基于古法特色炮制前后的地黃飲片及其多糖對(duì)衰老模型大鼠的抗氧化作用比較

周艷 杜莉杰 鄭旭亞 孫菲菲 張振凌

摘 要 目的：比較地黃特色炮制過(guò)程中鮮地黃、干地黃、熟地黃及其炮制前后多糖對(duì)衰老模型大鼠的抗氧化作用差異，為地黃的加工炮制提供參考。方法：按照古法特色炮制方法制備熟地黃樣品，保留加工過(guò)程中鮮地黃、干地黃樣品，并采用水提醇沉法提取鮮地黃和熟地黃中的粗多糖。將96只大鼠分為空白組（水）、模型組（水）、陽(yáng)性對(duì)照組[維生素C，100 mg/（kg·d）]、鮮地黃組[700 mg/（kg·d）]、干地黃組[135 mg/（kg·d）]、熟地黃組[135 mg/（kg·d）]、鮮地黃多糖組[1 400 mg/（kg·d），以鮮地黃質(zhì)量計(jì)]和熟地黃多糖組[270 mg/（kg·d），以熟地黃質(zhì)量計(jì)]，每組12只。除空白組外，其余各組大鼠均于頸背部皮下注射D-半乳糖[125 mg/（kg·d）]復(fù)制亞急性衰老模型，并于造模同時(shí)灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)給藥56 d。末次給藥后，測(cè)定大鼠肝、腦、腎、脾、心臟、胸腺指數(shù)，并測(cè)定其血清和肝、腦、腎組織中總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、過(guò)氧化氫酶（CAT）活力、丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠各臟器指數(shù)以及血清和腦、肝、腎組織中T-AOC和SOD活力、CAT活力均顯著降低（P<0.05或P<0.01），MDA含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，鮮地黃組大鼠腦、肝、腎指數(shù)以及血清和腎組織中SOD活力升高不顯著（P>0.05）;干地黃組大鼠腎指數(shù)以及血清和腦組織中T-AOC，血清和肝、腎組織中SOD活力升高不顯著（P>0.05）;鮮地黃多糖組大鼠腎指數(shù)以及血清和腦組織中T-AOC，血清中SOD活力升高不顯著（P>0.05）;其余各組大鼠臟器指數(shù)，血清和組織中T-AOC、SOD、CAT活力均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;各給藥組大鼠血清及腦、肝、腎組織中MDA含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與鮮地黃組比較，干地黃組大鼠血清中T-AOC顯著降低（P<0.01），其余測(cè)定指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;熟地黃組大鼠腎、脾指數(shù)顯著升高（P<0.05），腎組織中T-AOC，血清和腦、腎組織中SOD活力，腦、肝組織中CAT活力均顯著升高（P<0.05或P<0.01），腦、肝組織中MDA含量顯著降低（P<0.01）;熟地黃組大鼠腦和肝組織中CAT活力顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01）。與鮮地黃多糖組比較，熟地黃多糖組大鼠脾、腎指數(shù)顯著升高（P<0.05或P<0.01），血清和腦、肝、腎組織中T-AOC、SOD活力、CAT活力均顯著升高（P<0.05或P<0.01）并且其腦、肝、腎組織中T-AOC和CAT活力均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：在提高衰老模型大鼠臟器指數(shù)以及增強(qiáng)其血清和腦、肝、腎組織中抗氧化酶活力方面，熟地黃優(yōu)于鮮地黃和干地黃，熟地黃多糖優(yōu)于鮮地黃多糖。古法特色炮制地黃過(guò)程中多糖的改變提高了其抗氧化能力。

關(guān)鍵詞 熟地黃;古法特色炮制;地黃多糖;抗氧化能力;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare the difference in the antioxidant effect of fresh Rehmannia glutinosa， dried R. glutinosa， R. glutinosa preparata during ancient characteristic processing and its polysaccharides before and after processing on aging model rats， and to provide reference for the processing of R. glutinosa. METHODS： The sample of R. glutinosa preparata was prepared according to ancient characteristic method. During the processing， the fresh and dried R. glutinosa samples were retained. Then crude polysaccharide were extracted from fresh R. glutinosa and Rehmanniae radix preparata by water extraction and alcohol precipitation. Totally 96 rats were divided into blank group （water）， model group （water）， positive control group [vitamine C，100 mg/（kg·d）]，fresh R. glutinosa group [700 mg/（kg·d）]，dried R. glutinosa group [135 mg/（kg·d）] ，Rehmanniae radix preparata group [135 mg/（kg·d）]，fresh R. glutinosa polysaccharide group [1 400 mg/（kg·d）， by the weight of fresh R. glutinosa] and Rehmanniae radix preparata polysaccharide group [270? ? ? ?mg/（kg·d）， by the weight of Rehmanniae radix preparata]， with 12 rats in each group. Except for blank group， other groups were given D-galactose [125 mg/（kg·d）] on neck and back to induce sub-acute aging model. At the same time， they were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 56 days. After last administration， the liver， brain， kidney， spleen， heart and thymus indexes were determined. The total antioxidant capacity （T-AOC）， superoxide dismutase （SOD） activity， catalase （CAT） activity and MDA content in serum， liver， brain and kidney were determined. RESULTS： Compared with blank group， organ indexes of rats in the model group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; T-AOC， SOD activity and CAT activity in serum， brain， liver and kidney tissue were decreased significantly （P<0.01）， while MDA content increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the organ indexes of brain， liver and kidney， SOD activity in serum and kidney of fresh R. glutinosa group were not significantly increased （P>0.05）; kidney index， T-AOC in serum and brain， SOD activity in serum， liver and kidney tissue were not significantly increased in the dried R. glutinosa group （P>0.05）; kidney index， T-AOC in serum and cerebral tissue， SOD activity in serum were not significantly increased in fresh R. glutinosa group （P>0.05）; other organ indexes， T-AOC， SOD activity and CAT activity in serum and tissues were increased significantly in other groups （P<0.05 or P<0.01）， while MDA content in serum and tissues were decreased significantly in all administration groups （P<0.05 or P<0.01）. Compared with fresh R. glutinosa group， T-AOC in serum was decreased significantly in dried R. glutinosa group （P<0.01）， and there was no significant difference in other indexes （P>0.05）; kidney and spleen indexes of rats in Rehmanniae radix preparata group were increased significantly （P<0.05）， T-AOC in renal tissue， SOD activity in serum， cerebral tissue and renal tissue， CAT activity in cerebral and liver tissue were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while MDA in cerebral and liver tissue were significantly decreased （P<0.01）. CAT in cerebral tissue and liver tissue of rats in Rehmanniae radix preparata group were significantly higher than those in positive control group （P<0.01）. Compared with fresh R. glutinosa polysaccharide group， spleen and renal indexes of rats in Rehmanniae radix preparata group were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， T-AOC， SOD activity and CAT activity in serum and cerebral， liver， renal tissues were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. T-AOC and CAT activity of cerebral， liver and renal tissues in Rehmanniae radix preparata group were all significantly higher than those in positive control group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： In the aspect of increasing organ index and improving the activity of antioxidant enzymes in serum， cerebral， liver and renal tissues of aging model rats， Rehmanniae radix preparata is superior to fresh R. glutinosa and dried R. glutinosa; R. glutinosa preparata polysaccharide is superior to fresh R. glutinosa polysaccharide. During ancient characteristic processing of R. glutinosa， the change of polysaccharide can improve its anti-oxidation activity.

KEYWORDS? ?Rehmanniae radix preparata; Ancient characteristic processing; Rehmannia glutinosa polysaccharides; Antioxidant ability; Rats

地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia? glutinosa? Libosch.）的新鮮或干燥塊根，常用飲片有鮮地黃、生地黃和熟地黃。其中，鮮地黃味甘、苦，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱生津、涼血、止血功效;生地黃味甘，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津功效;熟地黃味甘，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)血滋陰、益精填髓功效，用于肝腎陰虛、須發(fā)早白等[1]。由此可知，鮮地黃炮制成熟地黃后其補(bǔ)血益精填髓的功能有所增加。目前，2015年版《中國(guó)藥典》（一部）以及各省市中藥飲片炮制規(guī)范收載的熟地黃均是以干地黃為原料，采用清蒸、酒蒸以及酒燉等方法炮制而得。而干地黃目前是按照農(nóng)副產(chǎn)品進(jìn)行管理，其加工方法的不統(tǒng)一和貯藏條件的不同易造成其質(zhì)量參差不齊，從而導(dǎo)致用干地黃加工的熟地黃不能達(dá)到傳統(tǒng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

筆者前期查閱古代文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)地黃炮制品名稱有“鮮生部分、生干部分、干熟不分”的現(xiàn)象，唐代以前地黃蒸制均是由鮮地黃為原料經(jīng)反復(fù)蒸曬炮制而成[2-3]，唐代以后至清代也多次出現(xiàn)以鮮地黃為原料蒸曬熟地黃的記載[4-5]，這說(shuō)明古代熟地黃炮制方法是以鮮地黃為原料多次蒸曬。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)挖掘傳統(tǒng)炮制技術(shù)，建立了由鮮地黃直接加工成熟地黃的特色炮制一體化工藝[6]，并對(duì)此工藝炮制的熟地黃的主要有效成分變化和補(bǔ)血藥效進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)該工藝制備的熟地黃不僅達(dá)到“色如漆，甘如飴，亮如油”的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)，而且其補(bǔ)血、抗衰老作用明顯[7]。另有研究表明，熟地黃可以提高大鼠的抗氧化能力[8]，在加工炮制過(guò)程中其抗衰老作用有所增強(qiáng)[9]。在炮制過(guò)程中，地黃中多種成分含量均有所降低[10]，但多糖含量卻升高[11]且伴隨著結(jié)構(gòu)[12-13]改變，而地黃多糖具有提高機(jī)體免疫力[14]、抗腫瘤[15]、抗疲勞[16]、抗氧化[17]等方面的作用，因此筆者推測(cè)熟地黃抗氧化作用可能與其多糖含量的升高有關(guān)。另有研究認(rèn)為，提高機(jī)體的抗氧化酶活性可以延緩衰老[18]。鑒于此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)以鮮地黃為原料的特色炮制熟地黃飲片及其多糖在大鼠體內(nèi)的抗氧化作用進(jìn)行考察，并考察地黃炮制過(guò)程中多糖變化對(duì)其抗氧化作用的影響，為地黃炮制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

PT-3502G型酶標(biāo)儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）;KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;JX-FSTPRP-48型自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）;ZD-F/2型冷凍干燥機(jī)（南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司）;TG16-WS型高速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）;BSA224S-CW型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

鮮地黃藥材于2018年12月購(gòu)于河南省焦作市武陟縣，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為玄參科植物地黃（R.? glutinosa? Libosch.）的塊根。D-半乳糖（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S11050）;維生素C片（華中藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20190308，規(guī)格：100 mg/片）;總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（血清試劑盒批號(hào)：CK-E31087，臟器試劑盒批號(hào)：ml022376）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（血清試劑盒批號(hào)：CK-E34817，臟器試劑盒批號(hào)：ml059817）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒（血清試劑盒批號(hào)：CK-E35798，臟器試劑盒批號(hào)：ml037079）;丙二醛（MDA）試劑盒（血清試劑盒批號(hào)：CK-E30239，臟器試劑盒批號(hào)：ml022446）均由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供;0.9%氯化鈉注射液（河南科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：C119060201-1，規(guī)格：250 mL ∶ 2.25 g）;無(wú)水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20190115，分析純）;其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

健康Wistar大鼠96只，SPF級(jí)，雌雄各半，8周齡，雌性大鼠體質(zhì)量為（220±10） g、雄性大鼠為（320±10） g，購(gòu)自河南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003，使用合格證號(hào)：SYXK（豫）2015- 0005。大鼠在溫度（25±2） ℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則的要求及規(guī)則進(jìn)行。

2 方法

2.1 藥液的制備

2.1.1 鮮地黃樣品溶液的制備 取鮮地黃210 g，加210 mL水打汁，8層紗布過(guò)濾，收集汁液;藥渣用水洗2次、每次200 mL，收集洗脫液，與汁液合并。將合并液濃縮至600 mL，用離心管按每管30 mL分管后，置于-80 ℃冰箱中保存。臨用前分批取出，室溫融化，每30 mL濃縮液用水稀釋至150 mL，制備成70 mg/mL的溶液（以鮮地黃原藥材量計(jì)算）。

2.1.2 干地黃樣品溶液的制備 取特色炮制過(guò)程中鮮地黃經(jīng)第1次蒸曬、炮制程度相當(dāng)于干地黃的樣品（簡(jiǎn)稱為“干地黃”）135 g（每5.2 kg鮮地黃可得到1 kg干地黃），加8倍量水（mL/g，下同）浸泡30 min，再煎煮30 min，過(guò)濾;藥渣再加倍8倍量水煎煮20 min，過(guò)濾，并合并濾液。將合并液濃縮至500 mL，用離心管按每管30 mL分管后，置于-80 ℃冰箱中保存。臨用前分批取出，室溫融化，每30 mL濃縮液用水稀釋至600 mL，制備成13.5 mg/mL的溶液（以干地黃原藥材量計(jì)，相當(dāng)于含鮮地黃藥材70 mg/mL）。

2.1.3 熟地黃樣品溶液的制備 按照前期研究?jī)?yōu)選的熟地黃特色炮制方法[6]制備熟地黃樣品（簡(jiǎn)稱“熟地黃”）。取蒸曬5次達(dá)到炮制終點(diǎn)的熟地黃，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成含熟地黃原藥材13.5 mg/mL的溶液（相當(dāng)于含鮮地黃藥材70 mg/mL）。

2.1.4 鮮地黃多糖樣品溶液的制備 取鮮地黃300 g，剪成粒度為2～4 mm的碎末，加30倍量水，在50 ℃下超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）60 min，過(guò)濾，濃縮至400 mL，加無(wú)水乙醇調(diào)溶液的醇體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置24 h，過(guò)濾，收集濾液;沉淀用無(wú)水乙醇洗滌后，用水溶解，采用Sevag法[19]除蛋白，得鮮地黃多糖溶液（多糖得率為7.5%，總多糖含量為3%）。將溶液濃縮至300 mL，用離心管按每管28 mL分管后，置于-80 ℃冰箱中保存。臨用時(shí)分批取出，室溫融化，每管加水稀釋至200 mL，制備成140 mg/mL的溶液（以鮮地黃原藥材量計(jì)）。

2.1.5 熟地黃多糖樣品溶液的制備 取特色炮制終點(diǎn)的熟地黃300 g，按照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備熟地黃多糖樣品溶液（多糖得率為23.5%，總多糖含量為14%）。將溶液濃縮至600 mL，用離心管按每管27 mL分管后，置于-80 ℃冰箱中保存。臨用時(shí)每管加水稀釋至500 mL，制備成27 mg/mL的溶液（以熟地黃原藥材量計(jì)）。

2.1.6 陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備 取維生素C片，研磨成細(xì)粉，加水配制成10 mg/mL的溶液，臨用時(shí)現(xiàn)配。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

取大鼠96只隨機(jī)分為8組，即空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、鮮地黃組、干地黃組、熟地黃組、鮮地黃多糖組和熟地黃多糖組，每組12只（雌雄各半）。除空白組注射等量生理鹽水外，其余各組大鼠均于頸背部皮下注射D-半乳糖[125 mg/（kg·d）]復(fù)制亞急性衰老模型[20]。于造模同時(shí)，空白組和模型組大鼠灌胃水，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃維生素C水溶液[100 mg/（kg·d），依據(jù)臨床用量，按人和大鼠間體表面積折算而得，并通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定劑量]，鮮地黃組大鼠灌胃鮮地黃樣品溶液[700 mg/（kg·d），根據(jù)臨床上鮮地黃最大用量30 g計(jì)算，并按人和大鼠間體表面積折算后確定劑量]，干地黃組大鼠灌胃干地黃樣品溶液[135 mg/（kg·d）]，熟地黃組大鼠灌胃熟地黃樣品溶液[135 mg/（kg·d）]，鮮地黃多糖組大鼠灌胃鮮地黃多糖樣品溶液[1 400 mg/（kg·d），以鮮地黃藥材計(jì)]，熟地黃多糖組大鼠灌胃熟地黃多糖樣品溶液[270 mg/（kg·d），以熟地黃藥材計(jì)]（干地黃組、熟地黃組、鮮地黃多糖組和熟地黃多糖組的給藥劑量均是根據(jù)鮮地黃組的用量，按照各樣品相對(duì)鮮地黃的得率折算后得到）。每天給藥1次，連續(xù)給藥56 d。給藥期間，每周測(cè)定1次大鼠體質(zhì)量，隨體質(zhì)量變化調(diào)整其造模及灌胃給藥量。因鮮地黃組和鮮地黃多糖組各有1只雄性大鼠死亡，故每組最終選擇10只大鼠進(jìn)行結(jié)果分析（雌雄各半）。

2.3 樣品采集及處理

末次給藥后，所有大鼠禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量后摘眼球取血，將血樣在4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min制備血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存，待測(cè)。取血后斷頸處死大鼠，置于冰袋上迅速解剖，取出肝、腦、腎、脾、心臟、胸腺等臟器，用棉簽吸去浮血，用冰冷生理鹽水清洗后再以濾紙吸干，并稱定各臟器質(zhì)量。然后將肝、腦、腎組織置于液氮中速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 臟器指數(shù)的測(cè)定 根據(jù)大鼠臟器質(zhì)量和體質(zhì)量計(jì)算各臟器（肝、腦、腎、脾、心臟、胸腺）指數(shù)：臟器指數(shù)（mg/g）=臟器（肝、腦、腎、脾、心臟、胸腺）質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

2.4.2 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 分別取冷凍的血清和肝、腦、腎組織樣品適量，在冰上解凍，精密稱取組織樣品0.05 g，加適量冰生理鹽水勻漿，再加入生理鹽水制備成10%的組織勻漿液，在4 ℃條件下以4 000 r/min離心10 min，取上清液。分別按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)血清和肝、腦、腎組織中T-AOC、SOD活力、CAT活力和MDA含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠腦、肝、心臟、腎、脾、胸腺指數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，除鮮地黃組大鼠腦、肝、腎指數(shù)和干地黃組、鮮地黃多糖組大鼠腎器指數(shù)升高不顯著外（P>0.05），各組大鼠其余臟器指數(shù)均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。鮮地黃組與干地黃組比較以及干地黃組與熟地黃組比較，大鼠各臟器指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;熟地黃組大鼠腎、脾指數(shù)較鮮地黃組顯著升高（P<0.05），并且熟地黃組大鼠各臟器指數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與鮮地黃多糖組比較，熟地黃多糖組大鼠肝、心臟指數(shù)顯著降低（P<0.01），但腎、脾指數(shù)顯著升高（P<0.05或P<0.01），并且其脾指數(shù)顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）。各組大鼠臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 大鼠血清和腦、肝、腎組織中T-AOC測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠血清和腦、肝、腎組織中T-AOC均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，僅干地黃組和鮮地黃多糖組大鼠血清和腦組織中T-AOC升高不顯著（P>0.05），其余各組大鼠血清和腦、肝、腎組織中T-AOC均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與鮮地黃組比較，干地黃組大鼠血清中T-AOC顯著降低（P<0.01），熟地黃組大鼠腎組織中T-AOC顯著升高（P<0.05）;熟地黃組大鼠腎組織中T-AOC顯著高于干地黃組（P<0.01），且與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與鮮地黃多糖組比較，熟地黃多糖組大鼠血清和腦、肝、腎組織中T-AOC均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且其腦、肝、腎組織中T-AOC顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠血清和腦、肝、腎組織中T-AOC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 大鼠血清和腦、肝、腎組織中SOD活力測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠血清和腦、肝、腎組織中SOD活力均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，鮮地黃組大鼠血清和腎組織中SOD活力以及干地黃組血清和肝、腎組織中SOD活力升高不顯著（P>0.05）外，其余各組大鼠血清和腦、肝、腎組織中SOD活力均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與鮮地黃組比較，干地黃組大鼠血清和各組織中SOD活力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;熟地黃組大鼠血清和腦、腎組織中SOD活力顯著升高（P<0.05或P<0.01），且其血清和腦、肝組織中SOD活力顯著高于干地黃組（P<0.01），血清中SOD活力顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）。與鮮地黃多糖組比較，熟地黃多糖組大鼠血清和腦、肝組織中SOD活力顯著升高（P<0.05或P<0.01），且其血清和腦、肝、腎組織中SOD活力與陽(yáng)性對(duì)照組比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠血清和腦、肝、腎組織中SOD活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 大鼠血清和腦、肝、腎組織中CAT活力測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠血清和腦、肝、腎組織中CAT活力均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各組大鼠血清和腦、肝、腎組織中CAT活力均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與鮮地黃組比較，干地黃組大鼠血清和腦、肝、腎組織中CAT活力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;熟地黃組大鼠腦、肝組織中CAT活力顯著升高（P<0.01），且其腦、肝組織中CAT活力顯著高于干地黃組和陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01）。與鮮地黃多糖組比較，熟地黃多糖組大鼠血清和腦、肝、腎組織中CAT活力均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且其腦、肝、腎組織中CAT活力顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01）。各組大鼠血清及腦、肝、腎組織中CAT活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

3.5 大鼠血清和腦、肝、腎組織中MDA含量測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠血清和腦、肝、腎組織中MDA含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各組大鼠血清和腦、肝、腎組織中MDA含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與鮮地黃組比較，干地黃組大鼠血清和腦、肝、腎組織中MDA含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;熟地黃組大鼠腦、肝、腎組織中MDA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），且其肝、腎組織中MDA含量顯著低于干地黃組（P<0.05或P<0.01），其腦組織中MDA含量顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01）。與鮮地黃多糖組比較，熟地黃多糖組大鼠肝組織中MDA含量顯著升高（P<0.01），且顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01）。各組大鼠血清和腦、肝、腎組織中MDA含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

4 討論

組織器官的質(zhì)量變化，特別是腦、胸腺、脾、肝、腎等重要器官的質(zhì)量變化，是反映動(dòng)物機(jī)體衰老程度的重要指標(biāo)[21]。肝和腎是機(jī)體重要的代謝器官，肝、腎指數(shù)降低在一定程度上反映了動(dòng)物代謝能力的降低;脾在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要作用，體液免疫和細(xì)胞免疫均和脾有關(guān)，脾萎縮會(huì)降低動(dòng)物的免疫功能[22]。心臟指數(shù)與免疫復(fù)合體及細(xì)胞免疫功能相關(guān)，而細(xì)胞免疫功能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病率有一定的影響[23]。本研究中熟地黃在升高模型大鼠腎、脾指數(shù)方面優(yōu)于鮮地黃，熟地黃多糖在升高模型大鼠腎、脾指數(shù)方面優(yōu)于鮮地黃多糖，這提示將鮮地黃采用特色炮制方法直接蒸曬成的熟地黃在延緩大鼠臟器退化、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)新陳代謝方面優(yōu)于鮮地黃，并且與炮制前后多糖的變化有一定關(guān)系。此外，鮮地黃和鮮地黃多糖均可顯著提高模型大鼠心臟指數(shù)，并且鮮地黃的作用優(yōu)于熟地黃多糖，這提示鮮地黃對(duì)心臟相關(guān)的免疫疾病的影響優(yōu)于熟地黃，并和鮮地黃多糖相關(guān)。

生物體在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生自由基，過(guò)多的自由基會(huì)使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生有害物質(zhì)而損傷生物體組織和器官;且隨著年齡的增長(zhǎng)，抗氧化酶活性降低，清除自由基能力下降，自由基堆積造成MDA含量升高，最終導(dǎo)致人體衰老[18]。因此，提高機(jī)體的抗氧化酶活性可以延緩衰老。在本研究中，與鮮地黃組比較，干地黃組大鼠僅血清中T-AOC顯著降低，其余測(cè)定指標(biāo)變化不顯著;與鮮地黃組比較，熟地黃組大鼠腎組織中T-AOC以及血清和腦、腎組織中SOD活力和腦、肝組織中CAT活力均顯著升高，并且熟地黃組大鼠腦、肝組織中CAT活力顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。這提示熟地黃在提高血清和臟器抗氧化酶活性方面優(yōu)于鮮地黃，以鮮地黃為原料多次蒸曬特色炮制熟地黃過(guò)程可以提高其抗氧化、抗衰老藥效。而熟地黃多糖組與鮮地黃多糖組比較，大鼠血清和腦、肝、腎組織中T-AOC、SOD活力、CAT活力均不同程度升高，且其腦、肝、腎組織中T-AOC、CAT活力均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組，提示熟地黃多糖相比鮮地黃多糖具有更強(qiáng)的抗氧化能力，這為熟地黃臨床抗衰老功效提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，特色炮制熟地黃的抗氧化能力優(yōu)于鮮地黃和蒸曬1次的干地黃，熟地黃多糖抗氧化能力優(yōu)于鮮地黃多糖，且上述比較結(jié)果在多個(gè)指標(biāo)上具有一致性，表明在古法特色炮制地黃過(guò)程中，其多糖發(fā)生了改變，并且這種改變與地黃炮制后抗氧化、抗衰老作用有一定的關(guān)聯(lián)。后續(xù)有必要進(jìn)一步對(duì)地黃炮制前后多糖結(jié)構(gòu)的單糖比和糖苷鍵的構(gòu)型變化進(jìn)行研究，以深入探索地黃炮制后藥性改變、抗衰作用增強(qiáng)的機(jī)制，并指導(dǎo)中醫(yī)恰當(dāng)應(yīng)用地黃炮制品，從而保證和提高其臨床療效。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：124-125.

[ 2 ] 孫思邈.備急千金要方[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1955：485.

[ 3 ] 孫思邈.千金翼方[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1955：61.

[ 4 ] 吳儀絡(luò).本草從新[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982：63-64.

[ 5 ] 凌奐.本草害利[M].北京：中醫(yī)古籍出版社，1982：97.

[ 6 ] 于文娜，張振凌，張穎，等.地黃炮制過(guò)程中異毛蕊花糖苷含量的動(dòng)態(tài)變化[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（18）：22-26.

[ 7 ] 趙丹，張振凌，王勝超，等.不同方法炮制的熟地黃的補(bǔ)血作用比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（19）：46-49.

[ 8 ] WAGNER WM，OUYANG Q，SEKERI-PATARYAS K， et al. Basic biology and clinical impact of immunosenescence[J]. Exp Gerontol，2002，37（2）：183-189.

[ 9 ] 常富業(yè)，李云，孫瑩，等.熟地黃抗衰、養(yǎng)生與美容作用探要[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（2）：283-285.

[10] 劉彥飛，趙宇，武衛(wèi)紅，等.地黃的化學(xué)成分及其在加工炮制過(guò)程中的變化[J].國(guó)外醫(yī)藥：植物藥分冊(cè)，2007，22（3）：102-108.

[11] 張留記，王建霞，屠萬(wàn)倩，等.生地黃與熟地黃中5個(gè)苷類成分和總多糖的含量比較[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2019，31（4）：566-571.

[12] TOMODA M，MIYAMOTO H，SHIMZU N，et al. Characterization of two polysaccharides having activity on the reticuloendothelial system from the root of Rehmannia glutinosa[J]. Chem Pharm Bull，1994，42（3）：625-629.

[13] 楊云，苗明三，王浴銘.懷地黃多糖化學(xué)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1999，10（8）：9-10.

[14] HUANG Y，JIANG C，HU Y，et al. Immunoenhancement effect of rehmannia glutinosa polysaccharide on lymphocyte proliferation and dendritic cell[J]. Carbohydrate Polymers，2013，96（2）：516-521.

[15] XU L，KWAK M，ZHANG W，et al. Rehmannia glutinosa polysaccharide induces toll-like receptor dependent spleen dendritic cell maturation and anti-cancer immunity[J]. Oncoimmunology，2017. DOI：10.1080/2162402X.2017. 1325981.

[16] TAN W，YU K Q，LIU YY，et al. Anti-fatigue activity of polysaccharides extract from Radix Rehmanniae Preparata[J]. Int J Biol Macromol，2012，50（1）：59-62.

[17] 付昊，龍虎，蔡自建，等.熟地黃多糖的體內(nèi)抗氧化活性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2019，40（4）：57-61.

[18] HARMAN D. About “origin and evolution of the free radical theory of aging：a brief personal history，1954- 2009”[J]. Biogerontology，2009，10（6）：773-781.

[19] SEVAG MG，LACKMAN DB，SMOLENS J. The isolation of the components of streptococcal nucleoproteins in serologically active form[J]. J Biol Chem，1938，124（1）：425-436.

[20] 徐叔云，卞如濂.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1464-1466.

[21] 劉濤，王燦暉，楊進(jìn)，等.改良三甲散抗腦衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2001，21（4）：308-309.

[22] 沙愛(ài)龍，吳瑛，盛海燕，等.昆侖雪菊黃酮對(duì)衰老模型小鼠腦及臟器指數(shù)的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（7）：66-68.

[23] 王茨，遲偉群，姜曉峰.自身抗體及炎癥因子與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2020，24（6）：1052-1056.

（收稿日期：2020-04-24 修回日期：2020-07-21）

（編輯：林 靜）