桔梗的組織培養(yǎng)及抗鹽堿性研究

王士杰,李晨光,何 穎,馮淑月

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院·吉林吉林·132109)

桔梗是常用的大宗中藥材,主產(chǎn)于我國東北、華北、華東、華中等地區(qū)，在國內(nèi)各個地區(qū)也均有不同面積種植[1,2]。其根入藥,為藥食兩用品種，具有很好功效營養(yǎng)價值及觀賞性的。桔梗的藥用價值比較高，桔梗飲片可用于咳嗽痰多，胸悶不暢。植物組織培養(yǎng)技術(shù)不斷完善,受到植物培育研究的廣泛關(guān)注,并得到迅速發(fā)。無土栽培技術(shù)研究在我國起步還比較晚,香石竹(Dianthus caryophyllus)、唐菖蒲 (Gladiolus gandavensis)、菊花等花卉無土栽培試驗的成功為我國無土栽培打下了堅實的理論基礎(chǔ)[3]。以桔梗種子做為試驗材料，一定條件下催芽，再以白花桔梗和紫花桔梗幼芽為材料，建立了愈傷培養(yǎng)、誘導(dǎo)生芽生根等一整套完整的抗性培養(yǎng)植株再生模型，培養(yǎng)具有抗鹽性基因的桔梗苗木。該研究為豐富桔梗品種和快速培育桔梗提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗材料

白花桔梗和紫花桔梗種子實驗材料在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院左家校區(qū)桔梗種植基地采集。

1.2 試驗儀器

752紫外可見分光光度計（上海奧普勒儀器有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）、超凈工作臺SW-CJ-2FB（蘇州凈化有限公司）等。

2 試驗方法

2.1 培養(yǎng)基制備

MS、N6培養(yǎng)基配制。

2.2 幼芽的培育

選擇色澤飽滿的白花桔梗種子和紫花桔梗種子，放在溫水中浸泡過夜后撈出，放在燒杯中，燒杯中放上濕的棉花為種子提供水分，將燒杯放在（25±1）℃的恒溫箱中，每天用恒溫水沖洗數(shù)次通風(fēng)，進(jìn)行催芽處理，半個月左右，等到種子長出5cm左右幼嫩的芽進(jìn)行備用。

2.3 幼芽的接種

將白花，紫花桔梗幼嫩的芽切塊（約2～5cm），用自來水反復(fù)清洗備好的幼芽20min，用洗衣粉水消毒15min，經(jīng)消毒的幼芽，放在超凈工作臺中，吸干表面水分用濾紙，將白花、紫花桔梗幼芽材料分別接中于不同的培養(yǎng)基中，不同的培養(yǎng)基中接6瓶，每瓶5株，在溫度 （25±1）℃的溫度下培養(yǎng)，光照強度為2500～3000lx,光照時間長為12h的條件下培養(yǎng)15天左右，對其發(fā)芽數(shù)進(jìn)行記錄，以下步驟組培條件同此條件一致。

2.4 誘導(dǎo)愈傷

以接種處理中最佳的培養(yǎng)條件為基本培養(yǎng)基，在不同濃度IBA和NAA的條件下，分別對白花桔梗和紫花桔梗進(jìn)行誘導(dǎo)，得出適于愈傷組織分化明顯的實驗組。得出誘導(dǎo)效果好的一組處理。待生長穩(wěn)定后接種到含有不同鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行抗鹽篩選。

2.5 生根培養(yǎng)

以誘導(dǎo)培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)條件為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)30天左右記錄生根情況，對白花桔梗和紫花桔梗培養(yǎng)基中的生根數(shù)、生長勢等進(jìn)行測量。

2.6 移栽培養(yǎng)

觀察白花桔梗和紫花桔梗組培苗生根情況對其組培苗進(jìn)行篩選，通過觀察白花、紫花桔梗苗的生長勢、葉片顏色、苗的長勢進(jìn)行篩選，篩選出各項物理指標(biāo)較高的白花桔梗和紫花桔梗苗木。把白花桔梗和紫花桔梗苗木從培養(yǎng)瓶中取出后，將根部多余培養(yǎng)基用清水清洗干凈防止雜菌和蚊蟲滋生。然后將白花桔梗和紫花桔梗組培苗木移栽到(草炭:蛭石 =1:1)育苗盤中，土壤整平，以株距6cm×6cm進(jìn)行栽培。栽完后放在室內(nèi)，放置在防曝曬、遮陰、保暖的溫室內(nèi)，并保持溫室內(nèi)濕度適當(dāng)。晚間溫度過低適當(dāng)保溫，控制溫度在（25±1）℃，保持移栽溫室的濕度在 80%～90%范圍內(nèi)?；|(zhì)保持濕潤無積水，每周噴一次除菌劑，注意通風(fēng)。

2.7 脯氨酸含量的檢測

稱取白花桔梗和紫花桔梗材料各1g，剪碎，用移液槍準(zhǔn)確吸取5%TCA2mL和微量石英砂，研磨至均勻狀態(tài)，繼續(xù)加溶液進(jìn)一步研磨，將研磨均勻的桔梗材料置于離心管離心，取離心后上清液做為樣品提取液。用移液槍準(zhǔn)確吸取離心的桔梗材料上清液2mL(以蒸餾水為對照品)，用移液槍準(zhǔn)確吸取配置好的TBA溶液2mL，搖至均勻。將試管放入沸水浴中煮沸后，取出冷卻，置于離心機中高速離心15min，轉(zhuǎn)速3000r/min，取上清液加入比色皿中于波長為532nm、600nm和450nm處測其吸光值，通過計算得出脯氨酸檢測值。

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)基的篩選

由表1可知，不同桔梗在同種培養(yǎng)基上的生長情況大致相同，而同種桔梗在不同培養(yǎng)基上的生長情況差別很大，其中白花桔梗的發(fā)芽率為64%～82%，紫花桔梗的發(fā)芽率為47%～84%。培養(yǎng)在1/2MS培養(yǎng)基中的桔梗發(fā)育率最好，白花桔梗的發(fā)育率為82%，紫花桔梗的發(fā)芽率為84%，其生長狀況良好，培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基中的桔梗發(fā)芽率次之，分別為70%和71%,其生長狀況一般，其他培養(yǎng)基培養(yǎng)的桔梗發(fā)芽率均低于70%，生長狀況較差。所以，1/2MS培養(yǎng)基比較適合桔梗的培養(yǎng)，因此，以1/2MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基模型進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)。

表1 白花和紫花桔梗在不同培養(yǎng)基上的生長情況

3.2 不同生長激素對誘導(dǎo)愈傷率的影響

表2是正以最佳培養(yǎng)基1/2MS作為養(yǎng)基體系，加入生長激素NAA和6-BA，進(jìn)行愈傷組織的處理培養(yǎng)。由表可知，相同濃度的激素處理的誘導(dǎo)愈傷率總體表現(xiàn)為：紫花桔梗＞白花桔梗，說明紫花桔梗對NAA和6-BA激素更敏感；不同濃度的NAA和6-BA對桔梗誘導(dǎo)愈傷率的結(jié)果不同，其中白花桔梗的誘導(dǎo)愈傷率為60.00%～86.67%，紫花桔梗的誘導(dǎo)愈傷率66.67%～90.00%。 0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的桔梗誘導(dǎo)數(shù)較高，其中白花桔梗的誘導(dǎo)愈傷率達(dá)到86.67%，紫花桔梗的誘導(dǎo)愈傷率達(dá)到90.00%；0.2mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的紫花桔梗誘導(dǎo)數(shù)次之，誘導(dǎo)愈傷率達(dá)到80.00%，0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA濃度處理的桔梗誘導(dǎo)愈傷率普遍偏低，白花的誘導(dǎo)愈傷率低至60.00%，紫花的誘導(dǎo)愈傷率低至66.67%。

表3 不同的鹽在不同濃度下對桔梗成活率的影響

表2 培養(yǎng)基中不同濃度的NAA和6-BA對誘導(dǎo)愈傷率的影響

3.3 不同鹽濃度及種類對桔梗成活率的影響

在以1/2MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)體系中，0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA濃度的培養(yǎng)基中得到的桔梗苗木，愈傷組織接種到分別添加了0、2.5、5.0mg/L氯化鈉、硫酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉培養(yǎng)基中進(jìn)行鹽脅迫處理。由表2可知，白花桔梗和紫花桔梗的成活率隨著鹽濃度的不斷增加呈現(xiàn)顯著下降趨勢。在鹽濃度為0mg/L時，桔梗的成活率在 80.33%～83.33%之間，長勢良好；在鹽濃度為 2.5mg/L時，桔梗的成活率在 72%～76%之間，長勢一般；在鹽濃度為 5.0mg/L時，桔梗的成活率在61%～69%之間，長勢較差。

不同的鹽處理的培養(yǎng)基中桔梗的成活率不同，在濃度為2.5 mg/L的培養(yǎng)基中，桔梗的成活率表現(xiàn)為：氯化鈉＞碳酸鈉＞碳酸氫鈉＞硫酸鈉；在濃度為5 mg/L的培養(yǎng)基中，桔梗的成活率表現(xiàn)為：碳酸鈉＞碳酸氫鈉＞氯化鈉＞硫酸鈉。

不同鹽類脅迫對組培苗的成活率隨鹽濃度的增大而降低這一現(xiàn)象會因繼代次數(shù)的增加而減弱，待組培苗生長到一定的高度進(jìn)行移栽，移栽到(草炭:蛭石=1:1)育苗盤中，土壤整平，以株距6cm×6cm進(jìn)行栽培，就可以得到抗鹽性較高的組培苗。

3.4 鹽脅迫對桔梗中脯氨酸含量的影響

植物體內(nèi)脯氨酸的含量的大量積累是由于土壤中較高的鹽濃度所導(dǎo)致，游離的氨基酸在植物體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)滲透壓，維持細(xì)胞膨壓。表3是不同的鹽在不同濃度下對桔梗脯氨酸含量的影響，在鹽濃度為0mg/L時，白花桔梗中的脯氨酸含量在0.82～1.34mg/kg之間，紫花桔梗中的脯氨酸含量在0.89～1.19 mk/kg之間；在鹽濃度為2.5mg/L時，白花桔梗中的脯氨酸含量在4.55～6.22mg/kg之間，紫花桔梗中的脯氨酸含量在4.38～5.62mk/kg之間；在鹽濃度為5.0mg/L時，白花桔梗中的脯氨酸含量在9.43～10.32mg/kg之間，紫花桔梗中的脯氨酸含量在9.32～9.82 mk/kg之間。因此，隨著鹽濃度的增大，桔梗中的脯氨酸含量顯著增多，桔梗對環(huán)境中鹽的抵抗能力增強。

表4 不同鹽濃度處理的桔梗中的脯氨酸含量

試驗結(jié)果表明白花桔梗和紫花桔梗的最適培養(yǎng)基是1/2MS，最適的誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)基是1/2MS+0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA，誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)基中加入不同濃度的鹽進(jìn)行抗鹽篩選，這種抗鹽性具有一定程度的穩(wěn)定性，從而培養(yǎng)出能夠更好的適應(yīng)環(huán)境變化的桔梗品種。

鹽濃度對桔梗發(fā)育率和生長的影響一些學(xué)者持有不同的觀點，一般認(rèn)為在鹽成分誘導(dǎo)下，發(fā)芽的種子中可能存在一定的脅迫性的基因或特異的生理功能[4,5]，從而在環(huán)境中抵抗鹽脅迫，或者在鹽脅迫條件下抑制種子萌發(fā)，主要是由外界高滲透壓導(dǎo)致種子吸水不足而引起的發(fā)芽率較低[6]。張嬌[7]在氯化鈉模擬鹽脅迫對沙冬青種子萌發(fā)和幼苗生長的影響的研究中表明氯化鈉對種子的萌發(fā)和胚根生長均產(chǎn)生抑制作用；管清杰[8]在相關(guān)研究中也表明，植物在遭受干旱、高溫、高鹽的情況下細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)平衡會被破壞，從而影響植株的生長和發(fā)育。這與本文中的研究結(jié)果相一致。

植物在鹽脅迫條件下積累的主要滲透調(diào)節(jié)劑為脯氨酸，脯氨酸的含量是衡量植物抗逆性的主要生理指標(biāo)[9]。因為脯氨酸對水具有很強的親和力，是一種可溶性的氨基酸，所以可以平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓、保護(hù)植物細(xì)胞和酶含量。實驗表明，當(dāng)植物受到鹽堿脅迫時，細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)性酶活性也會有不同程度增加，植物體內(nèi)的脯氨酸為代表的滲透協(xié)調(diào)物質(zhì)開始大量產(chǎn)生[10]。張偉麗[11]等人的研究結(jié)果也表明，植物體內(nèi)脯氨酸含量隨不同鹽不同濃度的增加而增加,在一定程度下和鹽濃度成正相關(guān)。

4 結(jié)論

桔梗在不同培養(yǎng)基上的生長情況表明，桔梗的最適培養(yǎng)基是 1/2MS，最適的誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)基是1/2MS+0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA；在不同鹽濃度脅迫的條件下，培養(yǎng)基中的鹽濃度越高，桔梗的發(fā)芽率越低，生長狀況越差，但隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，桔梗的抗鹽能力增強；桔梗中脯氨酸的含量隨鹽濃度的增加而升高，也說明鹽的存在能夠影響桔梗中氨基酸的含量，從而適應(yīng)環(huán)境的改變。