高效液相色譜 電感耦合等離子質(zhì)譜法分析雄黃在大鼠臟器中代謝的砷形態(tài)

陳紹占+杜振霞+劉麗萍+姜泓

摘 要 采用HPLC ICP MS 聯(lián)用技術(shù)建立了大鼠臟器中AsB， As， MMA， DMA和As等砷形態(tài)的分析方法。采用超聲水浴提取對樣品進(jìn)行前處理，Dionex IonPac AS19 陰離子交換柱，20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH 9.7）為流動相，對雄黃染毒后大鼠肝腎中的砷形態(tài)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)表明，方法不受40Ar35Cl+干擾，常見的5 種砷形態(tài)化合物的線性范圍為1～300 μg/L，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，檢出限為0.3～0.5 （μg/L）， RSD 均小于5%，加標(biāo)回收率為83.8%～111.7%。通過對肝腎的形態(tài)分析，表明經(jīng)雄黃染毒后大鼠肝臟中的砷形態(tài)主要為DMA、As和未知物2；腎臟中的砷形態(tài)主要為DMA、MMA、As、未知物1、未知物2 和未知物3。綜合表明，此方法適用于雄黃代謝后的主要砷形態(tài)分析。

關(guān)鍵詞 雄黃； 砷形態(tài)； 臟器； 高效液相色譜 電感耦合等離子質(zhì)譜

1 引言

近年來，中藥慢性中毒問題受到人們的高度重視。中藥雄黃在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有著悠久的歷史，具有解毒殺蟲，燥濕祛痰，截瘧等功效[1]。2010 年版《中國藥典》[1]規(guī)定雄黃飲片中As2S2的含量應(yīng)不低于90%，并對As2O3的量進(jìn)行了限制?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，雄黃在治療白血病[2]、癌癥[3]等惡性疾病方面也有不錯的療效。盡管雄黃具有這種獨(dú)特的療效，但由于其屬于含砷礦物藥，使其具有一定的毒性，而其毒性大小與砷的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)[4～6]。Rana等[7]報(bào)道了，砷暴露可通過干擾抗氧化防御系統(tǒng)和減小SOD2 的基因表達(dá)，從而對肝、腎造成損傷。

目前，測定砷形態(tài)的分析方法主要有高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC ICP MS）[8～10]、高效液相色譜與氫化物發(fā)生 原子熒光聯(lián)用技術(shù)（HPLC HG AFS）[11，12]、高效液相色譜與氫化物發(fā)生 原子吸收聯(lián)用技術(shù)（HPLC HG AAS）[13]、毛細(xì)管電泳與電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE ICP MS）[14，15]、高效液相色譜與電噴霧離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC ESI MS）[16]，主要用于食品等領(lǐng)域的測定，未見在雄黃代謝中應(yīng)用的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC ICP MS測定雄黃在大鼠肝腎中代謝砷形態(tài)的方法，為研究雄黃在大鼠體內(nèi)的代謝提供支持，同時(shí)考察了樣品前處理過程中砷形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，并運(yùn)用此法對雄黃在大鼠肝、腎中代謝后的砷形態(tài)進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步研究雄黃的藥代動力學(xué)提供合適的方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200 型高效液相色譜儀及7500a 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP MS，美國Agilent 公司）；Dionex IonPac AS19 陰離子交換柱（250 mm × 4 mm， 10 μm）；Milliplus 2150 超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；數(shù)控超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼公司）。

（NH4）2CO3， NH3·H2O， H2O2（30%）、冰醋酸、NaCl均為優(yōu)級純；砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：亞砷酸根離子＼[As]、 砷酸根離子＼[As]、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷甜菜堿（AsB），均購于中國計(jì)量科學(xué)研究院。超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

2.2 質(zhì)譜與色譜條件

ICP MS 條件：RF入射功率1450 W，載氣為高純氬氣，載氣流速0.65 L/min，輔助氣流速0.45 L/min， 射頻電壓1.72 V，采樣深度7.8 mm，泵速0.3 r/s，檢測同位素 75As和35Cl。

HPLC 條件：Dionex IonPac AS 19 陰離子分析柱；流動相： 20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7）；流速：1.2 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣體積：25 μL。

2.3 染毒方法

取4周齡Wistar大鼠4只，體重（50 ± 10）g。分為低、中、高劑量組，給藥劑量分別為0.3， 0.9和2.7 g/kg （以0.5% CMC 為混懸介質(zhì)），對照組給予0.5 % CMC （羧甲基纖維素鈉），雄黃染毒組灌胃給藥，每天灌胃1 次，連續(xù)6星期。染毒期間每3 天稱重1 次，調(diào)節(jié)灌胃劑量。實(shí)驗(yàn)動物室溫度（24±1） ℃， 相對濕度（50±5）%，每天12 h光照，動物可自由攝食攝水。于末次給藥2 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肝臟和腎臟。

2.4 樣品前處理方法

稱取0.3～0.4 g （精確到0.001 g）粉碎后的試樣，加38 mL 水、2 mL 3%乙酸溶液，渦旋混勻后，60 ℃ 水浴超聲2 h， 于4 ℃ 冰箱中靜置5 min后，取出，于4 ℃以9000 r/min離心10 min，上清液過0.2 μm濾膜。同時(shí)制備各試劑空白溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

陰離子交換色譜和陽離子交換色譜均可用于砷形態(tài)分析。根據(jù)砷化合物的離子特性，陰離子交換色譜通常用來分析As、As、MMA 和 DMA，而陽離子交換色譜用于分離AsB、AsC、TMAO 和TETRA。

在陰離子交換色譜中，AsB 和As在中性pH 條件下于死體積處共洗脫。通過向流動相中加入酒石酸后，使As與酒石酸形成陰離子的絡(luò)合物，在色譜柱內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的保留特性，從而使As與AsB 分開[17]。也可通過增大pH值至9.0 以上[18]或?qū)s氧化成As實(shí)現(xiàn)與AsB 的分離。

本實(shí)驗(yàn)采用Dionex IonPac AS 19陰離子色譜柱，以20 mmol/L （NH4）2CO3 作流動相，對流動相的pH 值和流速進(jìn)行了優(yōu)化。

不同pH值條件下，5 種砷形態(tài)的保留時(shí)間如圖1 所示。pH 值的變化對AsB、DMA 和As的保留時(shí)間影響較小，但可使MMA 和As的保留時(shí)間明顯縮短。這是由于調(diào)pH 值時(shí)，氨水的含量的增加改變了流動相的陰離子強(qiáng)度，增強(qiáng)了流動相的洗脫能力。從減少測樣時(shí)間和避免對儀器的損害角度考慮，pH=9.7 為宜。

考察了1.0， 1.2和1.5 mL/min流速下的分離效果，結(jié)果表明，當(dāng)流速為1.0 和1.2 mL/min 時(shí)，5種不同砷形態(tài)能夠完全分離； 而流速為1.2 mL/min 時(shí)，測定樣品用時(shí)較短。1.5 mL/min 流速下，DMA 和As不能達(dá)到基線分離。

綜上所述， 選用20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7），流速為1.2 mL/min，柱溫為室溫，進(jìn)樣體積為25 μL的條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 離子強(qiáng)度和ArCl+的干擾

樣品中存在的其它離子會影響流動相的離子強(qiáng)度，從而也會影響砷形態(tài)在色譜柱里的分離；并且35Cl 在等離子體中會與40Ar 形成40Ar35Cl+ 多原子離子干擾75As 的測定。配制不同濃度NaCl 來考察40Ar35Cl 和離子強(qiáng)度對分離效果的影響。

分別配制了NaCl濃度為50， 150， 300， 600 和900 mg/L的5 種砷形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/L），測試結(jié)果表明，在此分離條件下，NaCl 濃度對5 種砷化合物的出峰時(shí)間幾乎無影響。但濃度大于600 mg/L 后，在5.58 min 出現(xiàn)了1個(gè)干擾峰，與35Cl+出峰時(shí)間一致，因此可以確定為75Ar35Cl+干擾峰，由于此峰不干擾其它砷形態(tài)的測定，所以在此分離條件下40Ar35Cl+ 對測定結(jié)果沒有干擾。圖2為75As 和35Cl 的色譜圖。

3.3 砷形態(tài)之間轉(zhuǎn)化考察

在對肝腎樣品形態(tài)分析過程中，發(fā)現(xiàn)提取液放置時(shí)間過長會發(fā)生形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，因此設(shè)計(jì)了砷形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。考慮到水基質(zhì)簡單，As容易被氧化，而提取液中往往含有還原性有機(jī)質(zhì)，因此，進(jìn)一步用提取液配制成100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入0， 2%， 5%， 10%和15%的H2O2，60 ℃加熱1 h，上機(jī)測定。結(jié)果表明，加入2% 及更高濃度的H2O2后，As被完全氧化為As。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中加入5% H2O2，氧化后的色譜圖如圖3 所示。在此氧化條件下，AsB， DMA 和MMA 的回收率分別為98%， 92%和95%。說明AsB， DMA 和MMA 在此氧化條件下比較穩(wěn)定，不易發(fā)生轉(zhuǎn)化。

3.4 前處理方法的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)＼[19～21]報(bào)道，目前砷形態(tài)分析的主要前處理方法為水、水 乙酸（19∶1，V/V）、甲醇 水（1∶1，V/V） 3 種體系。水作為提取劑主要用于大米等基質(zhì)相對簡單的樣品的處理，對脂肪含量較高的樣品，提取效率較低。甲醇 水作提取劑可保持各化合物形態(tài)、避免形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化。有機(jī)砷提取效率較高；但甲醇含量過高會降低無機(jī)砷的提取效率。由于高濃度的甲醇會影響砷測定時(shí)的靈敏度，特別是采用HPLC ICP MS時(shí)碳在錐孔處易富集，影響測定結(jié)果。一般需采用旋轉(zhuǎn)蒸干或氮吹方法去除甲醇，稀釋后上機(jī)測定；前處理方法較繁瑣，回收率偏低。而采用水 乙酸（19∶1，V/V） 提取時(shí)， 回收率均在80%～120% 之間，前處理過程簡單。經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，本方法選用水 乙酸（19∶1，V/V）作為砷形態(tài)的提取試劑。

3.5 方法的線性范圍及檢出限

分別配制了1.0， 5.0， 10， 25， 50， 100， 200和300 μg/L的5 種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)系列。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析，1～300 μg/L 范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2>0.999，結(jié)果如表1 所示。采用逐級稀釋法，在0.3 μg/L時(shí)，AsB， DMA 和As的信噪比（S/N） 大于3；在0.5 μg/L 時(shí)，MMA、As的信噪比（S/N） 大于3。因此， 確定AsB，DMA 和As的檢出限為0.3 μg/L，MMA 和As的檢出限為0.5 μg/L。

3.6 方法的精密度及加標(biāo)回收率

由于未發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在5種砷形態(tài)化合物的樣品，因此在雄黃染毒樣品中分別加入3種質(zhì)量濃度水平的5 種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成6 個(gè)模擬樣品，進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。5 種砷形態(tài)化合物的加標(biāo)回收率在83.8%～111.7% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<5%。

4 結(jié) 論

建立的HPLC ICP MS 方法適用于雄黃代謝后大鼠臟器中砷形態(tài)分析；雄黃代謝后大鼠肝臟中砷形態(tài)主要以DMA 形式存在，存在少量的As和未知物2；腎臟中的砷形態(tài)主要以DMA ，MMA，As、未知物1、未知物2 和未知物3 形式存在。

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