同時測定其中含量大于萬分之一且具有顯著藥理活性的7種三萜類化學(xué)成分（去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸）的含量，并比較不同產(chǎn)地茯苓藥材中上述成分的差異性，為茯苓藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

U3000型HPLC儀[戴安（上海）分析儀器有限公司];Chromeleon色譜工作站、FA604C型萬分之一分析天平（美國OHAUS公司）;DV215CD型十萬分之一分析天平（瑞士Pricisa公司）;JP-04OST型超聲提取機（昆山市超聲儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

36批茯苓藥材分別采自湖北、云南、安徽、貴州等地，經(jīng)湖北省中醫(yī)院/湖北省中醫(yī)藥研究院藥事部陳樹和主任藥師鑒定均為多孔菌科真菌茯苓[P. cocos （Schw.） Wolf]的干燥菌核;去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸對照品均為本實驗室自制（批號均為20191021），經(jīng)峰面積歸一化法計算得上述對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%;甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。36批茯苓樣品信息詳見表1（注：表中“打引巴”為茯苓在覆土下窖栽培時加一塊鮮菌核于段木上，起到了菌絲誘引生長作用，也稱肉引栽培）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Acclaim 120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脫（0～7 min，65%A;7～25 min，68%A;25～27 min，70%A;27～45 min，76%A;45～56 min，80%A;56～62 min，100%A）;流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃;檢測波長：210 nm;進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取一定量的去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸對照品，分別置于不同25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備各單一對照品母液。分別取一定量的各對照品母液置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋制成去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸質(zhì)量濃度分別為0.040 4、0.040 6、0.029 7、0.014 6、0.020 4、0.126 8、0.019 4 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取茯苓細(xì)粉（過80目，下同）2 g，置于50 mL錐形瓶中，加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，搖勻，超聲（頻率：40 kHz，功率：500 W）提取30 min，靜置15 min后再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，以0.45 ?m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 取陰性對照溶液（即甲醇溶液）、混合對照品溶液、供試品溶液（樣品編號：S26），分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，7種待測成分與各自相鄰峰間的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于10 000，色譜峰對稱因子在0.95～1.05之間，且陰性對照無干擾，結(jié)果見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液10、18、20、25、30、50 μL，分別按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、進樣量為橫坐標(biāo)（x，?g）進行線性回歸。結(jié)果表明，各成分在各自進樣量范圍內(nèi)與其峰面積均呈良好的線性關(guān)系（r均不低于0.999 0）。7種三萜酸類成分的回歸方程與線性范圍測定結(jié)果見表2。

2.3.3 定量限與檢測限考察 分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，以甲醇倍比稀釋后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸的定量限分別為0.282 8、0.284 2、0.237 6、0.102 2、0.142 8、0.152 2、0.116 4 μg，檢測限分別為0.080 8、0.081 2、0.089 1、0.029 2、0.040 8、0.050 7、0.038 8 μg。

2.3.4 精密度試驗 取供試品溶液（樣品編號：S26）適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸峰面積的RSD分別為1.60%、1.72%、0.42%、1.70%、1.64%、1.61%、1.52%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 稱取茯苓細(xì)粉（樣品編號：S26）2 g，平行6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并以外標(biāo)法計算各成分的含量。結(jié)果顯示，去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸含量的RSD分別為0.72%、0.72%、1.29%、1.31%、0.97%、0.64%、0.56%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（樣品編號：S26），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸峰面積的RSD分別為1.81%、1.97%、1.93%、1.35%、2.03%、0.64%、0.62%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的茯苓細(xì)粉（樣品編號：S26）1 g，平行6份，按與已知成分含量1 ∶ 1（m/m）的比例精密加入相應(yīng)對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計算各成分的含量并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，茯苓中7種待測成分的平均加樣回收率為96.74%～104.04%，RSD為0.54%～1.55%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度較好。加樣回收率試驗結(jié)果見表3。

2.3.8 耐用性考察 在固定其他色譜條件不變的情況下，分別考察不同型號色譜柱[Thermo Acclaim 120 C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Sepax GP-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Agela Innoval C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）]和不同柱溫（30、35 ℃）對7種成分含量測定的影響。試驗重復(fù)2次，取平均值。結(jié)果顯示，在不同色譜柱或不同溫度下測得的7種成分含量無明顯差異，RSD均小于5.0%（n=2），表明本方法的耐用性較好。耐用性試驗結(jié)果見表4。

2.4 樣品含量測定

取36批不同產(chǎn)地茯苓藥材粉末，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計算樣品中7種成分的含量，結(jié)果見表5。

結(jié)果顯示，36批茯苓樣品中7種三萜類成分的總含量在0.887 7～2.519 0 mg/g之間，多數(shù)樣品中總含量分布在1.3～1.9 mg/g范圍內(nèi)。若以7個成分總含量的平均值（1.740 1 mg/g）下浮20%計，含量為1.392 1 mg/g，共有31批樣品滿足要求，占樣品量的86.1%;若以樣品數(shù)的90%合格計，則總含量為1.304 3 mg/g，共有32個樣品滿足要求。以上結(jié)果說明，各產(chǎn)區(qū)茯苓中7種成分含量測定值相對集中，比較穩(wěn)定，總體差異不明顯。

2.5 聚類分析

將36批茯苓樣品中7種三萜類成分的含量測定結(jié)果導(dǎo)入SPSS 21.0 軟件中，采用聚類分析法結(jié)合平均歐氏距離（d）進行分析，生成36批不同產(chǎn)地茯苓中三萜類成分含量的聚類分析樹狀圖，詳見圖2。以d=14劃分，36批樣品共聚為5類：樣品S27單獨聚為第Ⅰ類，來自湖北英山;樣品S30、S34聚為第Ⅱ類，分別來自湖北英山（代料栽培品）和云南普洱;樣品S2、S8、S9聚為第Ⅲ類，分別來自云南永仁縣孟虎鄉(xiāng)（S2）、貴州凱里市碧浪鎮(zhèn)（S8、S9）;樣品S10、S11、S12、S14聚為第Ⅳ類，分別來自云南永仁縣孟虎鄉(xiāng)（S10）、貴州銅仁市德江縣（S11、S12）、安徽安慶市岳西縣（S14）;其余26批樣品聚為第Ⅴ類，均來自湖北、云南廣西等多個產(chǎn)地。其中，第Ⅰ類樣品中各個成分的含量均相對較高，第Ⅰ～Ⅲ類樣品中7種成分總含量均大于2.00 mg/g，第Ⅳ類樣品中各成分含量均較低，第Ⅴ類樣品中總含量在1.47～2.18 mg/g之間。由此可知，僅湖北、云南、貴州地區(qū)部分茯苓藥材中7種成分含量相對較高，且26批來自湖北、云南、廣西、安徽等地的樣品均聚為一大類，表明大部分產(chǎn)區(qū)產(chǎn)出的茯苓藥材含量均一、質(zhì)量穩(wěn)定，僅少量存在差異。

3 討論

3.1 供試品提取時間和色譜條件的篩選

在前期研究中，本課題組考察了供試品超聲提取時間（15、20、30、40 min）對提取效果的影響。結(jié)果顯示，以甲醇為提取溶劑超聲提取30 min后，樣品中7種三萜類成分的含量最高。在波長的選擇上，本課題組根據(jù)7種待測成分的吸收波長特點[13-14]，分別考察了在210、240 nm波長下的檢測效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在210 nm波長下7種三萜類成分均有最大吸收，在240 nm波長下茯苓酸無吸收，故最終選擇210 nm為測定波長。在流動相選擇上，本課題組分別考察了乙腈-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相時，各待測成分與相鄰峰之間分離度好，峰形尖銳、對稱性好，理論板數(shù)均大于10 000，符合含量測定的分離要求。

3.2 不同產(chǎn)地茯苓中7種三萜類成分含量的差異分析

不同產(chǎn)地36批茯苓藥材中7種三萜類成分含量測定的直觀分析結(jié)果顯示，大多數(shù)茯苓樣品含量較均一，無明顯地域上的差異，這可能是由于茯苓作為菌類藥材不同于植物藥材，其對不同土壤、氣候等自然條件有著較強的耐受性。聚類分結(jié)果顯示，除少數(shù)湖北、云南及貴州產(chǎn)樣品中7種成分總含量較高之外，其余有26批樣品均聚為一大類，以湖北、安徽大別山、云南等地為主要類別，產(chǎn)區(qū)之間的差異亦不明顯。根據(jù)調(diào)查及現(xiàn)有的報道，目前茯苓栽培產(chǎn)區(qū)分布比較廣，雖各產(chǎn)區(qū)的土壤、海拔、氣候、種植加工方式等有一定差異，但茯苓作為菌類藥材體現(xiàn)了其良好的生長適應(yīng)性，質(zhì)量相對穩(wěn)定[15-19]。本研究結(jié)果亦表明，主產(chǎn)區(qū)茯苓藥材樣品間7種三萜類成分含量差異不明顯，品質(zhì)均一，提示在一定程度上可擴大臨床使用茯苓的供應(yīng)產(chǎn)區(qū)范圍，這為解決藥材供需矛盾起到了積極作用。

綜上所述，本研究建立了HPLC 法同時測定茯苓藥材中7種三萜類成分的含量，該方法操作簡單，精密度、重復(fù)性和耐用性均良好，適用于茯苓藥材的多成分定量分析。本次對36批不同產(chǎn)地樣品進行含量測定及分析發(fā)現(xiàn)，以湖北、云南、貴州地區(qū)產(chǎn)部分茯苓的含量相對較高，但不同產(chǎn)地間樣品差異不顯著、質(zhì)量較穩(wěn)定。后期有必要繼續(xù)擴大樣本量，以全面掌握茯苓藥材的品質(zhì)。

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（收稿日期：2020-03-12 修回日期：2020-06-16）

（編輯：林 靜）