王詩,王璐璐,趙丹丹,楊學(xué)山,韓舜愈,祝霞*
1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州, 730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室,甘肅 蘭州, 730070)
微生物菌群在葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物和生物酶,會直接影響酒體中揮發(fā)性香氣化合物的種類、含量和演變過程,決定著葡萄酒的風(fēng)格和典型性[1]。由酒酒球菌(Oenococcusoeni)誘發(fā)的蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation,MLF)是釀造高品質(zhì)干紅葡萄酒和部分高酸度白葡萄酒的必需工藝,可將酒體中粗糙、尖劣的L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為柔和、圓潤的L-乳酸,對改善口感、提升和修飾揮發(fā)性香氣成分具有積極作用[2-3]。同時,適應(yīng)了產(chǎn)區(qū)風(fēng)土的優(yōu)良本土O.oeni能夠與葡萄原料特性更加契合,在MLF過程中可以更加有效地呈現(xiàn)產(chǎn)區(qū)微生物風(fēng)土特色[4-7]。葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)達的國家如法國、意大利、加拿大、葡萄牙等均對本產(chǎn)區(qū)O.oeni進行了分離、篩選和發(fā)酵性能分析研究,獲得了釀酒適應(yīng)性和發(fā)酵特性優(yōu)良的菌株,并在生產(chǎn)中商業(yè)化推廣應(yīng)用,有效提升了葡萄酒的品質(zhì)和地域風(fēng)格[8-11]。張春暉[12]、盧新軍[13]、薛雪[14]、喬慧等[15]分別對從山東煙臺、河北昌黎、寧夏銀川、內(nèi)蒙古等葡萄酒產(chǎn)區(qū)篩選、鑒定的本土O.oeni進行釀造適應(yīng)性研究,結(jié)果均表明,發(fā)酵特性優(yōu)良的本土O.oeni菌株應(yīng)用于葡萄酒MLF后,酒樣中香氣化合物,尤其是酯類、高級醇等發(fā)酵香氣物質(zhì)表現(xiàn)更為豐富、多樣,具備釀造差異化明顯、典型性突出的優(yōu)質(zhì)葡萄酒應(yīng)用潛力。
甘肅河西走廊地處北緯36~40°,干旱少雨,晝夜溫差大,釀酒葡萄種植區(qū)以沙質(zhì)土壤為主,礦物質(zhì)豐富,具備生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒的良好生態(tài)條件[16]。然而企業(yè)在實際生產(chǎn)中大多采用進口發(fā)酵劑進行MLF,導(dǎo)致產(chǎn)品同質(zhì)化問題非常嚴(yán)重,無法適應(yīng)多元化、個性化的消費市場需求。本實驗以甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離鑒定的4株O.oeni為供試菌株,通過微釀實驗分析比較本土菌株與商業(yè)菌株OMEGA對赤霞珠(Cabernet Sauvignon)干紅葡萄酒香氣品質(zhì)的影響及差異,以期為本土O.oeni菌株的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用及釀造代表河西走廊產(chǎn)區(qū)風(fēng)味的葡萄酒提供技術(shù)支持。
赤霞珠葡萄采自甘肅莫高實業(yè)發(fā)展有限公司武威黃羊河種植基地,可滴定酸(以酒石酸計)5.87 g/L,含糖量約為22.3 Brix°(223 g/L)。
本土O.oeniMG-1、MG-7、QL-11、ZX-1菌株,均由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室從河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離、鑒定并保存。商業(yè)O.oeniOMEGA,購自法國Lallemand公司;釀酒酵母ES488,購自意大利Enartis公司。
L-蘋果酸檢測試劑盒,愛爾蘭Megazyme公司;香葉醇、β-香茅醇、(Z)-橙花叔醇、α-萜品醇、里那醇、β-大馬士酮、2-辛醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸甲酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醇、戊醇、己醇、金合歡醇、辛酸等香氣標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純),美國Sigma公司;蛋白胨、酵母浸粉、MgSO4、MnSO4、NaOH、無水葡萄糖、HCl、酒石酸、無水乙醇、偏重亞硫酸鈉等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純,天津光復(fù)化工研究所。
SW-CJ-2FD超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LDZX立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;BCD642WDVMU1立式冰箱,青島海爾股份有限公司;pHS-3C精密pH計,上海雷磁場儀器廠;TRACE 1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、ISQ單四級桿質(zhì)譜儀,美國Thermo Scientific公司;DB-WAX氣相色譜柱,美國Agilent Technologies公司;50/30 μmDVB/CAR-PDMS固相微萃取裝置、萃取頭,上海安譜科學(xué)儀器有限公司。
1.3.1 ATB培養(yǎng)基的配制
ATB基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,蛋白胨10,酵母浸粉5,MgSO4·7H2O 0.2,MnSO4·4H2O 0.05,鹽酸半胱氨酸0.5,番茄汁25%(體積分?jǐn)?shù)),液體培養(yǎng)基使用1 mol/L NaOH調(diào)pH至4.8,固體培養(yǎng)基調(diào)pH至5.0,并向其中加質(zhì)量濃度20 g/L的瓊脂,121 ℃滅菌20 min。其中葡萄糖于115 ℃滅菌15 min,在超凈工作臺內(nèi)按質(zhì)量濃度比例混合。
1.3.2 菌株活化
配制ATB液體培養(yǎng)基,121 ℃濕熱滅菌20 min后,置于無菌超凈工作臺中冷卻。取冷凍保存的O.oeni菌株,室溫下放置2 h后,從斜面培養(yǎng)基上挑取2環(huán)接種至配制好的液體培養(yǎng)基中,于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),備用。
1.3.3 葡萄酒微釀實驗
選用赤霞珠葡萄,參照小容器釀造工藝法[17]完成乙醇發(fā)酵后,將乙醇體積分?jǐn)?shù)為12.3%、殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為2.1 g/L、L-蘋果酸質(zhì)量濃度為3.378 g/L的酒樣分裝入15個2.5 L棕色玻璃瓶,分為5組(n=3)。其中4組分別以體積分?jǐn)?shù)為4%的接種量(1×107CFU/mL)量取活化后的本土O.oeni菌液,3 000 r/min離心10 min后棄去上清液,然后將沉淀用酒樣洗入發(fā)酵瓶中;對照商業(yè)菌株OMEGA按照推薦用量0.02 g/L(質(zhì)量濃度)接種。置于20 ℃啟動MLF,當(dāng)酒樣中L-蘋果酸質(zhì)量濃度≤0.3 g/L時,結(jié)束發(fā)酵。
1.3.4L-蘋果酸含量測定
參照L-蘋果酸檢測試劑盒推薦的方法,測定發(fā)酵酒樣中L-蘋果酸含量,分析O.oeni菌株的L-蘋果酸降解能力。
1.3.5 理化指標(biāo)測定
參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]中的實驗方法進行。殘?zhí)牵红沉衷噭┑味ǚ?;酒精:酒精計法;pH:精密pH計測定;總酸:酸堿滴定指示劑法,結(jié)果以酒石酸(g/L)計;揮發(fā)酸:水蒸氣蒸餾法,結(jié)果以乙酸(g/L)計;總SO2:碘量法。
1.3.6 揮發(fā)性香氣成分分析
參照祝霞等[19]的香氣物質(zhì)萃取方法及GC-MS條件,略作修改。各發(fā)酵酒樣重復(fù)測定3次。
1.3.6.1 香氣成分富集
取8 mL待測酒樣加入15 mL頂空瓶中,同時加入2.5 g NaCl、10 μL 2-辛醇(質(zhì)量濃度88.2 mg/L),加磁力攪拌轉(zhuǎn)子后用封口膜封口并搖勻,放入恒溫加熱磁力攪拌器中,40 ℃水浴平衡30 min,然后插入萃取針(旋出萃取頭)頂空萃取30 min。
1.3.6.2 GC-MS條件
GC條件:色譜柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm),進樣口溫度240 ℃,傳輸線溫度230 ℃,離子源溫度250 ℃,不分流進樣;載氣(He)流速1 mL/min;進樣時間5 min;柱溫升溫程序:40 ℃保持5 min,以3.5 ℃/min升至180 ℃,保持15 min。
MS條件:電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;傳輸線溫度180 ℃;離子源溫度200 ℃;質(zhì)譜掃描范圍m/z50~350。
1.3.6.3 定性與定量分析
目標(biāo)化合物采用保留指數(shù)(retention index,RI)、NIST-11、Wiley和香精香料譜庫檢索比對,結(jié)合譜圖分析進行定性。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.995)對已有標(biāo)準(zhǔn)品的高級醇、酯類、萜烯類化合物,進行定量,無標(biāo)準(zhǔn)品的化合物采用化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行半定量。
1.3.7 感官評價
參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及祝霞等[20]的方法,略作修改。各酒樣隨機編號后,由9名經(jīng)過葡萄酒品鑒培訓(xùn)的人員(5女,4男)進行3輪盲品,分別從外觀、香氣和口感方面,以具體評價角度對各酒樣進行品評。使用10分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來量化,0~10分表示感覺強烈程度逐漸增大。
表1 葡萄酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of wine
對供試樣本(n=3)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2013、Origin 2018進行基本處理和作圖,采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行Duncan’s多重比較以及差異顯著性分析,并對香氣化合物進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。
2.1.1 葡萄酒MLF期間L-蘋果酸含量變化
圖1所示為酒精發(fā)酵結(jié)束后,分別接種4株O.oeni進行MLF時,L-蘋果酸含量的變化趨勢。除對照組酒樣(未接菌,CK)外,其余葡萄酒中L-蘋果酸含量均呈下降趨勢。不同菌株對L-蘋果酸的分解速率存在一定差異。剛接入菌株1 d時,所有菌株均能分解葡萄酒中的L-蘋果酸。其中ZX-1發(fā)酵的葡萄酒中L-蘋果酸含量下降最快,24 h時L-蘋果酸含量約從3.400 g/L迅速降至2.600 g/L,相比其他菌株降酸速率最快。在隨后的第2~6天,MG-1酒樣分解速率緩慢,在此期間L-蘋果酸含量共降低了約0.400 g/L,降酸速率最低;但在6 d之后,MG-1酒樣中L-蘋果酸含量開始以約0.600 g/L的速率下降,快速消耗葡萄酒中L-蘋果酸。當(dāng)L-蘋果酸含量降至0.300 g/L時,所有菌株降酸速率均變得緩慢。在MLF 9 d后,ZX-1最先完成發(fā)酵,處理的酒樣中L-蘋果酸含量僅剩0.008 g/L,其次是MG-1(11 d),而QL-11和MG-7完成MLF分別用時13和14 d;而OMEGA菌株在第13天時,L-蘋果酸含量為0.283 g/L,未接菌的對照組CK酒樣蘋果酸含量幾乎無變化。結(jié)果表明,所有菌株均具有良好的降解L-蘋果酸的能力。
圖1 葡萄酒MLF期間L-蘋果酸含量變化Fig.1 Changes of L-malic acid content in wine during MLF
2.1.2 MLF后葡萄酒基本理化指標(biāo)
對MLF前后的葡萄酒樣進行基本理化指標(biāo)的測定,結(jié)果見表2。
表2 蘋果酸-乳酸發(fā)酵前后葡萄酒樣理化指標(biāo)Table 2 The physical and chemical indexes of wine sample before and after MLF
由表2可知,供試菌株均能夠分解葡萄酒中的L-蘋果酸,降低葡萄酒的總酸含量,使pH升高,并順利完成MLF,而在未加菌的對照組酒樣中,L-蘋果酸含量變化不大。其中O.oeniZX-1和MG-1幾乎能夠完全發(fā)酵葡萄酒中的L-蘋果酸,使總酸含量更低??傮w而言,MLF后的赤霞珠干紅葡萄酒基本理化指標(biāo)均符合國標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》的要求。
2.2.1 不同菌株MLF后酒樣香氣成分GC-MS分析
采用HS-SPME/GC-MS對未接菌酒樣及商品菌OMEGA和4株本土酒酒球菌MLF后酒樣產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行分析,結(jié)果見圖2。
由圖2可知,實驗共檢出90種香氣物質(zhì),其中醇類22種、酯類38種、酸類11種、萜烯類13種和其他類6種。其中,QL-11和MG-7菌株發(fā)酵的酒樣中均檢出78種香氣成分,是檢出香氣物質(zhì)種類最多的2株菌,且菌株QL-11是所有菌株中香氣物質(zhì)總含量(15.16 mg/L)最高的菌株;MG-1和ZX-1分別檢出香氣物質(zhì)67種(總含量13.76 mg/L)和71種(總含量14.33 mg/L);OMEGA酒樣中共檢出62種香氣物質(zhì)(總含量13.43 mg/L);而CK葡萄酒樣中共檢測到58種香氣成分(總含量12.60 mg/L)。
不同菌株發(fā)酵的酒樣產(chǎn)生同類香氣物質(zhì)的種類和含量存在差異。實驗共檢出酯類化合物38種,是5種處理酒樣中檢出種類最多、含量最高的香氣物質(zhì)。其中QL-11是檢出酯類最多的菌株,共35種(總含量6.92 mg/L);其次為MG-7,共檢出33種(總含量5.11 mg/L),而CK酒樣中檢出酯類化合物最少,為25種(總含量6.24 mg/L)。在6種處理下,辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯等具有的菠蘿、香蕉以及花香味成分均有檢出[21];而己酸甲酯、十四酸乙酯、水楊酸甲酯等具有的菠蘿、奶油味、冬青味和葡萄味化合物[22]在接種了本土O.oeni的酒樣中均有檢出,而在未接菌的CK酒樣和接種了商品菌OMEGA酒樣中均未檢出;在QL-11酒樣中檢出具有花香、蘋果等果香味的化合物乙酸辛酯,而在其他酒樣中均未檢出。
a-酯類物質(zhì);b-高級醇類物質(zhì);c-酸類物質(zhì);d-萜烯類物質(zhì);e-其他類物質(zhì)圖2 葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的GC-MS分析Fig.2 Volatile aroma components of wines by GC-MS analysis注:不同小寫字母表示樣品間具有顯著性差異(P<0.05)
QL-11是產(chǎn)高級醇種類和含量最多的菌株,分別為19種和6.65 mg/L。在進行了MLF的酒樣中主要檢出3-甲基-1-戊醇、月桂醇、2,3-丁二醇、4-甲基-1-戊醇等具有溶劑味、花香果香、黃油味、烘烤味的香氣成分[23],而CK酒樣中未檢出。
有機酸類物質(zhì)種類較多的酒樣為MG-7(總含量1.09 mg/L)和CK(總含量1.08 mg/L),均檢出10種物質(zhì);酸類化合物種類和含量檢出均最少的為MG-1酒樣,共6種(總含量0.94 mg/L),其中檢出含量最高的酸為帶有奶油味的辛酸[24],在OMEGA酒樣中含量最高,為0.89 mg/L。
萜烯類和其他類化合物是所有酒樣中檢出總體含量較少的香氣物質(zhì)。其中菌株ZX-1發(fā)酵的酒樣檢出萜烯類化合物的種類和含量均為最高,共12種(總含量0.20 mg/L),而其他類化合物共檢出5種(總含量0.12 mg/L)。同時,其他類物質(zhì)以MG-7檢出種類最多(6種),但含量(0.02 mg/L)最低。所有接種本土O.oeni發(fā)酵的酒樣中檢出萜烯化合物種類和含量均高于CK和OMEGA酒樣。主要檢出萜烯類化合物為β-紫羅蘭酮、金合歡醇和萜品醇等具有花香、果香、植物香的物質(zhì)[25]。檢出其他類化合物有β-環(huán)檸檬醛、香茅醛及2,4-二叔丁基苯酚等香氣物質(zhì)[26]。綜合分析可知,使用本土O.oeni進行MLF的酒樣酯類、醇類和萜烯類化合物含量均有增加,OMEGA發(fā)酵的酒樣中黃油味、乳酪味和烘烤香氣物質(zhì)更為突出。其中乳酸異戊酯、2,3-丁二醇、2-壬醇、2-甲基丁酸、β-紫羅蘭酮、金合歡醇及β-環(huán)檸檬醛等物質(zhì)能夠豐富葡萄酒的花香、果香味,但在CK組中未檢測到。從香氣物質(zhì)種類和總含量來看,QL-11和ZX-1能夠產(chǎn)生更多的香氣物質(zhì)。
2.2.2 不同菌株MLF后酒樣香氣化合物主成分分析
不同O.oeni菌株對酒體揮發(fā)性香氣成分的影響較為復(fù)雜,且不同菌株發(fā)酵的酒樣間香氣化合物種類及含量存在差異[27]。為進一步探究不同O.oeni進行MLF后酒樣在香氣成分上的整體差異,采用PCA多元統(tǒng)計法研究揮發(fā)性香氣化合物的變化[28]。以特征值>1提取主成分,得到PC1、PC2和PC3的方差貢獻率分別為46.385%、19.882%和16.985%,3個主成分累計方差貢獻率為83.252%,基本能夠反映原數(shù)據(jù)83.252%的變異信息。各香氣物質(zhì)在PC1、PC2和PC3上的因子載荷如圖3所示,香氣化合物酒樣分布見圖4。
由圖3可知,PC1主要反映了A22(壬酸乙酯)、A24(癸酸甲酯)、B10(辛醇)、B14(2,4-丁二醇)、C3(2-甲基丁酸)、C8(辛酸)、D7(橙花醇)、D8(香葉醇)等酯類物質(zhì)及具有水果、奶油、乳香味的醇類、酸類以及具有花果香的萜烯類香氣化合物的變異信息;化合物C10(乙酸)、D1(β-大馬士酮)等與PC1高度負(fù)相關(guān)。PC2主要體現(xiàn)了B16(苯甲醇)、B22(2-壬醇)、C4(癸酸)、D6(金合歡醇)、D10(α-松油醇)等具有水果香、奶酪等香氣物質(zhì)信息,而PC2負(fù)半軸香氣物質(zhì)主要為A11(丙酸異戊酯)、A33(癸酸異戊酯)、A13(丁酸異戊酯)、A6(3-甲基丁酸乙酯)等酯類物質(zhì)。PC3正半軸上得分較高的主要為B18(4-甲基-1-戊醇)、A14(辛酸異丁酯)、A7(戊酸乙酯)、B2(丁醇)、B13(3-甲基-1-戊醇)等香氣化合物,這些化合物能夠賦予葡萄酒豐富的花果香味;而其負(fù)半軸區(qū)域有突出表現(xiàn)的香氣成分主要為A17(反式-2-己烯酸乙酯)、A23(辛酸正丁酯)、B11(反式-2-辛烯-1-醇)、B19(反式-3-己烯-1-醇)、C5(己酸)、D2(香葉基丙酮)等具有青草味和乳味的香氣物質(zhì)。
a-PC1-PC2; b-PC1-PC3圖3 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖Fig.3 Factor loadings plot of PCA for volatile aromacompounds
由圖4可知,CK和MG-7酒樣可聚為一類,在PC2負(fù)半軸及PC3負(fù)半軸上得分較高,表明丙酸異戊酯、癸酸異戊酯、3-甲基丁酸乙酯、反式-2-辛烯-1-醇、香葉基丙酮等具有紫丁香、青草味的香氣物質(zhì)含量較高。位于香氣物質(zhì)更加聚集區(qū)域的QL-11和MG-1,其PC1正半軸和PC3正半軸上得分均較高,主要代表了具有濃郁花香、果香和乳香味的酯類和高級醇類物質(zhì)的香氣特征信息。ZX-1酒樣代表了PC1正半軸和PC2正半軸以及PC3負(fù)半軸上的特征香氣物質(zhì)信息,這一區(qū)域香氣物質(zhì)豐富多樣,主要為乙酸乙酯、庚酸乙酯、苯甲醇、2-甲基丁酸、橙花醇、香葉醇等高級酯、高級醇及萜烯類香氣成分,這些物質(zhì)可使葡萄酒具有更濃郁的花香、果香和乳香等MLF特征香氣物質(zhì),增加葡萄酒香氣復(fù)雜性。而OMEGA酒樣主要分布于PC1負(fù)半軸和PC3正半軸,代表了異丁酸、9-癸烯酸等具有黃油、脂肪味的有機酸類以及2-乙基己醇、異丁醇、丁二酸二乙酯、乙酸辛酯等具有花香、蘋果等甜果香味的酯和醇類。
圖4 香氣化合物主成分分析的酒樣分布圖Fig.4 Score plot of wine samples for PCA of the volatilearoma compounds
圖5為不同菌株MLF赤霞珠干紅葡萄酒感官分析雷達圖。
圖5 赤霞珠干紅葡萄酒感官分析雷達圖Fig.5 Radar map of sensory analysis for CabernetSauvignon dry red wine
由圖5可知,在色澤方面CK與OMEGA、MG-7、MG-1、QL-11和ZX-1菌株發(fā)酵酒樣并無明顯差異;從口感方面分析,MLF可使酒樣的口感變得更加柔和圓潤。QL-11菌株發(fā)酵酒樣的花香、果香味較為突出,而MG-7、MG-1、ZX-1菌株的花香、果香、余味長短無明顯差異,但均高于CK與OMEGA菌株。整體而言,MLF后酒樣在香氣、余味長短、典型性方面均高于CK,這是因為MLF提高了酒樣中的酯類、酸類、醇類化合物含量,與MATURANO等[29]的研究結(jié)果一致。綜合分析,采用本土O.oeni進行MLF后酒樣更有利于花果香的形成,使酒體典型性更突出。
赤霞珠干紅葡萄酒MLF微釀實驗結(jié)果表明,4株本土O.oeni均能順利完成MLF,但發(fā)酵時間存在差異,其中ZX-1菌株9 d完成了發(fā)酵,降酸能力最強,其次是MG-1(11 d),而QL-11、MG-7和OMEGA菌株均在14 d左右完成了MLF,且發(fā)酵酒樣理化指標(biāo)均符合國標(biāo)(GB/T 15037—2006《葡萄酒》)要求;香氣化合物GC-MS分析檢測結(jié)果表明,與未進行MLF的(CK)酒樣相比,接種本土O.oeni進行MLF的酒樣揮發(fā)性香氣物質(zhì)更加豐富、多樣,其中QL-11菌株發(fā)酵酒樣中酯類、醇類、萜烯類等化合物含量明顯增多,表現(xiàn)為更濃郁的花香、果香味;而商品菌株OMEGA發(fā)酵酒樣中黃油、脂肪味化合物含量較高,與感官評價分析結(jié)果相一致。總體而言,QL-11菌株具有釀造代表甘肅河西走廊產(chǎn)區(qū)特色葡萄酒的應(yīng)用潛力。