兩個(gè)玉米品種維管束鞘葉綠體的非光化學(xué)淬滅對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

劉文娟，常麗娟，岳麗杰，宋君，張富麗，王東，吳佳蔚，郭靈安，雷紹榮

兩個(gè)玉米品種維管束鞘葉綠體的非光化學(xué)淬滅對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

劉文娟1，常麗娟1，岳麗杰2，宋君1，張富麗1，王東1，吳佳蔚1，郭靈安1，雷紹榮1

（1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，成都 610066；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，成都 610066）

【目的】光系統(tǒng)II的非光化學(xué)葉綠素?zé)晒獯銣缡歉叩戎参镯憫?yīng)環(huán)境變化最快速的光保護(hù)機(jī)制，玉米具備葉肉和維管束鞘2種葉綠體結(jié)構(gòu)，本研究通過比較2個(gè)玉米品種的光合耐旱能力，探究維管束鞘葉綠體的非光化學(xué)淬滅對(duì)玉米耐旱性的意義?！痉椒ā恳猿蓡?0和仲玉3號(hào)2個(gè)玉米品種為研究材料，設(shè)置土壤相對(duì)含水量為70%—80%田間持水量（FWC）（充足澆水，對(duì)照）、50%—60% FWC（中度干旱脅迫）和35%—45% FWC（重度干旱脅迫）3個(gè)土壤水分梯度處理。測(cè)定玉米葉片的水分狀況、葉綠素含量、活性氧積累、質(zhì)膜透性和氣體交換等參數(shù)；應(yīng)用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)顯微成像觀測(cè)，比較玉米葉肉和維管束鞘葉綠體的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和NPQ；通過免疫印跡法，分析玉米葉肉和維管束鞘細(xì)胞光系統(tǒng)II亞基S（PsbS）穩(wěn)態(tài)水平的變化差異；采用藍(lán)-綠膠溫和電泳分離，檢測(cè)玉米光系統(tǒng)II蛋白復(fù)合體的水平?！窘Y(jié)果】干旱脅迫導(dǎo)致葉片氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率下降，2個(gè)玉米品種間沒有明顯差異。但成單30在重度干旱下表現(xiàn)出更好的水分狀況、更低的活性氧損傷以及更高的光合速率。玉米葉肉和維管束鞘葉綠體的NPQ水平及PsbS蛋白含量受干旱誘導(dǎo)明顯上升，維管束鞘中的上升更顯著，成單30表現(xiàn)尤為突出。不同于仲玉3號(hào)光系統(tǒng)II蛋白復(fù)合體水平的下降，重度干旱脅迫后，成單30的捕光蛋白三聚體水平在葉肉和維管束鞘細(xì)胞中均有所升高?！窘Y(jié)論】2個(gè)玉米品種的光合機(jī)構(gòu)對(duì)干旱脅迫的氣孔響應(yīng)能力相當(dāng)，但相較仲玉3號(hào)，成單30的維管束鞘葉綠體具備更優(yōu)越的非光化學(xué)淬滅能力，這對(duì)其更強(qiáng)的非氣孔限制的光合耐旱性具有積極意義。

玉米；干旱脅迫；維管束鞘細(xì)胞；光系統(tǒng)II；非光化學(xué)淬滅

0 引言

【研究意義】光合機(jī)構(gòu)是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫最敏感的部位之一，土壤干旱導(dǎo)致葉片水分虧缺，通過氣孔和非氣孔限制，引起過剩光能對(duì)植物造成一定程度的光抑制，使光合機(jī)構(gòu)受損，光合電子傳遞、光合磷酸化和CO2同化等過程受到影響[1-3]。光系統(tǒng)II（photosystem II，PSII）在高等植物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答中起著重要的作用，研究干旱脅迫下，植物光合機(jī)構(gòu)，尤其是PSII的響應(yīng)機(jī)理，對(duì)提高植物的耐旱能力具有重要意義[4]。當(dāng)植物葉綠體能量平衡發(fā)生改變時(shí)，PSII上激發(fā)能的非光化學(xué)淬滅（non- photochemical quenching，NPQ）是光合膜系統(tǒng)對(duì)過剩光能最快速的分子適應(yīng)機(jī)制，過剩光能通過NPQ以熱能形式耗散，保護(hù)PSII免受光抑制和光損傷[5]。對(duì)光合機(jī)構(gòu)光保護(hù)的有效調(diào)控，可以提高作物的光合效率和產(chǎn)量，為作物田間栽培育種提供有益幫助[6]。玉米是典型的C4植物，葉肉和維管束鞘細(xì)胞中均具備葉綠體結(jié)構(gòu)，光合作用由2種細(xì)胞協(xié)同完成，具有較高的光合效率和較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。探究玉米葉肉和維管束鞘葉綠體中是否均存在光保護(hù)的NPQ機(jī)制，了解NPQ水平對(duì)作物耐旱性的意義，可以為玉米光合耐旱機(jī)理的揭示和田間耐旱品種的選育提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自然條件下，土壤干旱通常伴隨高溫、輻射和營(yíng)養(yǎng)虧缺等其他因子，對(duì)植物的影響復(fù)雜又多方面，氣孔限制和非氣孔限制可能相伴而行，也可能以某種形式占優(yōu)[7]。短期干旱造成的非氣孔限制中，PSII結(jié)構(gòu)和功能的改變包括NPQ的升高[2, 8]，葉綠素合成的調(diào)節(jié)[9]，反應(yīng)中心（reaction center II，RCII）的修復(fù)[2, 10]等，可能是高等植物對(duì)水分虧缺的適應(yīng)性反應(yīng)，防止植物受到光抑制及氧化損傷；而長(zhǎng)期干旱脅迫會(huì)抑制蛋白合成[1]，改變并降低基因轉(zhuǎn)錄[11]，從而影響PSII的功能。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)可以較好地反映PSII結(jié)構(gòu)和功能的變化，逆境脅迫下，耐性作物品種可能具備較高的非光化學(xué)淬滅能力，抵御環(huán)境改變對(duì)PSII的影響，但由于光合器官響應(yīng)環(huán)境變化的機(jī)制不同，也存在相反的研究結(jié)果[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】玉米維管束鞘葉綠體中PSII蛋白復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)，為其光合機(jī)理的研究提供了新的思路[14-16]，盡管相較葉肉細(xì)胞，維管束鞘細(xì)胞中PSII含量很少，但其結(jié)構(gòu)組成與葉肉中相似[15-16]，會(huì)發(fā)生光強(qiáng)誘導(dǎo)的周轉(zhuǎn)[16]，也可能存在光能調(diào)節(jié)耗散和蛋白修復(fù)循環(huán)的光保護(hù)機(jī)制，但目前尚未有試驗(yàn)證實(shí)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對(duì)干旱脅迫下2個(gè)玉米品種葉片水分狀況和光合能力的比較，發(fā)現(xiàn)成單30響應(yīng)非氣孔限制的光合耐旱性更強(qiáng)，進(jìn)一步分析2種玉米葉肉和維管束鞘細(xì)胞中PSII的非光化學(xué)淬滅和蛋白復(fù)合體水平在干旱脅迫下的變化，以期了解玉米維管束鞘葉綠體是否存在過剩激發(fā)能的NPQ機(jī)制，明晰葉肉和維管束鞘葉綠體的NPQ水平受干旱誘導(dǎo)變化的差異，探究維管束鞘細(xì)胞的非光化學(xué)淬滅對(duì)玉米光合耐旱能力的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米（L.）品種為成單30和仲玉3號(hào)，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.2 材料種植與干旱脅迫處理

試驗(yàn)于2018年在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高技術(shù)育種基地和四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試玉米材料于基地溫室盆栽（60 cm×20 cm×16 cm）種植，播種時(shí)間為4月11日。試驗(yàn)所用土壤為基地大田土，土壤類型為砂壤土，pH 6.2—6.9，偏酸性。土壤有機(jī)質(zhì)含量18.7 g·kg-1，堿解氮157 mg·kg-1，有效磷9.7 mg·kg-1，速效鉀177 mg·kg-1。播種前施用腐殖酸型水溶復(fù)合肥0.12 kg·m-2（N-P2O5-K2O=10-4-6≥20，腐殖酸≥3%）。為保證植株生長(zhǎng)條件和干旱脅迫程度的一致性，試驗(yàn)盆中盛裝相同重量的供試土壤，且同一試驗(yàn)盆內(nèi)分區(qū)域同時(shí)種植2個(gè)品種的玉米材料。

玉米營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的6葉期（V6）至14葉期（V14），對(duì)高溫、強(qiáng)光、干旱等影響后期籽粒數(shù)和穗大小的逆境脅迫較為敏感，并且苗期的耐旱性可以反映玉米品種的綜合耐旱能力[17]。因此，本試驗(yàn)中，在玉米生長(zhǎng)的V6期開始通過土壤自然控水進(jìn)行干旱脅迫處理。干旱脅迫參照張仁和等[12]和郭艷陽等[18]，設(shè)置3個(gè)處理，分別為中度干旱脅迫（moderate drought stress，MS），50%—60%的田間持水量（field water capacity，F(xiàn)WC）；重度干旱脅迫（severe drought stress，SS），35%—45% FWC；充足澆水（70%—80% FWC）為對(duì)照。供試土壤的FWC為87.83%。每個(gè)處理設(shè)置4次重復(fù)。于開始干旱后的每隔2 d，通過烘干稱重法測(cè)定各處理組土壤的相對(duì)含水量。到達(dá)設(shè)置的干旱脅迫程度后，通過每天稱量盆重保持土壤水分狀況[19]，干旱持續(xù)7 d取倒數(shù)第一片完全展開葉測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 葉片水分狀況和葉綠素含量測(cè)定 玉米葉片水分狀況通過測(cè)定相對(duì)含水量（relative water content，RWC）反映。稱取1.0 g玉米葉片，稱量鮮重（Wf）；將葉片放入蒸餾水中浸泡至恒重，稱量飽和鮮重（Wt）；浸泡后的葉片于80—90℃下烘干至恒重，稱量干重（Wd）。葉片相對(duì)含水量通過公式RWC =（Wf-Wd）/（Wt - Wd）×100計(jì)算。

玉米葉片葉綠素含量根據(jù)舒展等[20]的方法，將打孔器制備的1 cm2葉圓片剪成細(xì)絲后，用80%丙酮浸提過夜，在645 nm和663 nm波長(zhǎng)下測(cè)量浸提液吸光值，葉綠素a（Chl a）（μg·mL-1）=12.7 A663-2.69 A645，葉綠素b（Chl b）（μg·mL-1）=22.9 A645-4.68 A663?？?cè)~綠素含量Chl a+b （μg·dm-2）=（Chl a+Chl b）×0.5/S，式中，S為用于提取葉綠素的葉片面積（cm2）。

1.3.2 葉片活性氧測(cè)定 測(cè)定玉米葉片的超氧陰離子自由基（O2-）和過氧化氫（H2O2）的含量。O2-含量通過商品化試劑盒（泉州市科諾迪生物科技有限公司，中國(guó)），采用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)；H2O2含量通過商品化試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國(guó)），采用分光光度計(jì)方法檢測(cè)。

1.3.3 葉片質(zhì)膜透性檢測(cè) 測(cè)定葉片相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，反映質(zhì)膜透性。使用電導(dǎo)率儀（DDS-307，成都瑞馳分析控制儀器有限公司，中國(guó)）測(cè)定葉片的相對(duì)電導(dǎo)率。采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測(cè)定葉片MDA含量。

1.3.4 葉片氣體交換測(cè)定 采用開放式光合作用儀（CIRAS-3，PP system，英國(guó)）測(cè)量玉米葉片的氣體交換參數(shù)，包括氣孔導(dǎo)度（s）、蒸騰速率（）、胞間CO2濃度（i）和凈光合速率（）。測(cè)量光強(qiáng)為300 μmol·m-2·s-1的人工光源。

1.3.5 葉片葉綠素?zé)晒怙@微觀測(cè) 采用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)顯微成像分析系統(tǒng)（chlorophyll fluorescence kinetic microscope，F(xiàn)KM）（Micro-FluorCam FC2000，Photon Systems Instruments，捷克）測(cè)定玉米葉肉和維管束鞘細(xì)胞PSII的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，包括最大光化學(xué)效率Fv/Fm和非光化學(xué)淬滅NPQ。將玉米葉片切成細(xì)絲，以橫切面放置于40×物鏡下，通過470 nm藍(lán)光激發(fā)后，采用FKM在695—770 nm下進(jìn)行葉綠素?zé)晒怙@微成像觀測(cè)。熒光成像完成后，采用FKM分析軟件，標(biāo)定區(qū)域?qū)θ~肉和維管束鞘細(xì)胞的熒光參數(shù)進(jìn)行分析。

1.3.6 類囊體膜蛋白的提取分離 玉米葉肉和維管束鞘細(xì)胞類囊體膜蛋白的提取分離參照Romanowska等[21]的方法。提取過程在4℃弱光下進(jìn)行，提取緩沖液為50 mmol·L-1HEPES-NaOH（pH 8.0），5 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1NaF，0.2%（w/v）BSA，采用機(jī)械分離法分離葉肉和維管束鞘類囊體膜蛋白，將分離后的樣品迅速凍存于-80℃?zhèn)溆谩Ｍㄟ^測(cè)量2種類囊體膜蛋白中葉綠素a/b比率（Chl a/b），檢驗(yàn)分離純度。

1.3.7 尿素-SDS-PAGE電泳和Western雜交分析 參照Pokorska等[16]的方法，稍加改進(jìn)。分離后的玉米葉肉和維管束鞘類囊體膜蛋白中加入含0.05 mol·L-1Tris-HCl（pH 6.8），5%（w/v）SDS，8 mol·L-1尿素，5%（v/v）β-巰基乙醇和20%（v/v）甘油的樣品緩沖液，通過加入3 mol·L-1尿素15%分離膠的尿素-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（尿素-SDS-PAGE）分離，各處理組樣品以相同葉綠素含量（葉肉細(xì)胞1.0 μg，維管束鞘細(xì)胞1.5 μg）上樣。

電泳分離后的蛋白，電轉(zhuǎn)儀到PVDF膜（Immobilon，Millipore，美國(guó)）上，通過特異抗體（Agrisera，瑞典）的免疫印跡（Western blotting），分析蛋白的穩(wěn)態(tài)水平。Western blotting信號(hào)通過化學(xué)發(fā)光法（ECL，GE Healthcare，英國(guó)）檢測(cè)，定量結(jié)果通過Lane 1D凝膠軟件（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，中國(guó)）分析。相同上樣量電泳的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果作為參照。

1.3.8 藍(lán)-綠膠溫和電泳 參照Pokorska等[16]的方法，略有改進(jìn)，對(duì)分離后的玉米葉肉和維管束鞘細(xì)胞中類囊體膜蛋白復(fù)合體進(jìn)行非變性的藍(lán)-綠膠溫和電泳（Blue native PAGE，BN-PAGE）分析。15 μg葉綠素含量的類囊體膜蛋白在4°C，7 000×下離心5 min后，重溶于25 mmol·L-1BisTris-HCl（pH 7.0），20%（v/v）甘油中，加入十二烷基-β-D-麥芽糖苷（DDM）增溶，使其在葉肉和維管束鞘類囊體膜蛋白溶液中的終濃度分別為1%和2%。增溶后的蛋白溶液在4 °C，18 000×下離心15 min后，上清液中加入含5%（w/v）考馬斯亮藍(lán)G250，100 mmol·L-1BisTris-HCl（pH 7.0），30%（w/v）蔗糖，500 mmol·L-1氨基己酸的樣品緩沖液，于4%—12%丙烯酰胺梯度膠電泳下分離。電泳分離后的凝膠照相后，參照Witting等[22]的方法，對(duì)分離條帶進(jìn)行特異抗體的免疫印記分析，蛋白復(fù)合體定量結(jié)果通過Lane 1D凝膠軟件分析。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用Duncan’s新復(fù)極差法的單因素方差分析，評(píng)估1個(gè)玉米品種在不同程度干旱脅迫下的差異；采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，評(píng)估相同干旱脅迫程度下，2個(gè)玉米品種間的差異。

2 結(jié)果

2.1 干旱脅迫對(duì)2個(gè)玉米品種葉片水分狀況、葉綠素含量、活性氧積累和質(zhì)膜透性的影響

通過土壤自然控水對(duì)成單30和仲玉3號(hào)玉米進(jìn)行不同程度的干旱脅迫處理，包括充足澆水對(duì)照（CK），中度干旱脅迫（MS）和重度干旱脅迫（SS）。如圖1所示，玉米葉片相對(duì)含水量（RWC）隨干旱脅迫發(fā)生持續(xù)下降，重度干旱脅迫導(dǎo)致葉片葉綠素含量降低，O2-和H2O2明顯積累，質(zhì)膜透性顯著增加，2個(gè)玉米品種的表現(xiàn)存在差異。重度干旱脅迫后，成單30和仲玉3號(hào)的RWC較對(duì)照分別下降了26.07%和35.62%（圖1-B）；相較成單30較穩(wěn)定的葉綠素含量，仲玉3號(hào)的葉綠素水平受干旱脅迫影響下降更明顯（圖1-C）；干旱脅迫會(huì)造成植物葉片活性氧（reactive oxygen species，ROS）（包括O2-，1O2，H2O2，.OH等）的積累，如圖1-D和圖1-E所示，重度干旱脅迫下，成單30 中O2-和H2O2含量較對(duì)照升高了213.99%和215.21%，仲玉3號(hào)中O2-和H2O2含量較對(duì)照升高了444.40%和264.60%，干旱導(dǎo)致仲玉3號(hào)中ROS的積累更顯著；ROS積累造成膜脂過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜透性增加，相較成單30，仲玉3號(hào)葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量在干旱脅迫后上升更明顯（圖1-F和圖1-G）；干旱脅迫后，仲玉3號(hào)的葉片表型較成單30更萎蔫（圖1-A）。

2.2 2個(gè)玉米品種葉片的氣體交換對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

干旱脅迫導(dǎo)致玉米葉片氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率下降，下降程度在2個(gè)品種間沒有明顯差異（圖2-A，B）；中度干旱脅迫沒有造成葉片胞間CO2濃度的明顯變化，但重度干旱脅迫下，2個(gè)玉米品種的胞間CO2濃度均明顯增加，相較成單30，仲玉3號(hào)的增加程度更為顯著（圖2-C）；干旱脅迫造成玉米葉片凈光合速率下降，中度和重度干旱脅迫下，成單30的凈光合速率較對(duì)照分別下降了22.55%和73.79%，仲玉3號(hào)下降了34.20%和87.08%，仲玉3號(hào)的凈光合速率受干旱抑制更為明顯（圖2-D）。

2.3 干旱脅迫下2個(gè)玉米品種維管束鞘葉綠體的NPQ水平變化

葉綠素?zé)晒怙@微成像結(jié)果（圖3-A和圖4-A）顯示，干旱脅迫，尤其是重度干旱脅迫，導(dǎo)致玉米葉片中葉肉和維管束鞘細(xì)胞組成的“花環(huán)”結(jié)構(gòu)排列發(fā)生一定程度松散，在仲玉3號(hào)中表現(xiàn)尤為明顯。

A：表型觀察；B：相對(duì)含水量（RWC）；C：葉綠素a+b（Chl a+b）含量；D：超氧陰離子（O2-）含量；E：過氧化氫（H2O2）含量；F：相對(duì)電導(dǎo)率；G：丙二醛（MDA）含量。CK，充足澆水對(duì)照；MS，中度干旱脅迫；SS，重度干旱脅迫。誤差線代表4次測(cè)量平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。不同小寫字母表示一個(gè)玉米品種在不同程度干旱脅迫下，P＜0.05時(shí)有顯著性差異。*和**分別表示2個(gè)玉米品種間在相同程度干旱脅迫下，P＜0.05和P＜0.01時(shí)有顯著性差異。下同

葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，F(xiàn)v/Fm表示PSII的最大光能轉(zhuǎn)換效率，是反映植物光抑制程度最常用的指標(biāo)。如圖3-B所示，中度干旱脅迫沒有造成葉肉葉綠體中Fv/Fm的明顯變化，但重度干旱脅迫下，葉肉葉綠體中Fv/Fm水平顯著下降，其中，仲玉3號(hào)的下降程度較成單30更為明顯，表明仲玉3號(hào)葉肉細(xì)胞中PSII的光能轉(zhuǎn)換受干旱抑制更為顯著。維管束鞘葉綠體的Fv/Fm在中度干旱脅迫下即發(fā)生明顯降低，與葉肉細(xì)胞中表現(xiàn)一致，干旱脅迫對(duì)仲玉3號(hào)維管束鞘葉綠體Fv/Fm的影響更明顯。

圖4顯示，隨著干旱脅迫程度的加重，玉米葉肉和維管束鞘葉綠體的NPQ水平均逐漸升高，其中，維管束鞘中的升高更為顯著（圖4-B）。2個(gè)品種間比較，重度干旱脅迫下，成單30葉肉葉綠體的NPQ水平較仲玉3號(hào)升高程度更明顯，其維管束鞘葉綠體的NPQ水平在充足澆水時(shí)較仲玉3號(hào)高，干旱脅迫發(fā)生后，NPQ的上升也較仲玉3號(hào)更顯著。

A：氣孔導(dǎo)度（gs）；B：蒸騰速率（E）；C：胞間CO2濃度（Ci）；D：凈光合速率（A）

2.4 干旱脅迫對(duì)2個(gè)玉米品種PsbS蛋白穩(wěn)態(tài)水平的影響

根據(jù)Romanowska和Parys的方法描述，分離了葉肉細(xì)胞的維管束鞘類囊體膜蛋白中Chl a/b應(yīng)高于4.5[21]。本試驗(yàn)對(duì)2個(gè)玉米品種的葉肉和維管束鞘類囊體膜蛋白進(jìn)行機(jī)械分離，測(cè)定2種類囊體中Chl a/b分別為2.62—3.25和4.70—4.90，表明蛋白分離結(jié)果有效。

類囊體膜蛋白提取分離后，特異抗體的免疫印跡分析結(jié)果（圖5）顯示，干旱脅迫導(dǎo)致玉米2種類型細(xì)胞中PSII亞基S（PsbS）蛋白穩(wěn)態(tài)水平均有所升高，維管束鞘細(xì)胞中的升高更顯著。比較2個(gè)玉米品種，充足澆水時(shí)，成單30維管束鞘細(xì)胞PsbS蛋白穩(wěn)態(tài)水平較仲玉3號(hào)更高，干旱脅迫后PsbS蛋白增加也更明顯；重度干旱脅迫下，成單30 2種細(xì)胞中PsbS蛋白含量均明顯高于仲玉3號(hào)，維管束鞘尤為顯著，2個(gè)品種較充足澆水對(duì)照分別增加了159.52%和127.32%。

2.5 干旱脅迫對(duì)2個(gè)玉米品種PSII蛋白復(fù)合體的影響

類囊體膜上，PSII以二聚體和單體形式存在。PSII二聚體連接至少2個(gè)LHCII三聚體，組成PSII-LHCII超復(fù)合體（PSII-LHCII supercomplexes）發(fā)揮功能。類囊體膜蛋白復(fù)合體的BN-PAGE電泳結(jié)果（圖6）顯示，與前人研究結(jié)果一致，玉米葉肉和維管束鞘細(xì)胞中PSII蛋白復(fù)合體組成類似，包括PSII-LHCII超復(fù)合體、PSII二聚體和單體以及LHCII三聚體和單體[15-16]。重度干旱脅迫導(dǎo)致PSII-LHCII超復(fù)合體發(fā)生一定程度的解聚，葉肉細(xì)胞中更為明顯。仲玉3號(hào)葉肉細(xì)胞中，PSII二聚體和單體以及LHCII三聚體和單體水平均受干旱脅迫誘導(dǎo)明顯下降，但成單30葉肉細(xì)胞中LHCII三聚體水平則在重度干旱脅迫后有所上升（圖6-C）；維管束鞘細(xì)胞中蛋白復(fù)合體水平較葉肉細(xì)胞穩(wěn)定，重度干旱脅迫下，成單30的維管束鞘細(xì)胞也發(fā)生LHCII三聚體水平的升高（圖6-D）。

A：葉肉和維管束鞘葉綠體NPQ成像；B：葉肉和維管束鞘葉綠體NPQ數(shù)據(jù)分析

A：葉肉細(xì)胞PsbS蛋白免疫印跡（1.0 μg葉綠素）；B：維管束鞘細(xì)胞PsbS蛋白免疫印跡（1.5 μg葉綠素）；C：葉肉細(xì)胞PsbS蛋白免疫印跡數(shù)據(jù)分析（充足澆水條件下成單30葉肉細(xì)胞的PsbS蛋白水平定義為100%）；D：維管束鞘細(xì)胞PsbS蛋白免疫印跡數(shù)據(jù)分析（充足澆水條件下成單30維管束鞘細(xì)胞的PsbS蛋白水平定義為100%）。蛋白樣品的考馬斯亮藍(lán)染色（CBS）結(jié)果作為參照

3 討論

本文選擇成單30和仲玉3號(hào)2個(gè)玉米品種，通過對(duì)不同程度干旱脅迫下玉米葉片水分生理、光合水平以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的分析，比較了2種玉米在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的光合耐旱能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)設(shè)置的中度干旱脅迫沒有顯著影響玉米葉片細(xì)胞膜的完整性和PSII的光能轉(zhuǎn)換效率，氣孔因素是中度干旱脅迫下玉米CO2同化速率下降的主要原因。成單30和仲玉3號(hào)的氣孔導(dǎo)度及蒸騰速率的下降程度沒有明顯差異，表明2種玉米對(duì)干旱脅迫的氣孔響應(yīng)能力相似。而重度干旱脅迫下，相較成單30，仲玉3號(hào)葉片的色素水平、ROS積累以及PSII光能轉(zhuǎn)換受干旱影響更為明顯，胞間CO2濃度上升更為顯著，凈光合速率下降更為嚴(yán)重，顯示干旱脅迫對(duì)仲玉3號(hào)光合效率的非氣孔限制較成單30更顯著，成單30的耐旱性更強(qiáng)。

當(dāng)2個(gè)玉米品種的光合機(jī)構(gòu)對(duì)干旱脅迫的氣孔響應(yīng)能力相當(dāng)時(shí)，非氣孔限制下的光保護(hù)能力可能對(duì)玉米的耐旱性具有重要意義。NPQ是PSII響應(yīng)環(huán)境變化最快速的保護(hù)機(jī)制，玉米的葉肉和維管束鞘細(xì)胞中均含有葉綠體，分別考量2種類型葉綠體中NPQ水平對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，是本文的研究重點(diǎn)。由于葉肉細(xì)胞致密包裹在維管束鞘細(xì)胞周圍，因此以完整葉片為對(duì)象的葉綠素?zé)晒夥治?，無法測(cè)量玉米維管束鞘葉綠體的葉綠素?zé)晒鈁16]；葉綠素?zé)晒獾捏w外測(cè)量，其準(zhǔn)確性也可能受到葉肉和維管束鞘葉綠體的提取過程和分離純度影響。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)顯微成像（FKM）目前主要應(yīng)用于藻類研究[23]，最近也有用以分析植物維管束鞘葉綠素?zé)晒獾膱?bào)道[24]。本研究中，采用FKM技術(shù)比較了干旱脅迫下玉米2種細(xì)胞中的葉綠素?zé)晒庾兓?，不僅在維管束鞘細(xì)胞中檢測(cè)到NPQ，并且發(fā)現(xiàn)，與葉肉細(xì)胞中相同，隨著干旱脅迫程度的加重，維管束鞘細(xì)胞中NPQ水平顯著上升。更加值得注意的是，相較葉肉細(xì)胞，維管束鞘NPQ受干旱誘導(dǎo)升高趨勢(shì)更明顯，表明該細(xì)胞中可能具有更優(yōu)越的過剩光能的非光化學(xué)淬滅能力。并且，耐旱性更強(qiáng)的成單30NPQ水平高于仲玉3號(hào)，維管束鞘中更為突出，進(jìn)一步提示維管束鞘葉綠體的NPQ機(jī)制可能對(duì)玉米非氣孔限制的光合耐旱能力有積極的意義。

NPQ精準(zhǔn)的淬滅位點(diǎn)和淬滅機(jī)制，目前尚有爭(zhēng)議[25]，最近的研究結(jié)果推斷，其發(fā)生至少需要3個(gè)因素，分別為類囊體內(nèi)腔質(zhì)子梯度（ΔpH），LHCII以及PsbS蛋白[26]。由于在NPQ機(jī)制中的開關(guān)（switch）作用，PsbS蛋白被稱為植物的光保護(hù)蛋白。研究表明，PsbS蛋白的表達(dá)受光強(qiáng)變化調(diào)控[27]；其含量會(huì)顯著影響NPQ中能量依賴性淬滅（energy-dependent quenching，qE）的水平[6]；相較過表達(dá)PsbS的突變體，缺失PsbS蛋白的擬南芥在強(qiáng)光照射下光抑制程度更明顯[28]。這些都為逆境下提高植物的光保護(hù)能力提供思路[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫誘導(dǎo)玉米PsbS蛋白穩(wěn)態(tài)水平升高，這與之前在擬南芥[8]和小麥[13]中的發(fā)現(xiàn)一致，更重要的是，維管束鞘細(xì)胞中PsbS的升高更顯著，成單30中尤為明顯，體現(xiàn)出與NPQ水平一致的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步反映成單30維管束鞘細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的過剩光能非光化學(xué)淬滅能力。我們之前的研究表明，干旱脅迫下非氣孔限制會(huì)造成PSII-LHCII超復(fù)合體解聚，PSII蛋白水平下調(diào)，進(jìn)一步降低光能轉(zhuǎn)換效率和CO2同化速率[3, 8, 10]。本研究發(fā)現(xiàn)，重度干旱脅迫下玉米PSII蛋白復(fù)合體水平下降，葉肉細(xì)胞中更為明顯。有趣的是，耐旱能力更強(qiáng)的成單30，LHCII三聚體水平在重度干旱脅迫下發(fā)生一定程度的升高，由于LHCII被推測(cè)可能是非光化學(xué)淬滅的位點(diǎn)[26]，因此該現(xiàn)象是否與成單30更強(qiáng)的NPQ能力相關(guān)，值得進(jìn)一步探索。

玉米維管束鞘中更優(yōu)越的NPQ能力與細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)聯(lián)，值得探討。玉米的光合作用由2種細(xì)胞協(xié)同完成，維管束鞘細(xì)胞具有無機(jī)碳的濃縮機(jī)制，是CO2同化的主要場(chǎng)所[30]。研究證實(shí)，光能過剩時(shí)，至少部分非光化學(xué)淬滅，為阻止PSII中ROS釋放而被調(diào)控[31-32]。因此，維管束鞘細(xì)胞的NPQ機(jī)制，一定程度上可能通過抑制ROS的積累，保持細(xì)胞膜的完整，有利于維持維管束鞘中CO2的濃度和同化速率，對(duì)逆境下玉米的光合效率有益。此外，維管束鞘細(xì)胞連接葉肉細(xì)胞與維管組織，其結(jié)構(gòu)的完整和功能的穩(wěn)定，對(duì)干旱脅迫下植物葉片水分和營(yíng)養(yǎng)的保持與疏導(dǎo)，也具有重要意義。這一點(diǎn)表現(xiàn)在無論是中度還是重度干旱脅迫下，相較仲玉3號(hào)，成單30的葉片水分狀況均更好。

4 結(jié)論

通過葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)顯微觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)玉米葉肉和維管束鞘葉綠體中均存在過剩光能的非光化學(xué)淬滅（NPQ）。比較2個(gè)玉米品種，相較仲玉3號(hào)，成單30非氣孔響應(yīng)的光合耐旱性更強(qiáng)，其葉綠體，尤其是維管束鞘葉綠體的NPQ水平更高。干旱脅迫下，2種葉綠體中NPQ水平的上升均伴隨著光保護(hù)蛋白PsbS含量的增加，但成單30維管束鞘細(xì)胞中PsbS的增加更明顯，與NPQ的變化趨勢(shì)一致，提示PsbS蛋白可能具備輔助葉綠素?zé)晒獾葏?shù)，作為耐旱作物選育分子標(biāo)記的可行性。

[1] YUAN S, LIU W J, ZHANG N H, WANG M B, LIANG H G, LIN H H. Effects of water stress on major PSII gene expression and protein metabolism in barley leaves., 2005, 125(4): 464-473.

[2] LIU W J, CHEN Y E, TIAN W J, DU J B, ZHANG Z W, XU F, ZHANG F, YUAN S, LIN H H. Dephosphorylation of photosystem II proteins and phosphorylation of CP29 in barley photosynthetic membranes as a response to water stress., 2009, 1787(10): 1238-1245.

[3] CAMPOSA H, TREJOB C, PE?A-VALDIVIA C B, GARCIA-NAVA R, CONDE-MARTINEZ F V, CRUZ-ORTEGA M R. Stomatal and non-stomatal limitations of bell pepper (L.) plants under water stress and re-watering: Delayed restoration of photosynthesis during recovery., 2014, 98(1): 56-64.

[4] KRAMER D M, EVANS J R. The importance of energy balance in improving photosynthetic productivity., 2011, 155(1): 70-78.

[5] TIKKANEN M, ARO E M. Thylakoid protein phosphorylation in dynamic regulation of photosystem II in higher plants., 2012, 1817(1): 232-238.

[6] KROMDIJK J, GLOWACKA K, LEONELLI L, GABILLY S T, IWAI M, NIYOGI K K, LONG S P. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection., 2016, 354(6314): 857-861.

[7] GRIFFITHS H, PARRY M. Plant responses to water stress., 2002, 89(7): 801-802.

[8] CHEN Y E, LIU W J, SU Y Q, CUI J M, ZHANG Z W, YUAN M, ZHANG H Y, YUAN S. Different response of photosystem II to short and long term drought stress in., 2016, 158(2): 225-235.

[9] VIRGIN H I. Chlorophyll formation and water deficit., 1965, 18(4): 994-1000.

[10] BAENA-GONZALEZ E, BARBATO R, ARO E M. Role of phosphorylation in the repair cycle and oligomeric structure of photosystem II., 1999, 208(2): 196-204.

[11] LIU W J, YUAN S, ZHANG N H, LEI T, DUAN H G, LIANG H G, LIN H H. Effect of water stress on photosystem 2 in two wheat cultivars., 2006, 50(4): 597-602.

[12] 張仁和, 鄭友軍, 馬國(guó)勝, 張興華, 路海東, 史俊通, 薛吉全. 干旱脅迫對(duì)玉米苗期葉片光合作用和保護(hù)酶活性的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 31(5): 1303-1311.

ZHANG R H, ZHENG Y J, MA G S, ZHANG X H, LU H D, SHI J T, XUE J Q. Effect of drought stress on photosynthetic traits and protective enzyme activity in maize seeding., 2011, 31(5): 1303-1311. (in Chinese)

[13] CHEN Y E, SU Y Q, ZHANG C M, MA J, MAO H T, YANG Z H, YUAN M, ZHANG Z W, YUAN S, Zhang H Y. Comparison of photosynthetic characteristics and antioxidant systems in different wheat strains., 2018, 37(2): 347-359.

[14] ROMANOWSKA E, DROZAK A, POKORSKA B, SHIELL B J, MICHALSKI W P. Organization and activity of photosystems in the mesophyll and bundle sheath chloroplasts of maize., 2006, 163(6): 607-618.

[15] ROMANOWSKA E, KARGUL J, POWIKROWSKA M, FINAZZI G, NIELD J, DROZAK A, POKORSKA B. Structural organization of photosynthetic apparatus in agranal chloroplasts of maize., 2008, 283(38): 26037-26046.

[16] POKORSKA B, ZIENKIEWICZ M, POWIKROWSKA M, DROZAK A, ROMANOWSKA E. Differential turnover of the photosystem II reaction centre D1 protein in mesophyll and bundle sheath chloroplasts of maize., 2009, 1787(10): 1161-1169.

[17] 裴英杰, 鄭家玲, 庾紅, 王金勝, 丁起盛, 郭棟生, 郭春絨. 用于玉米品種抗旱性鑒定的生理生化指標(biāo). 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 1992, 7(1): 31-35.

PEI Y J, ZHENG J L, YU H, WANG J S, DING Q S, GUO D S, GUO C R. The indexes of physiology and biochemistry used for appraisal and level determination of drought resistance in maize., 1992, 7(1): 31-35. (in Chinese)

[18] 郭艷陽, 劉佳, 朱亞利, 柏延文, 李紅杰, 薛吉全, 張仁和. 玉米葉片光合和抗氧化酶活性對(duì)干旱脅迫的響應(yīng). 植物生理學(xué)報(bào), 2018, 54(12): 1839-1846.

GUO Y Y, LIU J, ZHU Y L, BAI Y W, LI H J, XUE J Q, ZHANG R H. Responses of photosynthetic and antioxidant enzyme activities in maize leaves to drought stress., 2018, 54(12): 1839-1846. (in Chinese)

[19] 劉亞, 丁俊強(qiáng), 蘇巴錢德, 廖登群, 趙久然, 李建生. 基于遠(yuǎn)紅外熱成像的葉溫變化與玉米苗期耐旱性的研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(6): 2192-2201.

LIU Y, DING J Q, SUBHASH C, LIAO D Q, ZHAO J R, LI J S. Identification of maize drought-tolerance at seeding stage based on leaf temperature using infrared thermography., 2009, 42(6): 2192-2201. (in Chinese)

[20] 舒展, 張曉素, 陳娟, 陳根云, 許大全. 葉綠素含量測(cè)定的簡(jiǎn)化. 植物生理學(xué)通訊, 2010, 46 (4): 399-402.

SHU Z, ZHANG X S, CHEN J, CHEN G Y, XU D Q. The simplification of chlorophyll content measurement., 2010, 46 (4): 399-402. (in Chinese)

[21] ROMANOWSKA E, PARYS E. Mechanical isolation of bundle sheath cell strands and thylakoids from leaves of C4grasses., 2011, 684: 327-337.

[22] WITTIG I, BRAUN H P, SCH?GGER H. Blue native PAGE., 2006, 1(1): 418-428.

[23] FERIMAZOVA N, FELCMANOVá K, ?ETLíKOVá E, KüPPER H, MALDENER I, HAUSKA G, ?EDIVá B, PRá?IL O. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigatedat single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy., 2013, 116(1): 79-91.

[24] GORECKA M, ALVAREZ-FERNANDEZ R, SLATTERY K, MCAUSLAND L, DAVEY P A, KARPINSKI S, LAWSON T, MULLINEAUX P M. Abscisic acid signalling determines susceptibility of bundle sheath cells to photoinhibition in high light-exposedleaves., 2014, 369(1640): 20130234.

[25] DUFFY C D P, RUBAN A V. Dissipative pathways in the photosystem-II antenna in plants., 2015, 152: 215-226.

[26] RUBAN, ALEXANDER V. Nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage., 2016, 170(4): 1903-1916.

[27] BALLOTTARI M, DALL'OSTO L, MOROSINOTTO T, BASSI R. Contrasting behavior of higher plant photosystem I and II antenna systems during acclimation., 2007, 282(12): 8947-8958.

[28] ROACH T, KRIEGER-LISZKAY A. The role of the PsbS protein in the protection of photosystems I and II against high light in., 2012, 1817(12): 2158-2165.

[29] GLOWACKA K, KROMDIJK J, KUCERA K, XIE J Y, CAVANAGH A P, LEONELLI L, LEAKEY A D B, ORT D R, NIYOGI K K, LONG T P. Photosystem II ubnit S overexpression increases the efficiency of water use in a field-grown crop., 2018, 9(1): 868.

[30] EL-SHARKAWY M A. Pioneering research on C4leaf anatomical, physiological, and agronomic characteristics of tropical monocot and dicot plant species: Implications for crop water relations and productivity in comparison to C3cropping systems., 2009, 47(2): 163-183.

[31] WARE M A, BELGIO E, RUBAN A V. Comparison of the protective effectiveness of NPQ inplants deficient in PsbS protein and zeaxanthin., 2015, 66(5): 1259-1270.

[32] ZULFUGAROV I S, TOVUU A, EU Y J, DOGSOM B, POUDYAL R S, NATH K, HALL M, BANERJEE M, YOON U C, MOON Y H, AN G, JANSSON S, LEE C H. Production of superoxide from Photosystem II in a rice (L.) mutant lacking PsbS., 2014, 14(1): 242.

Response of non-photochemical quenching in bundle sheath chloroplasts of two maize hybrids to drought stress

LIU WenJuan1, CHANG LiJuan1, YUE LiJie2, SONG Jun1, ZHANG FuLi1, WANG Dong1, Wu jiaWei1, GUO LingAn1, LEI ShaoRong1

(1Center of Analysis and Testing, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066;2Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066)

【Objective】 Non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching (NPQ) of photosystem II (PSII) is the most rapid photoprotective mechanism of higher plants that responds to a changing environment. Maize has two distinctly different classes of chloroplasts in mesophyll and bundle sheath cells. In the present study, the drought tolerance of two maize hybrids was compared to explore the significance of non-photochemical quenching in bundle sheath chloroplasts to maize tolerance. 【Method】 The experiment was conducted with two maize hybrids, Chengdan 30 and Zhongyu 3, and consisted of three soil moisture regimes, including 70%-80% of field water capacity (FWC) (sufficient irrigation), 50%-60% FWC (moderate drought stress), and 35%-45% FWC (severe drought stress). Physiological and biochemical parameters of maize leaves, including relative water content, chlorophyll contents, reactive oxygen species (ROS) accumulation, lipid peroxidation, and gas exchange, were measured. Fv/Fm and NPQ of PSII in mesophyll and bundle sheath chloroplasts of two maize hybrids were investigated through a chlorophyll fluorescence kinetic microscope. The steady-state levels of PSII subunit S (PsbS) in mesophyll and bundle sheath cells were analyzed using method of western blotting. PSII complexes levels were detected by blue native PAGE. 【Result】 The stomatal conductance and transpiration rate of maize leaves decreased under drought stress. There were no remarkably difference in decline degree of stomatal index between Chengdan 30 and Zhongyu 3. However, under severe drought conditions, Chengdan 30 showed better leaf water status, lower ROS damages, and higher photosynthetic efficiency compared with Zhongyu 3. NPQ levels and PsbS contents in bundle sheath chloroplasts increased more markedly than that in mesophyll chloroplasts when maize plant suffered with drought treatment, which was especially outstanding in Chengdan 30. The PSII complexes contents of Zhongyu 3 reduced obviously under drought stress, while the steady-state levels of light-harvesting complex II (LHCII) trimer of Chengdan 30 enhanced after severe drought. 【Conclusion】 The responses of photosynthetic mechanism to stomatal limitation were no significant difference in two maize hybrids under drought stress. However, compared with Zhongyu 3, Chengdan 30 had a higher non-photochemical quenching capacity in bundle sheath chloroplasts, which might play a positive influence on its superior drought tolerance of non-stomatal limitation.

maize; drought stress; bundle sheath cells; photosystem II; non-photochemical quenching

2019-09-04；

2019-12-11

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目“應(yīng)用基礎(chǔ)研究”（2018JY0153）、四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年領(lǐng)軍人才研究基金（2019LJRC025）、四川省財(cái)政基因工程青年基金項(xiàng)目（2018QNJJ-023）

劉文娟，E-mail：lwj19790628@sina.com

（責(zé)任編輯 楊鑫浩）