不同波長變化HPLC法同時測定護肝片中主要成分含量分析

李 巖，李本淳，張成穎，王 彤

（1.白城市食品藥品檢驗所，吉林 白城 137000；2.四平市食品藥品檢驗所，吉林 四平 136000；3.大連市婦女兒童醫(yī)療中心，遼寧 大連 116037；4.吉林省白城市實驗高級中學，吉林 白城 137000）

在慢性肝炎、早期肝硬化治療對策中，護肝片因所具健脾消食、疏肝解郁功用以及降低轉氨酶功效而為主選中藥方制劑[1]。護肝片組方為板藍根313 g、柴胡313 g、豬膽粉20 g、茵陳313 g、五味子168 g、綠豆168 g，但目前《中國藥典》2015年版僅限五味子醇甲含量測定，對復方質量難以做出全面客觀評價[2]。文獻報道在護肝片質控方面，護肝片高效液相色譜分析法（HPLC）建立及多成分含量測定為之提供了新的思路[3]。本文采用雙波長HPLC法開展護肝片主要成分定量研究，為進一步提高護肝片的質量標準，保證質量可控。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀、HH-2型恒溫水浴鍋 、CPA 225D精密電子分析天平、HS2060超聲波清洗器、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵。

護肝片：屬糖衣片制劑，片心凈重0.35 g；對照品：統(tǒng)一自中國食品藥品檢定研究院購進，依次取純度為94.9%、96.8%、99.9%、99.5%、99.0%的牡荊苷（批號111687-201704）、綠原酸（批號110753-201817）、五味子醇甲（批號110857-201714）、五味子甲素（批號110764-201714）以及五味子乙素（批號110765-201512）；購Fisher公司乙腈為色譜純，取磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液

依次對上述對照品精準稱取，加甲醇溶解，制成每mL含牡荊苷、綠原酸、五味子醇甲、五味子甲素以及五味子乙素各0.04、0.04、0.13、0.038、0.04 mg混合溶液，于冰箱內冷藏備用。

2.1.2 供試品溶液

對護肝片予以適量稱取，研磨成細粉狀，對其進行精密稱定0.35 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理（功率60 W，頻率40 kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

研究所用為ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（20～30 min為45%～85%A，11～20 min為35%～45%A，10～11 min為5～35%A，0～10 min，5%A）；流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長取兩種，即0～20 min340 nm和20.01～40 min254 nm，進樣量20 μL。

2.3 線性關系考察

精密量取對照品溶液，加50%甲醇，經(jīng)1倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀釋，自所得系列濃度溶液中各取20 μL進樣，展開峰面積測定。結果顯示各自濃度范圍內5種成分線性關系良好，γ≧0.9999。

2.3 精密度試驗

按照上述色譜條件對精密量取供試品溶液連續(xù)進樣6次，測定五種成分峰面積RSD均＜3%，證實儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液放置于室溫下，0、6、12、18、24 h進樣分析，所測定各成分峰面積RSD＜3%，表明供試品待測成分在24 h內可保持良好穩(wěn)定性。

2.5 重復性試驗

以同樣方法平行備份同一批次供試品溶液，按照上述色譜條件分析，護肝片各成分峰面積RSD＜3%，證實方法重復性良好。

2.6 樣品含量測定結果

按照供試品溶液制備方法對研究所取不同批號護肝片進行制備，并經(jīng)上述色譜條件開展進樣測定，對5種成分含量予以外標法計算，結果見表1。

表1 護肝片中5種含量測定結果（mg/片，n=3）

3 討 論

對于提取溶劑的選擇，主要考慮到綠原酸、五味子醇甲等均于甲醇溶解，在對不同濃度的甲醇溶液（50%、75%、100%）實施試驗后，證實50%甲醇提取情況下，各成分所獲峰形均表現(xiàn)良好，且綠原酸峰形為最高。而在對溶劑用量、超聲時間對結果的影響考察中，發(fā)現(xiàn)20mL、30min為最佳值。

甲醇作為流動相于試驗中獲得良好峰形，并對0.05%、0.1%、0.3%及0.2%磷酸濃度予以比較，結果0.05%時峰形最差，0.2%峰形最好。此外，在pH≧1偏酸性環(huán)境下，ZORBAX SB-C18柱有較好耐受性，試驗用0.2%磷酸水溶液pH值在1.95左右，因此該色譜柱完全可滿足要求。在對柱溫的選擇過程中，考察了25、30及35 ℃ 色譜圖，色譜峰保留時間伴隨溫度上升而呈縮短顯示，30℃時峰形良好，故確定此溫度。對混合對照品應用PDA檢測器進行190～400 nm波長掃描，顯示在0～20 min檢測波長為340nm、20.01～40 min254 nm為最佳。

4 小 結

護肝片對肝細胞保護及轉氨酶降低具顯著作用，機制為通過對受損肝細胞SOD、GSH活性的增強，使MDA產(chǎn)生受到抑制，進而保護細胞器與酶結構功能，提高肝細胞抗氧化能力[4-5]。但藥效物質基礎尚不確定且機制不清楚，對質量的控制標準較為單一，故對臨床療效的提高存在一定局限。為健全護肝片質量控制標準，本文對其主要成分含量予以不同波長HPLC法測定，結果顯示不同批次護肝片中所含五味子醇甲經(jīng)測定均在0.28 mg以上，符合《中國藥典》所規(guī)定，但不同批次間各成分含量有一定程度不同，提示不同批號所選用中藥原材料質量或有差異。經(jīng)系統(tǒng)且全面的數(shù)據(jù)評價、分析及處理方法，可為后續(xù)護肝片的質控提供可行性參考與理論依據(jù)，且方法簡便、準確，同時有利于生產(chǎn)廠家更為高效和合理的對藥品質量把控。