柳蒿化學(xué)成分的含量測定及肝損傷保護作用的研究

楊佳明，孟憲蘭，王丹萍，秦汝蘭*

（1.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，通化134002；2.通化盛吉信生物科技股份有限公司，通化134002；3.通化市園藝研究所，通化134002）

柳蒿Artemisia integrifolia Linn.為菊科蒿屬多年生草本植物，又名萎蒿、白蒿、柳葉蒿、水蒿等[1]。廣泛分布于我國東北等地，柳蒿芽質(zhì)嫩，氣味獨特，幼嫩的地上部分可炒食或作湯菜，從北方達翰爾族人民開始，將其作為野菜廣泛食用。柳蒿中含有豐富的氨基酸、維生素和多糖，營養(yǎng)價值十分豐富[2～4]?；瘜W(xué)成分研究表明，柳蒿芽中含有豐富的黃酮類成分，具有抗自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等作用[5～7]。

肝臟是機體內(nèi)以代謝功能為主的重要器官，具有解毒、調(diào)節(jié)糖、脂代謝平衡的作用[8]。近年來，隨著人們生活水平的提高以及生活環(huán)境的變化，病毒性肝炎、異源性肝損傷、肝纖維化及自身免疫性肝炎等肝臟疾病成為人類最常見的疾病之一，嚴重威脅著人類健康[9]?；瘜W(xué)性肝損傷是由化學(xué)性肝毒性物質(zhì)所造成的肝損傷，這些化學(xué)物質(zhì)和藥物包括酒精、四氯化碳、半乳糖胺、撲熱息痛、抗結(jié)核藥物等均能造成肝細胞損傷[10]。四氯化碳作為經(jīng)典的肝損傷模型，可靠性強、重復(fù)性好，能夠準確反映肝細胞的功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化，目前常作為建立肝損傷的模型試劑[11]。民間常用柳蒿全草治療感冒發(fā)燒、肝炎或肝硬化腹水等癥狀，具有很好的療效。國內(nèi)很多學(xué)者通過DPPH自由基清除實驗，OH-及O2-清除實驗，同時結(jié)合體內(nèi)實驗測定小鼠或大鼠血清、肝臟中SOD、GSH-Px及MDA等含量，揭示了柳蒿芽具有明顯的抗氧化作用[12～13]。

目前，柳蒿藥材的研究多集中于化學(xué)成分的報道，尚未見其質(zhì)量控制及保肝作用的研究。因此，筆者采用高效液相色譜法建立同時測定柳蒿中綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素四種含量的方法，并采用四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型，探討柳蒿對小鼠肝組織的保護作用，為柳蒿芽資源的進一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

柳蒿藥材采于通化師范學(xué)院周邊，經(jīng)通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院于俊林教授鑒定為柳蒿 （Artemisia integrifolia Linn.）。

昆明種小鼠，清潔級，雄性，體重18～22 g，購于長春小鼠養(yǎng)殖基地。

安捷倫1260高效液相色譜儀 （美國安捷倫有限公司）；BS124S精密電子天平 （泰斯特儀器有限公司）；DNM-9602酶標儀（美國 BioRad公司）；LR-16A低溫高速離心機（北京雷勃爾公司）。

綠原酸對照品（批號：110753-200413）、蘆丁對照品 （批號：1097-060918）、槲皮素對照品 （批號：100081-20097）均購于中國藥品生物制品檢定所，木犀草苷對照品（批號：MUST-13050601，）購于成都曼斯特生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒、總抗氧化能力 （T-AOC）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、蛋白定量測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測試盒均購自南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙酯滴丸（浙江萬邦藥業(yè)有限公司）。乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，乙醇為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：0.2%-磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，15% →20%B；5 ～35 min，20% →30%B；35 ～50 min，30%→48%B；50～60 min，48%→70%B）； 流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的配制

混合對照品溶液的制備：取綠原酸，蘆丁，木犀草苷，槲皮素對照品各適量，精密稱定，置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成上述各待測成分質(zhì)量濃度分別為 1.624 3、0.411 3、0.130 5、0.043 6 mg·mL-1的混合對照品貯備液。

供試品溶液的制備：取柳蒿樣品粉末約1g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 80%乙醇溶液，稱定其重量，超聲處理30 min，放置冷卻，用80%乙醇補足失去的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 柳蒿提取液的制備

柳蒿干燥粉末30g置于燒杯中，按照“2.2”項下方法制備樣品溶液，濃縮備用。

2.4 動物分組及處理

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機分為6組，每組10只，即空白組、模型組、陽性藥組（聯(lián)苯雙酯滴丸）、柳蒿提取液高劑量組、柳蒿提取液中劑量組、柳蒿提取液低劑量組。空白組與模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d，末次給藥后1 h，除空白組外，其余各組腹腔注射0.1%的CCl4橄欖油溶液0.2 mL/10 g，禁食，不禁水[14]。

2.5 生化指標檢測

造模16 h后，戊巴比妥鈉麻醉后，采用眼球采血法取血，離心，上清液備用。采血后放血處死，取肝臟組織，制成10%的肝組織勻漿液，離心，上清液備用。按照試劑盒說明書方法分別測定血清中AST、ALT活力，肝組織中MDA含量及GSH-Px、T-AOC、T-SOD水平。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線的繪制

精密量取 “2.2”項下混合對照品貯備液0.125，0.25，0.5，1，2 mL，分別置于 2 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，以峰面積為縱坐標，質(zhì)量為橫坐標，進行線性回歸，線性相關(guān)系數(shù)在0.999 8～0.999 9，線性關(guān)系良好，標準品的液相色譜圖見圖1，各標準品的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 回歸方程與線性范圍

圖1 混合對照品液相色譜圖

3.2 精密度實驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣測定6次，計算峰面積的相對標準偏差表示儀器的精密度。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素峰面積的RSD 分別為 1.89%，0.81%，0.93%，1.06%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性實驗

取 “2.2”項下供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 小時后進行分析，計算峰面積的相對標準偏差表示樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素峰面積的RSD分別為1.26%，1.33%，0.88%，1.47%，表明供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 重復(fù)性實驗

取樣品適量，按“2.2”項下方法制成6份供試品溶液進樣分析，計算峰面積的相對標準偏差表示方法的重復(fù)性。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素峰面積的RSD分別為1.51%，1.06%，1.59%，1.04%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的柳蒿藥材粉末1 g，5份，加入一定量的綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素對照品混合液，制成供試品溶液進樣分析?；厥章蕦嶒灲Y(jié)果見表2，表明實驗方法的準確度良好。

表2 加樣回收率實驗（n=5）

3.6 樣品含量測定

取三批樣品各適量，制備供試品溶液，進行分析，記錄各對照品峰面積并計算含量，結(jié)果見表3，液相色譜圖見圖2。

表3 樣品含量測定結(jié)果

圖2 柳蒿樣品液相色譜圖

3.7 柳蒿提取液對四氯化碳致肝損傷小鼠血清AST、ALT影響

由表4可以看出，與空白組相比，模型組小鼠血清 AST、ALT 水平顯著升高（P＜0.01），表明小鼠急性肝損傷模型制備成功。與模型組比較，柳蒿提取液高、中劑量組小鼠血清AST活性明顯降低 （P＜0.05；P＜0.01），且存在濃度依賴性。柳蒿提取液高劑量組血清ALT活性明顯降低（P＜0.05），實驗結(jié)果表明柳蒿提取液對四氯化碳致小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用。

表4 柳蒿提取液對CCl4致肝損傷小鼠血清中AST和 ALT 活力的影響（，n=10）

表4 柳蒿提取液對CCl4致肝損傷小鼠血清中AST和 ALT 活力的影響（，n=10）

*表示與模型組比較，P＜0.05；**表示與模型組比較，P＜0.01；## 表示與空白組比較，P＜0.01

組別 劑量（mg/kg） AST(U/L) ALT(U/L)空白組 - 19.020±3.183 11.143±1.227模型組 - 48.148±2.844## 41.370±1.605##聯(lián)苯雙酯組 100 39.773±1.675** 35.855±2.785**高劑量組 200 40.963±3.379** 37.553±3.357*中劑量組 100 42.228±4.195* 39.225±1.603低劑量組 50 44.998±4.065 40.100±1.812

3.8 柳蒿提取液對四氯化碳致肝損傷小鼠肝組織中T-SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA 的影響

由表5數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠肝組織中T-SOD、T-AOC、GSH-Px水平顯著降低，而肝組織中MDA含量顯著增加（P＜0.01），表明小鼠急性肝損傷造模成功。與模型組相比，柳蒿提取液高劑量組小鼠肝組織中T-SOD水平顯著增加 （P＜0.01），柳蒿提取液高劑量組小鼠肝組織中T-AOC水平顯著增加（P＜0.05），柳蒿提取液高劑量組、中劑量組小鼠肝組織中 GSH-Px水平顯著增加（P＜0.05；P＜0.01），柳蒿提取液高劑量組、中劑量組小鼠肝組織中MDA水平顯著降低（P＜0.05；P＜0.01），實驗結(jié)果表明柳蒿提取液對四氯化碳致小鼠肝損傷具有一定的保護作用。

表5 柳蒿提取液對CCl4致肝損傷小鼠肝組織中T-SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA的影響(，n=10）

表5 柳蒿提取液對CCl4致肝損傷小鼠肝組織中T-SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA的影響(，n=10）

* 表示與模型組比較（P＜0.05）；## 表示與空白組比較（P＜0.01）；** 表示與模型組比較（P＜0.01）

組別 劑量（mg/kg） T-SOD(U/mg) T-AOC(U/mg) GSH-Px(μmol/g) MDA(μmol/g)空白組 - 389.377±4.021 3.068±0.122 165.102±2.667 5.498±0.224模型組 - 254.514±2.096## 1.366±0.070## 114.410±1.008## 9.209±0.152##聯(lián)苯雙酯組 100 267.389±8.131** 1.683±0.153** 118.030±1.542** 6.065±0.111**高劑量組 200 265.151±6.788** 1.583±0.153* 117.990±1.084** 8.619±0.102**中劑量組 100 261.775±2.239 1.508±0.050 117.237±0.703* 8.821±0.122*低劑量組 50 258.177±3.860 1.452±0.047 114.659±0.857 9.061±0.362

4 討論

課題組考察了超聲提取及加熱回流兩種提取方法，同時分別考察了不同提取溶劑（甲醇、80%乙醇、50%甲醇、50%乙醇）對提取效果的影響，以色譜峰個數(shù)及含量為指標，最終確定80%乙醇溶液超聲提取30 min制備供試品溶液。此外，考察了Zorbax SB-C18、Kromasil C18及Inertsil ODS-3色譜柱對樣品分離結(jié)果，表明Zorbax SB-C18和Kromasil C18色譜柱分離效果較差，色譜基線漂移嚴重，而Inertsil ODS-3色譜柱各成分分離效果好，基線平穩(wěn)。因此，色譜柱選擇Inertsil ODS-3。

CCl4肝損傷模型常用來研究保肝、護肝藥物的藥效及其作用機制。對于CCl4引起的肝損傷機制存在多種意見，但都一致公認，自由基的形成及引發(fā)的鏈式過氧化反應(yīng)，能夠造成肝細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞與功能的完整性，使細胞質(zhì)內(nèi)ALT、AST等酶溢出[15]。目前，在抗肝臟疾病的藥物研究中，各種黃酮類化合物對化學(xué)性肝損傷、藥物性肝損傷、酒精性肝損傷等均有不同程度的保護作用。這種保護作用與黃酮化合物清除自由基、抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等有著密切的關(guān)系。

血清中ALT和AST活性變化，常用來反映CCl4造成急性肝損傷的程度。AST活性增高，提示肝細胞線粒體受損傷；ALT活性增高，提示肝細胞膜破壞和細胞膜通透性增加[16]。本實驗結(jié)果顯示，柳蒿總黃酮高劑量組和中劑量組小鼠肝細胞損傷程度明顯減少，血清ALT、AST水平顯著低于CCl4模型損傷組，且具有劑量依賴性，提示柳蒿總黃酮具有保護肝細胞膜，對抗肝損傷的作用。

體內(nèi)活性氧的過度激活、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的引發(fā)和持續(xù)是肝細胞損傷的重要病理基礎(chǔ)之一[17]。MDA常用作脂質(zhì)過氧化的指標，可嚴重破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞腫脹、壞死，其含量反映了組織過氧化的損傷程度[18]；SOD作為抗氧化酶，能清除體內(nèi)自由基、抑制自由基反應(yīng)，是抗氧化的第一道防線[19]；GSH-Px是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，能特異性地清除機體活性氧，減輕和阻止活性氧的過氧化作用，是機體重要的抗氧化劑[20]。本實驗結(jié)果表明，模型組小鼠肝臟SOD抗氧化酶活性降低，脂質(zhì)過氧化水平升高，表明急性肝損傷小鼠肝細胞存在一定程度的損傷和氧化應(yīng)激。柳蒿總黃酮可改善肝臟氧化應(yīng)激狀況，能夠抑制肝組織中MDA升高而減輕肝臟損傷程度。柳蒿總黃酮給藥組小鼠肝組織SOD、GSH-Px、T-AOC活性顯著提高，表明其具有增強肝臟抗氧化能力的作用。

綜上所述，本方法操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于柳蒿藥材中綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素含量的同時測定。此外，柳蒿具有保肝活性，其機理可能是通過抑制自由基脂質(zhì)過氧化作用，保護細胞膜的完整性，降低血清ALT和AST兩種酶的活性而發(fā)揮保肝作用。本研究為柳蒿資源的充分開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù).