Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化舒肝顆粒(廣西方)的水提工藝*

呂 瀟，陳思宏，梁 芳，黃艷紅，尹善儀，汪 靜，譚德慧

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530222)

舒肝顆粒(廣西方)收載于廣西藥品標(biāo)準(zhǔn)(一九八四年版)，原名為舒肝沖劑，標(biāo)準(zhǔn)編號為桂Q/WS-1-380-84，由茵陳、蒲公英、白茅根等9味藥材組成，具有疏肝開郁、清熱解毒、化濕健脾之功效，用于治療黃疸型及非黃疸型急性肝炎[1]，對慢性肝炎、遷延性肝炎亦有一定療效。方中茵陳、蒲公英、白茅根均具有保肝作用[2-5]，所含的有效成分綠原酸是方中酚酸類化合物的代表成分，對肝損害起保護作用[6]，還具有抗菌、抗癌、保護心血管系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、細胞保護和保肝等藥理作用[7-8]，故本研究以綠原酸含量與浸膏得率的綜合評分為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選舒肝顆粒(廣西方)的水提工藝，為后續(xù)舒肝顆粒(廣西方)的制劑生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀 器

Agilent1200(DAD/ELSD)高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Agilent1200色譜工作站，美國安捷倫科技有限公司；XS105DU電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；比朗超聲波清洗機，上海比朗儀器有限公司。

1.2 對照品與試劑

綠原酸對照品(批號：110753-201817，供含量測定用，含量以96.8%計)購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為Fisher公司的色譜純，液相用水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥 材

夏枯草(批號：18102001)、茵陳(批號：18022701)、蒲公英(批號：18082202)、甘草(批號：18102801)、蒼術(shù)(批號：18092504)、北柴胡(批號：18102202)、虎杖(批號：18051501)均購自廣西寶正藥業(yè)有限公司，馬蘭草、白茅根購自廣西玉林藥市，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院苑敏副教授鑒定，馬蘭草為菊科植物馬蘭頭Kalimeris indica(L.)的干燥全草，白茅根為禾本科植物白茅Imperata cylindrical Beauv.var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

色譜柱為CAPCELL PAK C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(10∶90)，檢測波長為327 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30 ℃。分別取供試品溶液和對照品溶液進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液與對照品溶液HPLC色譜圖中相應(yīng)色譜峰的保留時間一致，各相鄰峰間分離度均大于1.5，理論板數(shù)按綠原酸峰計算不低于5000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 供試品溶液的制備

按照處方量的1/10比例稱取藥材45 g，加入18倍量水，浸泡40 min后，煎煮兩次，每次1.3 h，濾過，合并濾液，濾液濃縮至250 mL。精密量取濃縮液25 mL，置50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品5.10 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.1.3”項下的對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，進樣10 μL，記錄色譜圖。以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到綠原酸回歸方程為：Y=16.857X-3.44，(r=0.9999)。結(jié)果表明綠原酸在10.2～61.2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度實驗

精密量取“2.1.4”項下的對照品溶液5#，連續(xù)進樣6次，測定其峰面積，結(jié)果綠原酸峰面積平均值為868.1，RSD=0.16%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.1.2”項下的供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進樣，測定其峰面積，結(jié)果峰面積平均值為813.8，RSD=0.73%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性實驗

按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6份，進樣測定。結(jié)果供試品溶液中綠原酸含量平均值為0.5357 mg/g，RSD=1.42%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品溶液6份，分別精密加入綠原酸對照品溶液(1.4540 mg/mL)0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，計算平均回收率和RSD，結(jié)果均符合要求，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2 浸泡時間考察

按照處方量的1/10比例稱取藥材45 g，加入18倍量水，分別浸泡10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，濾出水分，稱定藥材吸水后重量，計算藥材吸水率。計算公式為：

藥材吸水率=(藥材吸水后重量-取樣量)/取樣量×100%

結(jié)果顯示，藥材在40 min前吸水率呈上升趨勢，40 min后吸水率改變不大，說明藥材在浸泡40 min后吸水基本達到飽和，故浸泡時間定為40 min。

2.3 浸膏得率的測定

精密量取水提濃縮液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算浸膏得率。計算公式為：

浸膏得率=干膏重量×10/藥材重量×100%

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化水提工藝

2.4.1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

采用Design-Expert8.0.6軟件，選擇Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，以加水倍數(shù)(A，倍)、提取時間(B，h)、提取次數(shù)(C，次)為考察因素，以綜合評分(R)為響應(yīng)值，設(shè)計進行3因素3水平的響應(yīng)面法試驗，Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果

2.4.2 模型擬合及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表3的數(shù)據(jù)進行回歸分析，以綜合評分(R)為響應(yīng)值對加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)進行多元二次回歸擬合，得回歸方程為：

Y=-1078.58275+114.53800A+88.10150B+90.80425C+1.15500AB-1.45500AC-4.18500BC-3.17081A2-37.38300B2-14.08075C2。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知， B、A2、B2、C2均具有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)=40.29，模型項P<0.0001，模型高度顯著，失擬項F=4.78，P=0.0823，表明模型失擬項無統(tǒng)計學(xué)意義，模型擬合度高，實驗誤差小。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9811，證明該模型擬合度很好，可用該模型對試驗結(jié)果進行測定。

2.4.3 響應(yīng)面分析

圖2 各因素對綜合評分影響的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖

根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，結(jié)果見圖2。通過響應(yīng)面曲線的變化情況及等高線的稀疏程度可直觀反映各因素對總含量的影響，響應(yīng)曲面較陡說明因素間的交互作用顯著，等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖2所知，各因素對綜合評分的影響交互項強弱順序為：AC>BC>AB。

2.4.4 驗證實驗

表4 驗證實驗結(jié)果

采用Design-Expert8.0.6軟件預(yù)測最佳水提工藝參數(shù)：加水量17.82倍，提取時間1.3 h，提取次數(shù)2.11次?？紤]到實施工藝參數(shù)的實際可操作性，將最佳水提工藝條件修正為：加水量18倍，提取時間1.3 h，提取次數(shù)2次。為檢驗修正后工藝參數(shù)的合理性，在此條件下平行進行3次驗證試驗，結(jié)果見表4，測得綜合評分平均值為99.33%(RSD=0.48%，n=3)，與模型預(yù)測值96.46%的相對平均偏差為1.47%，表明該水提工藝條件穩(wěn)定、可靠，同時也說明建立的回歸模型合理。

3 結(jié) 論

Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法是在科學(xué)研究中經(jīng)常用到的一種實驗條件優(yōu)化方法，適用于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問題，它彌補了正交設(shè)計和均勻設(shè)計等線性模型精密度低的不足，能更好的揭示自變量和非自變量之間的關(guān)系。響應(yīng)面法相對于正交試驗法，可以連續(xù)地對試驗的各個水平進行分析，所得結(jié)果更加合理、可靠，還可以預(yù)測未知成分，適用于多種因素存在是產(chǎn)生共同影響的試驗，從而選出最佳條件和方案[9]。本研究采用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化舒肝顆粒(廣西方)的水提工藝，通過Design-Expert8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到最佳水提工藝：加水量18倍，提取時間1.3 h，提取次數(shù)2次。經(jīng)驗證，測得綜合評分平均值為99.33%(RSD=0.48%，n=3)，實測值與預(yù)測值的相對平均偏差為1.47%，表明該水提工藝條件穩(wěn)定、簡便易行，結(jié)果可靠，可用于后續(xù)舒肝顆粒(廣西方)制劑生產(chǎn)的水提工藝提取。