• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    谷氨酰胺轉氨酶活化蛋白酶在大腸桿菌中的表達及性質研究

    2020-08-20 00:47:08高慧劉松
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年15期
    關鍵詞:信號肽蛋白酶活化

    高慧,劉松*

    1(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

    谷氨酰胺轉氨酶(EC 2.3.2.13,transglutaminase,TGase),能催化蛋白質肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基(?;w)轉移至賴氨酸殘基的ε-氨基(?;荏w),形成ε-(γ-谷氨?;?賴氨酸共價鍵,導致蛋白質分子發(fā)生交聯[1]。目前,TGase已被廣泛應用于肉制品、乳制品和豆制品等蛋白類食品的質構改良[2]。隨著對其催化本質認識的加深,TGase的應用開始向生物制藥[3]、制革、紡織[4]及生物技術[5]等多個非食品領域拓展。1989年,日本天野公司首次從土壤中分離了1株能夠分泌TGase的茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)[6]。與其他來源的TGase相比,微生物發(fā)酵生產的TGase具有非Ca2+依賴性的特點,且生產周期短,成本優(yōu)勢明顯。隨著應用領域的拓展,鏈霉菌TGase的產量及酶學性質(底物特異性及熱穩(wěn)定性)的研究逐漸限制了對它的應用需求。構建高產TGase的基因工程菌,并進行酶學性質改造成為相關領域的研究熱點。

    鏈霉菌TGase是一種胞外酶,在野生菌中以無活性的酶原(pro-TGase)形式分泌,pro-TGase被內源的蛋白酶切除N端酶原區(qū)后,轉化成活性TGase。由于N端酶原區(qū)對TGase的正確折疊及分泌有重要影響[7-9],通常其在異源宿主中需以pro-TGase形式表達。值得注意的是,細菌和真菌異源表達宿主通常缺少能專一切割pro-TGase酶原區(qū)的蛋白酶。因此,如何將pro-TGase高效轉化為活性TGase成為其異源表達的關鍵。目前,主要有3種策略獲得活性重組TGase:(1)共表達pro-TGase與特異性蛋白酶(SAM-P45[10]或人鼻病毒3C蛋白酶[11]);(2)共表達酶原區(qū)與TGase[8,12-13];(3)僅表達pro-TGase,體外添加活化蛋白酶[14]。由于共表達蛋白酶可以對TGase的持續(xù)降解[10]或缺少共價連接的酶原區(qū)促進其分泌[12],該策略獲得的TGase表達量(16.30 U/mL)[15]仍遠低于僅表達pro-TGase獲得的(51.1 U/mL)[14]。因此,僅表達pro-TGase再體外添加蛋白酶活化的策略,對于制備活性TGase仍具有產量和成本優(yōu)勢。

    目前,用于切割N端酶原區(qū)使pro-TGase活化的蛋白酶可以從產TGase的野生菌中分離(如S.mobaraensis金屬蛋白酶TAMEP)[16-17]或其他鏈霉菌中提取(如Streptomycesalbogriseolus分泌的SAM-P20、SAM-P26及SAM-P45等)[18]。此外,一系列商品化的蛋白酶同樣能活化pro-TGase,如dispase、中性蛋白酶和胰蛋白酶等[19]。與其他的蛋白酶相比,S.mobaraensis來源的TAMEP能夠精準地切割pro-TGase的N端酶原區(qū),活化效率更高且不會對活化后的TGase進行持續(xù)降解[20]。研究發(fā)現,S.mobaraensis來源TAMEP屬M4蛋白酶,在野生菌中僅有少量分泌至胞外,且活性受到鏈霉菌、枯草桿菌蛋白酶抑制劑的抑制[16,20-21]。最近,S.mobaraensisTAMEP被成功表達于大腸桿菌,但僅存在于細胞周質空間,并不利于其大規(guī)模發(fā)酵制備[20]?;诖?,實現TAMEP高效分泌表達將有助于降低重組pro-TGase的活化成本,提高TGase生產效率。

    本研究將來源于S.mobaraensis的TAMEP表達于大腸桿菌,通過信號肽類型優(yōu)化、信號肽N端密碼子同義替換及誘導條件優(yōu)化,實現了TAMEP的高效分泌,并分析了其酶學性質及對pro-TGase的活化效率。研究結果將有助于TAMEP的規(guī)?;苽洹?/p>

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    菌株與質粒:表達質粒pET-22b(+)、大腸桿菌EscherichiacoliJM109和E.coliBL21(DE3)由本實驗室保存。產S.mobaraensispro-TGase的生產菌Yarrowialipolytica/pINA1297/TGase由本實驗前期構建[22]。編碼S.mobaraensisTAMEP及天然信號肽TSP基因[20]的質粒pUC18/TSP-TAMEP由上海生工合成。

    LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物 5,胰蛋白胨10,NaCl 10。TB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 12,酵母提取物 24,K2HPO4·3H2O 16.37,KH2PO42.31,甘油 5。Y.lipolytica發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油 15,酵母膏 20,NH4Cl 2.64,KH2PO40.32,MgSO40.25,維生素B13.34×10-4,調pH至8.0。YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母膏 10,蛋白胨 20,葡萄糖 20。LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基在接種前需加入終質量濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素。

    酶、試劑、引物和DNA測序:限制性內切酶、DNA聚合酶購自Takara公司。dispase、GSH、質粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒和抗生素購自上海生工公司。Z-Gln-Gly-OH、L-谷氨酸-γ-單羥肟酸、組氨酸標簽蛋白抗體和顯色劑購自賽默飛公司。BCA蛋白濃度檢測試劑盒和SDS-PAGE試劑盒購于碧云天公司。引物構建、DNA測序由上海生工公司完成。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 TAMEP表達質粒的構建與轉化

    以pUC18/TAMEP為模板,分別用引物對TSPTAMEP1/TAMEP2和TAMEP1/TAMEP2進行PCR擴增,得到片段TSP-TAMEP(天然信號肽TSP基因+TAMEP基因)和TAMEP。PCR反應條件為: 98 ℃預變性90 s;隨后進行30個循環(huán)擴增(98 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s);最后72 ℃保溫5 min。將TSP-TAMEP和TAMEP分別克隆至pET-22b(+)的NdeI-XhoI和NcoI-XhoI酶切位點,得到表達載體pET22b-TSP-TAMEP和pET22b-pelB-TAMEP。將所得表達載體轉化E.coliBL21(DE3),得到重組菌E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)和E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)。質粒構建相關引物見表1。

    表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

    1.2.2 優(yōu)化TAMEP信號肽N端密碼子同義隨機替換

    以Mut-A1、Mut-A2、Mut-A3、Mut-A4、Mut-A5、Mut-A6、Mut-A7、Mut-A8為上游引物,以Mut-B為下游引物,對pET22b-TSP-TAMEP進行PCR擴增,在TAMEP信號肽TSP的 N端前10個氨基編碼基因中隨機引入同義密碼子。PCR反應條件為: 98 ℃預變性90 s;隨后進行30個循環(huán)擴增(98 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 3 min);最后72 ℃保溫5 min。PCR產物混合,并經DpnI處理后轉化,轉化后涂布氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板。挑取轉化子至含LB培養(yǎng)基的96深孔板中培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)8 h;轉接裝有TB培養(yǎng)基的96深孔板,37 ℃培養(yǎng)2 h,加入終濃度10 μmol/L IPTG,20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)40 h。將高產轉化子轉接搖瓶培養(yǎng)復篩。

    1.2.3 重組菌發(fā)酵優(yōu)化

    重組大腸桿菌發(fā)酵:取TAMEP生產菌液100 μL接入LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)10 h轉接至TB培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng);當菌體OD600達到一定值(0.5~3.0)時,加入一定量的IPTG(0~200 μmol/L),同時降溫培養(yǎng)(16~30 ℃)培養(yǎng)40 h;為提高TAMEP胞外表達水平,分別添加2~10 g/L的甘氨酸、葡萄糖或體積分數為0.2%~1.0%乙醇。各培養(yǎng)基使用前添加終質量濃度50 μg/mL的氨芐青霉素。

    重組Y.lipolytica發(fā)酵:將pro-TGase生產菌液接種于YPD液體培養(yǎng)基中,于28 ℃培養(yǎng)24 h;將種子液以10%的接種量轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中,于28 ℃搖瓶培養(yǎng)120 h。

    1.2.4 蛋白質分離純化

    采用鎳柱對TAMEP及pro-TGase進行純化。重組菌發(fā)酵上清液經0.22 μmol/L膜過濾制成上樣樣品。將樣品注入經結合緩沖液平衡的鎳柱,并用結合緩沖液洗去未結合蛋白;隨后以0~500 mmol/L咪唑溶液進行梯度洗脫,收集含有TAMEP或TGase催化活性的部分(pro-TGase樣品經dispase活化)。所得純化樣品經脫鹽柱去除鹽離子。

    1.2.5 TAMEP酶學性質檢測

    最適反應溫度:在反應溫度為20~80 ℃測定TAMEP活性,以所測得的最高酶活力為100%,計算其他反應溫度下的相對酶活力。

    最適反應pH:測定pH為5~10條件下TAMEP活性(pH 5:50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液;pH 6~8:50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液;pH 9~10:50 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液),以所測得的最高活性為100%,計算其他反應pH下的相對酶活力。

    熱穩(wěn)定性:將TAMEP分別于30~60 ℃下孵育0~60 min后,冰水浴5 min并測定其催化活性,未經熱處理的酶活力設為100%,計算其他條件下的相對酶活力。

    pH穩(wěn)定性:將TAMEP用pH為5~10緩沖液稀釋相同倍數,于30 ℃水浴中孵育60 min測定酶活力,以測得最高酶活力為100%,計算其他pH下孵育的相對酶活力。

    1.2.6 pro-TGase活化分析

    將純化的pro-TGase與不同濃度的TAMEP溶液混合均勻,于37 ℃恒溫30 min。在該反應體系中,pro-TGase濃度為6.91 μmol/L,TAMEP濃度分別為0.133、0.066、0.033和0.017 μmol/L。反應開始后,每間隔10 min取樣50 μL,進行TGase活力測定;同時取樣10 μL與SDS-PAGE電泳上樣緩沖液混合于90 ℃加熱10 min后進電泳分析。

    1.2.7 酶活力檢測

    按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中福林法測蛋白酶活性方法測定TAMEP酶活力。1 U TAMEP酶活力定義為40 ℃下每1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量。以用α-N-CBZ-Gln-Gly和鹽酸羥胺為作用底物測定TGase酶活力[7]。1 U TGase酶活力定義為37 ℃每1 min催化生成1 μmolL-谷氨酸-γ-單羥肟酸的酶量。

    1.2.8 蛋白質分析

    使用BCA蛋白濃度檢測和采用碧云天試劑盒制備SDS-PAGE電泳凝膠,具體操作參考產品說明書。使用濃縮膠質量濃度為50 g/L,分離膠質量濃度為120 g/L,以質量濃度1 g/L考馬斯亮藍R-250進行染色。使用His-tag標簽抗體進行Western blot,具體方法參考前期工作[23]。

    2 結果與分析

    2.1 信號肽來源優(yōu)化提高TAMEP在E. coli中的分泌表達

    在E.coli中,融合于N端的信號肽可介導蛋白質分泌[24]。因此,分別將TAMEP天然信號肽[20]和大腸桿菌pelB信號肽融合至TAMEP的N端,構建得到表達質粒pET22b-TSP-TAMEP和pET22b-pelB-TAMEP(圖1)。轉化至E.coliBL21(DE3)分別得到重組菌E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)和E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)。

    圖1 表達質粒示意圖Fig.1 The scheme of expression plasmids

    將E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)、E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)及對照菌E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+))于TB培養(yǎng)基中進行誘導表達。誘導溫度、誘導起始菌體濃度(OD600)、IPTG濃度和誘導時間,分別為20 ℃、0.8、100 μmol/L和40 h。如圖2-a所示,使用TAMEP天然信號肽的重組菌胞外蛋白酶活力達到20.8 U/mL,較pelB信號肽條件下酶活力提高92.6%;由于存在一定量的內源蛋白酶,對照菌仍能檢測到一定的蛋白酶活力。由于胞外蛋白酶條帶較多,TAMEP的條帶在SDS-PAGE電泳圖中并不清晰(圖2-b)。Western Blot分析結果顯示,在E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)、E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)發(fā)酵上清液中均能檢測到條帶,且與TAMEP理論分子質量56.4 kDa接近(圖2-c)。對照E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+))樣品,未能檢測到相同條帶(圖2-c)。上述結果表明,TAMEP天然信號肽能有效介導TAMEP在E.coliBL21(DE3)中的分泌,且性能優(yōu)于E.coli內源信號肽pelB。

    a-重組菌胞外TAMEP酶活力;b-重組菌胞外SDS-PAGE電泳;c-重組菌胞外Western BlotM-蛋白質標準分子質量;1-E. coli BL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP);2-E. coli BL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP);3-E. coli BL21(DE3)(pET-22b(+))圖2 分泌信號肽類型對TAMEP表達的影響Fig.2 Type of signal peptide on the expression of TAMEP注:TAMEP位置用箭頭標出

    2.2 信號肽N端密碼子同義突變提高TAMEP在E. coli中的表達

    研究表明,蛋白質N端編碼區(qū)基因序列對其表達效率有重要影響,但確切的機制尚不清楚[25-26]。為進一步提高TAMEP在E.coli中的表達,基于pET22b-TSP-TAMEP對TAMEP天然信號肽N端前10個氨基酸的密碼子進行隨機同義突變(圖1),并轉化E.coliBL21(DE3)。通過微孔板對1 656個轉化子進行初篩,選取了20株蛋白酶活力較高的菌株進行搖瓶復篩。如圖3-a所示,20株菌中17株菌的酶活力較E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)高;其中,菌株17較出發(fā)菌提高了30%,達到了27.0 U/mL?;蛐蛄蟹治鲲@示,上述17株菌中TAMEP信號肽N端的前10個氨基酸編碼基因均發(fā)生了不同程度的同義突變。

    a-突變株搖瓶發(fā)酵上清液TAMEP酶活力;b-突變株TAMEP信號肽N端基因序列WT-E. coli BL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP);1-17-TAMEP信號肽N端密碼子同義突變體圖3 信號肽N端前10個氨基酸密碼子同義突變對TAMEP在E. coli中表達的影響Fig.3 Effect of synonymous mutation within first 10 residuesof the TAMEP signal peptide on its expression in E.coli

    2.3 提高TAMEP在E.coli中表達的發(fā)酵條件優(yōu)化

    為提高TAMEP在E.coliBL21(+)中的表達量,通過單因素實驗依次對上述17株菌的誘導溫度、誘導劑IPTG濃度、誘導起始菌體濃度及添加劑進行優(yōu)化。如圖4所示,對TAMEP分泌表達影響最大的是添加劑,其次為誘導溫度和誘導劑濃度;誘導起始菌體濃度對酶表達的影響最小。在所選的添加劑中,乙醇能夠刺激細胞熱休克蛋白的表達,防止所表達蛋白的錯誤折疊;葡萄糖可提高宿主細胞中的質粒穩(wěn)定性;甘氨酸、曲通及吐溫等可以改善細胞膜通透性,提高重組蛋白向胞外轉運的效率[27]。葡萄糖對TAMEP分泌表達的促進作用最大,表明質粒穩(wěn)定性可能是其高效表達的限制性因素。最終確定TAMEP在E.coli中高效分泌表達的條件為:誘導溫度20 ℃、IPTG濃度為10 μmol/L、誘導起始OD600值為1.5及添加10 g/L葡萄糖。在此條件下,胞外TAMEP酶活力達到186.3 U/mL,較優(yōu)化前提高了5.9倍。

    2.4 TAMEP的純化及酶學性質研究

    本研究中表達的重組TAMEP和前期研究中表達的重組pro-TGase均在C端添加了由6個組氨酸構成的His-tag,故采用鎳柱對這2個蛋白進行親和純化。經洗脫條件優(yōu)化,確定TAMEP和pro-TGase洗脫的咪唑濃度分別為50和250 mol/L。如圖5所示,純化的蛋白無明顯雜帶。經脫鹽柱去除咪唑,測定TAMEP比酶活力為437 U/mg。

    a-誘導溫度TAMEP表達的影響;b-IPTG濃度TAMEP表達的影響;c-誘導起始菌株濃度TAMEP表達的影響;d-添加劑TAMEP表達的影響圖4 誘導表達條件對TAMEP表達的影響Fig.4 Effects of induction conditions on the TAMEP expression

    M-蛋白質標準分子質量;1-純化TAMEP 50 mol/L洗脫液;2-純化pro-TGase 250 mol/L洗脫液圖5 SDS-PAGE電泳分析TAMEPFig.5 SDS-PAGE analysis of TAMEP注:TAMEP和pro-TGase位置分別用單箭頭和雙箭頭標出(下同)

    對純化后的TAMEP進行了酶學性質分析。如圖6-a和圖6-b所示,TAMEP的最適反應溫度和最適反應pH分別為55 ℃和7.0。穩(wěn)定性分析結果顯示,TAMEP在30~50 ℃孵育60 min酶活力保持在50%以上,60 ℃孵育相同時間酶活力幾乎全部損失(圖6-c);TAMEP在pH 6.2~8.9最穩(wěn)定,并且在堿性環(huán)境中比在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定。上述性質與S.mobaraensisTAMEP相似,將有助于高效活化pro-TGase的同時,確?;罨骉Gase的穩(wěn)定性。

    a-溫度對TAMEP催化活性影響;b-pH對TAMEP催化活性影響;c-溫度對TAMEP穩(wěn)定性影響;d-pH對TAMEP穩(wěn)定性影響圖6 TAMEP酶學性質分析Fig.6 Catalytic property analysis of TAMEP

    2.5 TAMEP活化pro-TGase

    為研究重組TAMEP對pro-TGase的活化,用0.017~0.133 μmol/L TAMEP活化6.91 μmol/L pro-TGase 30 min,每隔10 min取樣進行TGase酶活力檢測和電泳分析。TGase酶活力分析顯示,TGase活性隨著活化反應進行而逐漸升高;相同的活化時間下,TGase活性隨著加入TAMEP的濃度升高而升高(圖7-a)。

    如圖7-b所示,隨著活化反應的進行,pro-TGase(43.4 kDa)迅速轉化為TGase(39.2 kDa),較高濃度TAMEP可加快這個轉化過程,并且未產生其他小的蛋白條帶。上述結果表明,重組TAMEP能高效催化pro-TGase活化,并不會降解活化后的TGase。

    a-TGase酶活;b-SDS-PAGE電泳圖7 重組TAMEP的濃度對pro-TGase活化的影響Fig.7 Effect of TAMEP concentration on theactivation of pro-TGase注:SDS-PAGE左側括號中的數值為TAMEP濃度

    3 結論與討論

    重組鏈霉菌pro-TGase異源表達后,需要高效且專一性強的活化蛋白將其轉化為活性TGase。S.mobaraensisTAMEP作為pro-TGase天然活化蛋白,較其他蛋白酶更具優(yōu)勢。本研究,我們將S.mobaraensis來源的TAMEP表達于E.coli,并通過多重優(yōu)化策略(信號肽類型、N端同義密碼子優(yōu)化、優(yōu)化誘導條件),實現了TAMEP的高效分泌表達,胞外TAMEP酶活力達到了186.3 U/mL。與胞內表達相比[20],高效分泌表達將有助于TAMEP的分離提取,降低產酶成本。酶學性質分析顯示,重組TAMEP 與TGase具有近似穩(wěn)定pH和溫度范圍,將有助于前者對后者的活化。研究結果為TAMEP規(guī)?;a提供了生產菌株和基礎數據。值得注意的是,本研究采用價格較高的IPTG作為誘導劑,同時活化過程中TAMEP不能重復利用。因此,進一步考查自誘導表達的條件及研究TAMEP的固化策略將有助于其工業(yè)化應用。

    猜你喜歡
    信號肽蛋白酶活化
    嵌合信號肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的分泌
    無Sn-Pd活化法制備PANI/Cu導電織物
    小學生活化寫作教學思考
    思鄉(xiāng)與蛋白酶
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:30
    運用計算機軟件預測木質部寄生屬信號肽
    多胚蛋白酶 高效養(yǎng)畜禽
    新農業(yè)(2016年18期)2016-08-16 03:28:31
    IgA蛋白酶在IgA腎病治療中的潛在價值
    內源信號肽DSE4介導頭孢菌素C?;冈诋叧嘟湍钢械姆置诒磉_
    冷卻豬肉中產蛋白酶腐敗菌的分離鑒定
    基于B-H鍵的活化對含B-C、B-Cl、B-P鍵的碳硼烷硼端衍生物的合成與表征
    99精品在免费线老司机午夜| 18禁在线播放成人免费| 欧美成人a在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品久久久久久久电影| 999久久久精品免费观看国产| 日韩中字成人| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 中国美女看黄片| 成人鲁丝片一二三区免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 熟女电影av网| 精华霜和精华液先用哪个| 床上黄色一级片| 一本久久中文字幕| 亚洲人成网站高清观看| 全区人妻精品视频| 一进一出好大好爽视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 少妇高潮的动态图| av在线蜜桃| 亚洲激情在线av| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩有码中文字幕| 精品久久久久久久久久久久久| 国产在线男女| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲最大成人中文| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜免费成人在线视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 波多野结衣高清作品| 国产高清视频在线观看网站| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 成人一区二区视频在线观看| 免费人成在线观看视频色| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 日日夜夜操网爽| 亚洲午夜理论影院| 老司机深夜福利视频在线观看| 中文字幕高清在线视频| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 97碰自拍视频| 欧美高清成人免费视频www| 人妻久久中文字幕网| 国产在线男女| 麻豆成人av在线观看| 亚洲精品在线美女| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲真实伦在线观看| 美女免费视频网站| 五月伊人婷婷丁香| 欧美区成人在线视频| 日韩欧美精品v在线| 色哟哟·www| 国产精品女同一区二区软件 | a级毛片免费高清观看在线播放| 一本久久中文字幕| 国产探花在线观看一区二区| 国产一区二区三区视频了| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲黑人精品在线| av在线老鸭窝| 1000部很黄的大片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲欧美激情综合另类| 国产伦在线观看视频一区| 成人三级黄色视频| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲无线观看免费| 精华霜和精华液先用哪个| 日日干狠狠操夜夜爽| 极品教师在线视频| av福利片在线观看| 香蕉av资源在线| 日韩高清综合在线| 99热精品在线国产| 国产男靠女视频免费网站| 国产一区二区在线av高清观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 一区二区三区激情视频| 久久草成人影院| 如何舔出高潮| 一本精品99久久精品77| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲最大成人中文| 国产视频一区二区在线看| 黄色日韩在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国内精品美女久久久久久| 国产精品影院久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | www日本黄色视频网| 国产视频一区二区在线看| 免费看a级黄色片| 色综合亚洲欧美另类图片| 一区二区三区四区激情视频 | av黄色大香蕉| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产高潮美女av| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲精品色激情综合| 午夜老司机福利剧场| 国产单亲对白刺激| 中文字幕av在线有码专区| 一区二区三区高清视频在线| 久久亚洲精品不卡| 最近视频中文字幕2019在线8| 最近在线观看免费完整版| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人一区二区视频在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 少妇丰满av| 观看美女的网站| 69人妻影院| 中国美女看黄片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美中文日本在线观看视频| 直男gayav资源| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 99热这里只有是精品50| 窝窝影院91人妻| 男人和女人高潮做爰伦理| 成年免费大片在线观看| 无人区码免费观看不卡| 美女 人体艺术 gogo| 欧美极品一区二区三区四区| 国产中年淑女户外野战色| 成人亚洲精品av一区二区| 91在线观看av| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲黑人精品在线| 免费观看精品视频网站| 日本五十路高清| 色综合站精品国产| 亚洲美女搞黄在线观看 | 搞女人的毛片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 男插女下体视频免费在线播放| 免费观看精品视频网站| 亚洲真实伦在线观看| 成人午夜高清在线视频| 国内精品久久久久精免费| 日韩免费av在线播放| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 好男人电影高清在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲专区中文字幕在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| 国产精华一区二区三区| 久久久久久久久中文| 午夜福利18| 日本 欧美在线| 亚洲在线观看片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲精品影视一区二区三区av| av在线老鸭窝| av国产免费在线观看| 97热精品久久久久久| 国产探花在线观看一区二区| 午夜影院日韩av| 欧美激情在线99| www.熟女人妻精品国产| 久久人人精品亚洲av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 在线播放国产精品三级| 波野结衣二区三区在线| 五月玫瑰六月丁香| 麻豆av噜噜一区二区三区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 深夜精品福利| 国产v大片淫在线免费观看| 女同久久另类99精品国产91| 日韩欧美三级三区| 免费看日本二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人亚洲精品av一区二区| 两个人的视频大全免费| 久久午夜福利片| 窝窝影院91人妻| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲av免费高清在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产三级在线视频| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 日本一二三区视频观看| 国产av麻豆久久久久久久| 在线观看一区二区三区| 日本一二三区视频观看| 色综合婷婷激情| 国产极品精品免费视频能看的| 婷婷亚洲欧美| 一本一本综合久久| 国产美女午夜福利| 精品久久久久久成人av| 91狼人影院| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 99久久精品热视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 美女 人体艺术 gogo| 欧美最黄视频在线播放免费| 婷婷亚洲欧美| 成人三级黄色视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 一进一出抽搐动态| 免费在线观看日本一区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产亚洲欧美在线一区二区| av女优亚洲男人天堂| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美激情久久久久久爽电影| av在线观看视频网站免费| 99riav亚洲国产免费| av专区在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品久久久久久久电影| 岛国在线免费视频观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 精品午夜福利在线看| 老司机福利观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲五月天丁香| 国产av麻豆久久久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 午夜激情福利司机影院| 在线天堂最新版资源| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美一级a爱片免费观看看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜精品在线福利| .国产精品久久| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 天堂影院成人在线观看| 一a级毛片在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 精品国产亚洲在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日日夜夜操网爽| www.色视频.com| 首页视频小说图片口味搜索| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一区二区三区免费毛片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 亚洲最大成人av| 亚洲av成人av| 色综合站精品国产| a级毛片a级免费在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美成人a在线观看| 国产av一区在线观看免费| 日日夜夜操网爽| 久久人妻av系列| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费电影在线观看免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 久久国产精品人妻蜜桃| 一区二区三区激情视频| 黄片小视频在线播放| 极品教师在线免费播放| 99热这里只有是精品在线观看 | 免费av毛片视频| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲av不卡在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 一夜夜www| av专区在线播放| 国产免费av片在线观看野外av| 免费看日本二区| 此物有八面人人有两片| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲成av人片在线播放无| 国产成年人精品一区二区| 日本在线视频免费播放| 亚洲精品成人久久久久久| 精品无人区乱码1区二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 高清在线国产一区| 久久精品国产自在天天线| 99热6这里只有精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一个人观看的视频www高清免费观看| 成人永久免费在线观看视频| 久久久精品欧美日韩精品| 高潮久久久久久久久久久不卡| 婷婷六月久久综合丁香| 91麻豆av在线| 亚洲国产精品999在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 高清毛片免费观看视频网站| 国产黄片美女视频| 69人妻影院| 色5月婷婷丁香| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 老女人水多毛片| 黄色女人牲交| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产不卡一卡二| 又爽又黄无遮挡网站| 精品人妻1区二区| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 在线观看66精品国产| 我要搜黄色片| 亚洲欧美日韩东京热| 99国产综合亚洲精品| 国产在线男女| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产亚洲精品av在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| av专区在线播放| 天堂√8在线中文| 天堂影院成人在线观看| 亚洲,欧美精品.| 日本在线视频免费播放| 亚洲综合色惰| 日韩欧美国产在线观看| 深夜精品福利| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲精品色激情综合| 两个人的视频大全免费| 国产成年人精品一区二区| 国产亚洲欧美98| 久久国产精品影院| 国产av不卡久久| 亚洲av不卡在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品久久久久久精品电影| 一本久久中文字幕| 国产在线男女| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 午夜视频国产福利| 亚洲精品一区av在线观看| 69av精品久久久久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 88av欧美| 成人鲁丝片一二三区免费| 在线天堂最新版资源| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲在线自拍视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 免费在线观看日本一区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 床上黄色一级片| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲av成人av| 人人妻人人看人人澡| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 看片在线看免费视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲最大成人av| netflix在线观看网站| 欧美性猛交黑人性爽| 9191精品国产免费久久| 免费看美女性在线毛片视频| 婷婷亚洲欧美| 国产成人影院久久av| 亚洲电影在线观看av| 日韩亚洲欧美综合| 久久精品人妻少妇| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜福利18| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 男人舔女人下体高潮全视频| 黄色丝袜av网址大全| 免费av毛片视频| 级片在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va | 亚州av有码| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文资源天堂在线| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜两性在线视频| 久久九九热精品免费| 不卡一级毛片| 少妇人妻精品综合一区二区 | 三级毛片av免费| 精品人妻1区二区| 成年免费大片在线观看| 亚洲片人在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本免费a在线| 51国产日韩欧美| 国产91精品成人一区二区三区| 色视频www国产| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲性夜色夜夜综合| 可以在线观看毛片的网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美成人免费av一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 国产高清有码在线观看视频| 丁香六月欧美| 精品久久久久久久久亚洲 | 夜夜爽天天搞| 午夜视频国产福利| 欧美午夜高清在线| 免费在线观看亚洲国产| 欧美日韩黄片免| 欧美在线一区亚洲| 色综合婷婷激情| 日本精品一区二区三区蜜桃| 如何舔出高潮| 国产三级中文精品| 一本久久中文字幕| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 色哟哟·www| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 色av中文字幕| 亚洲精品在线观看二区| a在线观看视频网站| 欧美日本视频| 麻豆国产97在线/欧美| 免费观看精品视频网站| 色吧在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 中国美女看黄片| 国产一区二区三区视频了| 日韩欧美精品免费久久 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 永久网站在线| 桃色一区二区三区在线观看| 美女大奶头视频| 高清在线国产一区| 国产一区二区激情短视频| 国产伦在线观看视频一区| 岛国在线免费视频观看| 熟女电影av网| 午夜激情福利司机影院| avwww免费| 国产在线精品亚洲第一网站| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日韩欧美 国产精品| aaaaa片日本免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产色爽女视频免费观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日本熟妇午夜| 久久性视频一级片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲男人的天堂狠狠| 嫩草影视91久久| 久久久久性生活片| 久久这里只有精品中国| 窝窝影院91人妻| 天美传媒精品一区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜福利18| 又爽又黄a免费视频| 精品久久国产蜜桃| 搞女人的毛片| 嫁个100分男人电影在线观看| 91字幕亚洲| 校园春色视频在线观看| www.999成人在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩欧美精品免费久久 | 中文字幕免费在线视频6| 国产欧美日韩一区二区三| 国产成人a区在线观看| 亚洲,欧美精品.| 午夜久久久久精精品| 深夜a级毛片| 香蕉av资源在线| 热99re8久久精品国产| 亚洲精品在线美女| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 五月玫瑰六月丁香| 又爽又黄a免费视频| 我的女老师完整版在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 美女免费视频网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲一区高清亚洲精品| 午夜免费成人在线视频| 国产美女午夜福利| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 最新在线观看一区二区三区| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产男靠女视频免费网站| 在线免费观看不下载黄p国产 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 国内精品久久久久久久电影| 久久99热这里只有精品18| 免费观看精品视频网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 悠悠久久av| 精品日产1卡2卡| 精品午夜福利在线看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产欧美日韩一区二区精品| 美女免费视频网站| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品久久国产蜜桃| 国产精品98久久久久久宅男小说| 午夜激情福利司机影院| 高清日韩中文字幕在线| netflix在线观看网站| 久久久久九九精品影院| 久久国产乱子伦精品免费另类| 观看免费一级毛片| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲中文字幕日韩| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 成人美女网站在线观看视频| а√天堂www在线а√下载| 国产高潮美女av| 内地一区二区视频在线| 中文字幕熟女人妻在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 夜夜夜夜夜久久久久| 深夜精品福利| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产免费av片在线观看野外av| 韩国av一区二区三区四区| 免费观看的影片在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产黄色小视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国内精品美女久久久久久| 特大巨黑吊av在线直播| 久久精品综合一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 宅男免费午夜| 欧美精品啪啪一区二区三区| 成人av在线播放网站| 午夜a级毛片| netflix在线观看网站| 国产亚洲精品久久久com| 精华霜和精华液先用哪个| 国产av麻豆久久久久久久| 国产免费一级a男人的天堂| 美女高潮的动态| 免费高清视频大片| 欧美最新免费一区二区三区 | 国产爱豆传媒在线观看| 99热这里只有精品一区| 我要看日韩黄色一级片| av在线蜜桃| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 麻豆国产97在线/欧美| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲av免费在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产成人aa在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 简卡轻食公司| 免费电影在线观看免费观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲av.av天堂| 亚洲国产精品合色在线| 简卡轻食公司| 91麻豆精品激情在线观看国产|