廣東梅州柑橘黃龍病和病毒病的發(fā)生調(diào)查及其黃龍病菌原噬菌體多樣性

崔一平，彭埃天，宋曉兵，程保平，凌金鋒，陳霞

廣東梅州柑橘黃龍病和病毒病的發(fā)生調(diào)查及其黃龍病菌原噬菌體多樣性

崔一平，彭埃天，宋曉兵，程保平，凌金鋒，陳霞

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

【目的】調(diào)查柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）和病毒病在廣東省梅州市柑橘主產(chǎn)區(qū)的危害情況，分析該地區(qū)柑橘黃龍病菌（CLas）的原噬菌體多樣性?！痉椒ā恳?6S rDNA為模板設(shè)計(jì)引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR)檢測(cè)梅州市不同抽檢地在2017—2019年3年間柑橘黃龍病的發(fā)病情況；同時(shí)分別采用已報(bào)道的柑橘衰退病毒（，CTV）、柑橘裂皮病毒（，CEVd）、柑橘褪綠矮縮病毒（，CCDaV）、柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）和柑橘黃脈病毒（，CYVCV）的特異性檢測(cè)引物，提取樣品的RNA，反轉(zhuǎn)后以樣品的cDNA為模板，通過(guò)普通PCR的方法分析梅州市抽檢地區(qū)柑橘病毒病的發(fā)生情況。此外，以基于2種原噬菌體類型（SC1和SC2）對(duì)應(yīng)的超變異基因區(qū)域設(shè)計(jì)的2對(duì)引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2），運(yùn)用普通PCR方法分析該地區(qū)CLas菌株原噬菌體的遺傳多樣性?！窘Y(jié)果】除2018年9月梅州大浦順興公司蜜柚基地的抽檢樣品外，梅州市其他被檢地區(qū)均發(fā)現(xiàn)CLas?？傮w來(lái)說(shuō)，梅州市的臍橙CLas檢出率為55.3%，蜜柚為61.5%，沙田柚為61.7%。其中2017年采集自平原縣大拓鎮(zhèn)的蜜柚和沙田柚樣品CLas檢出率為100%，興寧市白馬鎮(zhèn)的蜜柚為100%，沙田柚為80%；其他抽檢地區(qū)的樣品CLas檢出率在16.7%—83.3%。雖然梅州市部分地區(qū)的檢出率較高，但其病原菌的含量并不高，大部分處于柑橘黃龍病發(fā)病初、中期，屬可防可控階段；此外，梅州市柑橘病毒的總檢出率不高，CTV、CTLV和CYVCV為梅州的主要病毒，CEVd和CCDaV沒(méi)有檢測(cè)到。CTV、CTLV和CYVCV在臍橙上的檢出率依次為78.9%、7.9%和21.1%，蜜柚為15.4%、25.0%和9.6%，沙田柚為6.4%、2.1%和4.3%?；贚ap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2來(lái)研究CLas原噬菌體多樣性的PCR擴(kuò)增條帶共有4種類型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2），經(jīng)過(guò)PCR電泳和測(cè)序得出，來(lái)自梅州市臍橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型為主，蜜柚上以SC1-1型為主?！窘Y(jié)論】梅州柑橘產(chǎn)區(qū)的柑橘黃龍病目前屬于可防可控階段，其病原菌菌株的原噬菌體在不同品種上具有其獨(dú)特性；由于在抽檢時(shí)發(fā)現(xiàn)有柑橘病毒病的存在，因此在種植過(guò)程中需加強(qiáng)種苗監(jiān)管，同時(shí)應(yīng)采取有效措施對(duì)柑橘黃龍病和柑橘木虱（）進(jìn)行綠色防控。

柑橘黃龍??；韌皮部桿菌亞洲種；柑橘病毒??；原噬菌體；遺傳多樣性

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍病（Huanglongbing，HLB）是世界性的柑橘病害，有柑橘“癌癥”之稱，目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有效的防治措施[1-2]。HLB可在柑橘上形成典型癥狀，如葉片斑駁、褪綠均勻黃化或膠質(zhì)化、葉脈粗大等，這些發(fā)病癥狀極易與柑橘田間缺素癥、病毒病及藥/肥害等癥狀相混淆。HLB主要由柑橘韌皮部細(xì)菌屬（Liberibacter）的3個(gè)種引起，分別為亞洲種（‘. L. asiaticus’，CLas）、非洲種（‘. L. africanus’，CLaf）和美洲種（‘. L. americanus’，CLam）[3-4]。我國(guó)的HLB主要由CLas引起，通過(guò)木虱或帶病植物材料進(jìn)行傳播。目前該病原菌還不能被人工培養(yǎng)，對(duì)研究該病原菌的形態(tài)和生理生化等方面造成了很大的障礙。梅州是廣東省重要的柑橘產(chǎn)區(qū)，柑橘（包括柚、橙、柑、橘）產(chǎn)業(yè)是其農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，明確目前HLB在梅州市的危害情況并分析該地區(qū)CLas的原噬菌體多樣性，對(duì)于該病害的防控具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】黃龍病菌基因組主要由染色體區(qū)域和原噬菌體區(qū)域兩部分組成。染色體區(qū)域具有高度保守性，但原噬菌體區(qū)域變化較大，可以用于區(qū)分黃龍病菌的多樣性[5-6]。隨著不同地區(qū)柑橘黃龍病菌基因組的揭示，越來(lái)越多的研究者通過(guò)研究病原菌的遺傳多樣性對(duì)黃龍病菌的種群遺傳結(jié)構(gòu)及病害流行學(xué)進(jìn)行解析。過(guò)去對(duì)黃龍病菌遺傳多樣性的研究主要集中于16S rDNA、16S/23S rDNA基因間隔區(qū)、操縱子以及外膜基因等區(qū)域，但基于16S rDNA、16S/23S rDNA基因間隔區(qū)的PCR-SSCP、PCR-RFLP或PCR-RFLP-SSCP等分子標(biāo)記技術(shù)均未發(fā)現(xiàn)黃龍病菌種內(nèi)的明顯分化現(xiàn)象[7-9]。Villechanoux等首次利用黃龍病菌的操縱子區(qū)域?qū)θ毡?、中?guó)以及東南亞各國(guó)不同來(lái)源的CLas遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同菌株間的同源性很高，只存在少量核苷酸的變異[10-13]；黃永輝等[14]利用黃龍病菌外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）基因?qū)?lái)自廣東省7個(gè)不同地區(qū)的7個(gè)菌株遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)廣東地區(qū)黃龍病菌在水平上未見(jiàn)顯著差異；董俊等[15]利用對(duì)采自湖南、江西、福建等地的黃龍病菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)該基因也不能很好地反映不同菌株間的遺傳多樣性，僅能夠反映黃龍病菌菌株的分化除了地域差異外還有寄主作物的不同；譚錦等[16]利用黃龍病菌體內(nèi)2種原噬菌體對(duì)應(yīng)的超變異基因區(qū)域設(shè)計(jì)的2對(duì)引物，對(duì)中國(guó)不同柑橘產(chǎn)區(qū)的224個(gè)CLas菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)和序列分析，發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增的條帶類型呈多態(tài)性，說(shuō)明中國(guó)不同地理來(lái)源CLas菌株在原噬菌體區(qū)域具有較豐富的多態(tài)性，揭示了中國(guó)CLas種群的遺傳多樣性；XU等[17]利用CLas基因組中全套串聯(lián)重復(fù)基因（short tandem repeat，STR）對(duì)中國(guó)福建、廣西、云南、廣東、江西、浙江的32個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)廣東省CLas具有一定的遺傳特異性；黃愛(ài)軍等[18]利用對(duì)已知23個(gè)SSR（simple sequence repeat）位點(diǎn)篩選獲得的5個(gè)SSR位點(diǎn)對(duì)中國(guó)境內(nèi)8個(gè)不同地理來(lái)源的樣品進(jìn)行分析，獲得很好的CLas遺傳多態(tài)性；盧占軍等[19]利用篩選獲得的3個(gè)位點(diǎn)（LasSSR-C、LasSSR-D、CWBJ44）對(duì)贛南CLas遺傳多樣性及各地種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析獲得了很好的結(jié)果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2017年梅州市柑橘產(chǎn)業(yè)面積4.83萬(wàn)公頃，占全省1/6。梅州盛產(chǎn)沙田柚（金柚）和蜜柚，是著名的“金柚之鄉(xiāng)”，全國(guó)最大的柚類商品生產(chǎn)基地[20]，主產(chǎn)區(qū)在梅縣區(qū)和大埔縣。近年來(lái)，臍橙的種植面積也在逐年遞加，全市橙子面積0.35萬(wàn)公頃，產(chǎn)量7.41萬(wàn)噸，主產(chǎn)區(qū)在平遠(yuǎn)縣。2018年梅縣區(qū)金柚、大埔縣蜜柚、平遠(yuǎn)縣臍橙成功入選廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園項(xiàng)目（材料來(lái)自梅州市農(nóng)業(yè)局）[21-22]。但近年來(lái)不斷有關(guān)于梅州市柑橘主產(chǎn)區(qū)柑橘HLB發(fā)生的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)梅州柑橘主產(chǎn)區(qū)HLB的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查和分析，同時(shí)對(duì)柑橘病毒病在該地區(qū)的危害程度進(jìn)行抽檢；并進(jìn)一步對(duì)來(lái)自梅州市的不同柑橘CLas菌株原噬菌體超變異基因的遺傳多樣性進(jìn)行研究，明確梅州市CLas的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試植物材料分別于2017—2019年采自廣東省梅州市平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)和大拓鎮(zhèn)，梅縣區(qū)石扇鎮(zhèn)、城東鎮(zhèn)、雁洋鎮(zhèn)和人民廣場(chǎng)森林公園，大埔縣大東鎮(zhèn)、湖寮鎮(zhèn)和百侯鎮(zhèn)，興寧市石馬鎮(zhèn)，均采用多點(diǎn)隨機(jī)采樣法。其中臍橙采自平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)；沙田柚采自梅縣區(qū)石扇鎮(zhèn)和城東鎮(zhèn)，梅州大浦順興公司蜜柚基地，平遠(yuǎn)縣大拓鎮(zhèn)和興寧市白馬鎮(zhèn)；蜜柚采自梅縣區(qū)石扇鎮(zhèn)、雁洋鎮(zhèn)和人民廣場(chǎng)森林公園，大埔縣湖寮鎮(zhèn)、百侯鎮(zhèn)和梅州大浦順興公司蜜柚基地，平遠(yuǎn)縣大拓鎮(zhèn)和興寧市白馬鎮(zhèn)。采集地的種植年限不一，管理水平也不同，部分采集地信息見(jiàn)表1。

表1 部分采集地的詳細(xì)信息

1.2 方法

1.2.1 植物DNA和RNA的提取、質(zhì)量檢測(cè)及RNA的反轉(zhuǎn)錄 植物DNA和RNA的提?。好糠軩NA和RNA樣品均采集3個(gè)柑橘葉片的中脈或柑橘果實(shí)的果皮；先用刀片把材料切碎，而后用液氮快速將樣品磨成粉末，依次類推。每個(gè)樣品單獨(dú)用一副手套、一個(gè)研缽和研磨棒（使用前需對(duì)研缽和研磨棒進(jìn)行高溫滅菌處理）。DNA的提取嚴(yán)格按照試劑盒（愛(ài)思進(jìn)動(dòng)植物基因組DNA制備試劑盒，AXYGEN，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體提取方法詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)；RNA的提取主要采用天根生化科技有限公司的RNA提取試劑盒（DP441，RNAprep Pure Plant Plus Kit），具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

DNA和RNA的質(zhì)量檢測(cè)：取2 μl樣品在超微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（Nano-100）上進(jìn)行檢測(cè)，讀取并記錄DNA和RNA的含量和質(zhì)量數(shù)值。

RNA的反轉(zhuǎn)錄：具體操作見(jiàn)天根生化科技有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)（貨號(hào)：KR116-02，F(xiàn)astKing RT Kit （with gDNAase））。

1.2.2 CLas的分子檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法對(duì)柑橘葉片和果實(shí)中的CLas進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)儀器為ABI PRISM 7500（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）。同時(shí)以CLas的部分16S rDNA序列為模板設(shè)計(jì)引物，引物的設(shè)計(jì)主要參照LI等[23]。HLBas：5′-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3′，HLBr：5′-GCG TTATCCCGTAGA AA AAGGTAG-3′，利用探針HLBp：5-6-carboxy-fluorescein (FAM)- AGAC GGGTGAGTA ACGCG-Black Hole Quencher (BHQ) -1-3對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。所用試劑為購(gòu)自TaKaRa公司的Premix Ex（Probe qPCR）（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，大連），所用引物和探針均合成于上海生工生物工程股份有限公司。qPCR體系（25 μl）：12 μl Premix Ex（Probe qPCR），0.5 μl HLBas/HLBr，1 μl HLBp，1 μl DNA（50 ng·μl-1），10 μl ddH2O。具體程序：95℃/30 s；95℃/5 s - 60℃/30 s，40個(gè)循環(huán)。程序運(yùn)行結(jié)束后，讀取Ct值，以備后續(xù)分析。利用標(biāo)準(zhǔn)品制作的Ct值與菌含量的關(guān)系式為：=-0.286+11.924，其中為Ct 值，為拷貝數(shù)，每克中含有的病原菌個(gè)數(shù)為10。

普通PCR：根據(jù)CLas的16S rDNA設(shè)計(jì)引物OI1（5′-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3′），OI2c （3′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-5′）擴(kuò)增目的DNA樣品[24]。PCR體系：10 μl Premix Ex，0.5 μlOI1/0.5 μl OI2c，1 μl gDNA，8 μl ddH2O；具體程序：95℃/45 s；95℃/5 s - 52℃/45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃/10 min；16℃forever。程序結(jié)束后進(jìn)行電泳檢測(cè)，DNA Marker為購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司的Trans2K DNA Marker，通過(guò)條帶的大小確認(rèn)樣品中是否存在CLas。

1.2.3 柑橘病毒的檢測(cè) 采用普通PCR方法對(duì)柑橘樣品中的柑橘衰退病毒（，CTV）、柑橘裂皮病毒（，CEVd）、柑橘褪綠矮縮病毒（，CCDaV）、柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）和柑橘黃脈病毒（，CYVCV）進(jìn)行檢測(cè)。所用引物主要選用已報(bào)道的檢測(cè)引物，模板為已反轉(zhuǎn)的cDNA。PCR體系：10 μl Premix Ex，0.5 μl primer F/R，1—2 μl cDNA，ddH2O補(bǔ)足20 μl；具體程序：95℃/45 s；95℃/5 s - 54℃/45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃/10 min；16℃forever。程序結(jié)束進(jìn)行電泳檢測(cè)，通過(guò)擴(kuò)增片段的大小確認(rèn)材料中是否含有被檢的柑橘病毒。

1.2.4 CLas菌株原噬菌體超變異基因遺傳多樣性的檢測(cè) 主要基于2種原噬菌體類型（SC1和SC2）對(duì)應(yīng)的超變異基因區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)引物（Lap-TJ-F/Lap- TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2），通過(guò)PCR方法，對(duì)采自梅州的14個(gè)代表菌株進(jìn)行CLas原噬菌體超變異基因遺傳多樣性的研究[14]。PCR擴(kuò)增體系：10 μl Premix Ex，0.5 μl primer F/R，1—2 μl cDNA，ddH2O補(bǔ)足20 μl；具體程序：95℃/45 s；95℃/5 s - 55℃/2 min，32個(gè)循環(huán)；72℃/10 min；16℃forever。程序結(jié)束進(jìn)行電泳檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)到的條帶進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析。

1.2.5 CLas菌株原噬菌體超變異基因遺傳多樣性的序列分析 利用DNSTAR Lasergene EditSeq讀取所有的測(cè)序序列，并分別在NCBI進(jìn)行BLAST，選取親緣關(guān)系較近的序列；然后利用MEGA7.0.18對(duì)所有序列進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。進(jìn)化分析Joining method做Bootstrap驗(yàn)證（重復(fù)1 000次）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[25]。

2 結(jié)果

2.1 梅州市CLas的檢測(cè)

2017—2019年在梅州市進(jìn)行柑橘病害的調(diào)研和取樣共5次。采集的柑橘品種包括臍橙、沙田柚和蜜柚；采集地區(qū)包括平原縣、梅縣區(qū)、大埔縣和興寧市，共計(jì)4個(gè)市（縣）11個(gè)村鎮(zhèn)137個(gè)樣品。通過(guò)qPCR方法對(duì)這些地區(qū)的柑橘黃龍病發(fā)生情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示除2018年9月份采集自大浦順興公司蜜柚基地的10個(gè)樣品沒(méi)有檢測(cè)到CLas外，其他地區(qū)均能夠檢測(cè)到CLas。其中平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)六吉村（采樣時(shí)間：2019年，檢出率：30.0%）、大埔縣大東鎮(zhèn)東光村（2019年，60.0%）、平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)李氏家庭農(nóng)場(chǎng)（2018年，83.3%）、梅縣區(qū)雁洋鎮(zhèn)南福村（2018年，16.7%）、大埔縣湖寮鎮(zhèn)雙髻山（2018年，80.0%）、大埔縣百侯鎮(zhèn)新樂(lè)村（2018年，60.0%）、興寧市白馬鎮(zhèn)沙田柚（2017年，80.0%）的CLas雖然在檢出率上存在很大差異，但都仍處于發(fā)病初期，含菌量為42—1 700 copies/g。而采集自其他地區(qū)和果園的樣品中，如平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)飛龍村、梅縣區(qū)石扇鎮(zhèn)西南村、梅縣區(qū)城東鎮(zhèn)玉水村、梅縣區(qū)人民廣場(chǎng)森林公園和平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)李氏家庭農(nóng)場(chǎng)臍橙中也僅各有1個(gè)樣品的Ct值在21—22，說(shuō)明這些果園整體也處于發(fā)病的初期；但個(gè)別樹(shù)體的柑橘黃龍病已經(jīng)發(fā)展到了很嚴(yán)重的階段，對(duì)樹(shù)體的正常發(fā)育和產(chǎn)量已經(jīng)形成了嚴(yán)重的影響，為了整個(gè)果園的安全生產(chǎn)，需要進(jìn)行徹底的挖樹(shù)和消毒處理。2017年采集自興寧市白馬鎮(zhèn)的蜜柚、平遠(yuǎn)縣大拓鎮(zhèn)的蜜柚和沙田柚樣品，CLas的檢出率都達(dá)到了100%，且多個(gè)樹(shù)體的含菌量達(dá)到了1×106copies/g以上，說(shuō)明在這些地區(qū)被檢果園中單個(gè)樹(shù)體柑橘黃龍病已經(jīng)到了發(fā)病后期。另外，在梅州市，CLas在臍橙、蜜柚和沙田柚的檢出率幾乎相同，說(shuō)明這3個(gè)品種對(duì)柑橘黃龍病的抗（耐）性無(wú)明顯差異（表2）。

表2 梅州市柑橘主產(chǎn)區(qū)黃龍病菌的檢測(cè)

×：田間已結(jié)果的大樹(shù)A big tree that has borne fruit in the field；*：復(fù)種一年內(nèi)的無(wú)毒柑橘樹(shù)苗Non-toxic citrus seedling within one year after replanting。表3同The same as Table 3

2.2 梅州市柑橘病毒的檢測(cè)

由于在田間癥狀上柑橘黃龍病極易于柑橘病毒病混淆，本研究特別對(duì)我國(guó)已報(bào)道的5種常見(jiàn)柑橘病毒病在梅州市柑橘主產(chǎn)區(qū)的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)研和檢測(cè)，主要包括柑橘衰退病、柑橘裂皮病、柑橘褪綠矮縮病、柑橘碎葉病和柑橘黃脈病[26-28]。結(jié)果顯示，在采集自梅州市的柑橘樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CEVd和CCDaV的存在，同時(shí)CTV的檢出率最高（臍橙78.9%，蜜柚15.4%，沙田柚6.4%），其次是CTLV（臍橙7.9%，蜜柚25.0%，沙田柚2.1%）和CYVCV（臍橙21.1%，蜜柚9.6%，沙田柚4.3%），被檢病毒在沙田柚上的檢出率最低。

在被抽檢的地區(qū)中，采集自梅縣區(qū)人民廣場(chǎng)森林公園、梅縣區(qū)石扇鎮(zhèn)西南村、梅縣區(qū)城東鎮(zhèn)玉水村、大埔縣大東鎮(zhèn)東光村、大浦順興公司蜜柚基地沙田柚的樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)5種被檢病毒的存在；采集自平遠(yuǎn)縣大拓鎮(zhèn)的沙田柚樣品和平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)李氏家庭農(nóng)場(chǎng)的臍橙樣品中，均能夠檢到CTV、CTLV和CYVCV。

表3 梅州市柑橘主產(chǎn)區(qū)柑橘病毒檢測(cè)

2.3 梅州市CLas菌株原噬菌體超變異基因遺傳多樣性

對(duì)隨機(jī)抽取來(lái)自梅州市的14個(gè)樣品和來(lái)自廣州市白云區(qū)的3個(gè)樣品，通過(guò)qPCR和普通PCR分別進(jìn)行CLas檢測(cè)，結(jié)果顯示qPCR的結(jié)果較普通PCR的結(jié)果更準(zhǔn)確，當(dāng)被檢測(cè)樣品的Ct 值＞31.18時(shí)，普通PCR已經(jīng)不能檢測(cè)出樣品中含有CLas（表4、圖1）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)來(lái)自平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)的臍橙R4不含CLas，為健康的柑橘材料。采用譚錦等[16]報(bào)道的研究中國(guó)CLas 2個(gè)原噬菌體超變異基因遺傳多樣性的引物（Lap-TJ- F/Lap-TJ-R1、Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)其中隨機(jī)抽取的5個(gè)菌株（Z3、R1、SM1、S1、G1）進(jìn)行測(cè)序，具體結(jié)果見(jiàn)表4。Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1擴(kuò)增梅州地區(qū)的CLas菌株得到的條帶較多，且都集中在2 kb以下；根據(jù)文獻(xiàn)[17]，1 677 bp左右的條帶為其主要條帶，命名為SC1-1；1 149—1 812 bp的條帶命名為SC1-2。結(jié)果顯示僅SM1和SM2具有SC1-1，C2具有SC1-2。

Lap-TJ-F/Lap-TJ -R2擴(kuò)增獲得的1 456和846 bp 2種大小不同的基因序列，分別對(duì)應(yīng)的電泳條帶被命名為SC2-1和SC2-2。結(jié)果表明，D2沒(méi)有擴(kuò)增出有效條帶；除SM1、SM2和C2外，被抽查的梅州地區(qū)的CLas菌株均具有SC2-1；來(lái)自廣州市白云區(qū)的蜜柚品種也具有SC2-1；在被抽檢的梅州地區(qū)樣品中未檢測(cè)到含有SC2-2（圖1）。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CLas菌株同時(shí)具有SC1和SC2。

表4 部分來(lái)自梅州的CLas菌株信息及擴(kuò)增類型

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

來(lái)自Z3、R1、S1和G1的SC2-1，SM1的SC1-1經(jīng)過(guò)測(cè)序以及在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/）上進(jìn)行Blast后，通過(guò)Mega7軟件進(jìn)行多序列比對(duì)（圖2）。結(jié)果顯示這些序列的結(jié)構(gòu)與譚錦等[16]報(bào)道的大致相同，但在不同菌株的同一片段上存在個(gè)別堿基的不同或缺失；進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，不同菌株間同源性差異較大，且與已報(bào)道的來(lái)自福建、廣西、江西、云南等地菌株中的相關(guān)原噬菌體序列SC1和SC2的同源性較差，獨(dú)立成為一簇。由圖2可以看出，這些菌株間的同源性不僅與品種無(wú)關(guān)，與小范圍的地理位置也無(wú)關(guān)。

P: OI1/OI2c; P1: Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1; P2: Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2; M: Trans2K DNA Marker; Z1-D2: 不同菌株Different strains

圖2 鄰接法構(gòu)建原噬菌體基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

梅州市是廣東省重要的柑橘生產(chǎn)基地，本研究通過(guò)qPCR方法更精確地反映了梅州市不同柑橘產(chǎn)區(qū)的黃龍病發(fā)?。摲┣闆r，結(jié)果表明柑橘不同品種間黃龍病發(fā)病率無(wú)明顯差異。以16S rDNA為模板設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)qPCR方法進(jìn)行CLas檢測(cè)的結(jié)果，同時(shí)結(jié)合田間柑橘樹(shù)的生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)量，筆者研究室把Ct值≥37劃分為健康苗木，Ct值介于30—37為柑橘黃龍病的發(fā)病初期（輕病期），Ct值介于25—30為柑橘黃龍病發(fā)病的中病期，Ct值＜25為柑橘黃龍病發(fā)病的后期（待發(fā)表）。從2017—2019年對(duì)梅州市不同地區(qū)、不同果園的檢測(cè)情況來(lái)看，除大浦順興公司的柑橘種植基地沒(méi)有檢出CLas外，其他果園均不同程度地檢出了CLas，平遠(yuǎn)縣大拓鎮(zhèn)、興寧市白馬鎮(zhèn)和梅縣區(qū)城東鎮(zhèn)玉水村的橘園已經(jīng)發(fā)展到了柑橘黃龍病的后期，需要進(jìn)行挖樹(shù)，徹底消毒和復(fù)種無(wú)毒種苗或改種其他作物；其他果園除個(gè)別果樹(shù)比較嚴(yán)重，需要做特殊的處理（挖除）外，加強(qiáng)果園的防蟲(chóng)和栽培管理，可維持樹(shù)體的健康和產(chǎn)量，具體措施參見(jiàn)崔一平等[29]。近年來(lái)對(duì)柑橘木虱（）的綠色防控研究取得了較大進(jìn)展，如以天敵（亮腹釉小蜂、阿里食虱跳小蜂、瓢蟲(chóng)、草蛉、蜘蛛和螞蟻）、昆蟲(chóng)病原真菌（球孢白僵菌、綠僵菌和玫煙色棒束孢等）和來(lái)自印楝的印楝素等植物源農(nóng)藥為主的生物防治技術(shù)和以燈光、色板誘捕、反光膜驅(qū)避、防蟲(chóng)網(wǎng)阻隔為主的物理防治技術(shù)等都取得了很好的防治效果[30]。但在實(shí)際生產(chǎn)中柑橘木虱綠色防控技術(shù)的集成應(yīng)用卻很少，主要是上述措施在都存在一定的技術(shù)瓶頸有待突破。

值得注意的是，平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)李氏臍橙家庭農(nóng)場(chǎng)復(fù)種的臍橙小苗，在種植不到一年的時(shí)候進(jìn)行抽檢發(fā)現(xiàn)，CLas檢出率為83.3%，含菌量為71—760 copies/g，CTLV檢出率為33.3%。種植者在購(gòu)買無(wú)毒種苗時(shí)應(yīng)從正規(guī)廠家購(gòu)買，確保種植的種苗確實(shí)是健康的。而像大浦順興公司蜜柚基地這種沒(méi)有檢出CLas，但有CTLV和CYVCV的果園，則應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)栽培管理，做好防蟲(chóng)防病工作。梅州市總的柑橘病毒檢出率并不高，僅臍橙的CTV檢出率較高，為78.9%，說(shuō)明梅州市在過(guò)去種苗質(zhì)量的控制上把關(guān)較嚴(yán)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)沙田柚比臍橙和蜜柚對(duì)衰退病、碎葉病和黃脈病有更好的耐病性，檢出率均低于10%。

通過(guò)對(duì)CLas兩個(gè)噬菌體超變異基因多樣性的研究，梅州柑橘主產(chǎn)區(qū)的CLas雖然大部分都含有SC2-1，但它們?cè)诤怂嵝蛄械亩鄠€(gè)堿基位點(diǎn)上都存在變異或缺失。梅縣區(qū)石扇鎮(zhèn)的蜜柚SM1、SM2和梅縣區(qū)城東鎮(zhèn)的沙田柚C2則分別含有SC1-1和SC1-2。廣東省梅州市柑橘主產(chǎn)區(qū)的CLas菌株自成一簇且相對(duì)單一和保守，與已報(bào)道的其他地區(qū)的CLas菌株同源性較差。

譚錦等[16]研究表明，來(lái)自廣東四會(huì)的砂糖橘含有SC2-1和SC1-2。為了進(jìn)一步研究地域是否影響CLas菌株的進(jìn)化，本研究對(duì)來(lái)自廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)的砂糖橘、默克特與蜜柚的CLas菌株進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自砂糖橘和默科特的CLas菌株都含有SC2-1和SC2-2，而來(lái)自蜜柚的菌株僅含有SC2-1。通過(guò)對(duì)來(lái)自梅州主產(chǎn)區(qū)和廣州市白云區(qū)的CLas菌株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在這些地區(qū)CLas的進(jìn)化與柑橘品種、小范圍內(nèi)的地域關(guān)系都不大；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CLas菌株的進(jìn)化速度很快，在同一地域的同一果園內(nèi)存在不同的CLas株系，CLas具體的進(jìn)化機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

廣東省梅州市主要柑橘產(chǎn)區(qū)的柑橘黃龍病目前屬于發(fā)病初、中期，為可防可控階段，應(yīng)采取有效措施對(duì)柑橘黃龍病和柑橘木虱進(jìn)行綠色防控。同時(shí)梅州市CLas菌株的原噬菌體在不同品種上具有其獨(dú)特性，其進(jìn)化與柑橘品種、小范圍內(nèi)的地域關(guān)系都不大。該地區(qū)柑橘病毒的檢出率并不高，但病毒病的存在仍然能夠?qū)?shù)體的生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重的影響，因此建議在種植過(guò)程中加強(qiáng)種苗監(jiān)管，從源頭上減少柑橘病毒對(duì)樹(shù)苗的侵染。

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Investigation on occurrence of citrus Huanglongbing and virus diseases, and prophage genetic diversity of Huanglongbing pathogen in Meizhou, Guangdong

CUI Yiping, PENG Aitian, SONG Xiaobing, CHENG Baoping, LING Jinfeng, CHEN Xia

(Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640)

【Objective】The objective of this study is to investigate the impacts of citrus Huanglongbing (HLB) and virus diseases on citrus production in Meizhou City of Guangdong Province, and to reveal the local ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas, the pathogen of HLB in China) strains genetic diversity based on the prophage region.【Method】The primers were designed with 16S rDNA as the template, and the incidence of HLB in different sampling sites in meizhou city in the 3 years from 2017 to 2019 was detected by qPCR. after RNA extraction, RT-PCR followed by ordinary PCR were applied to detect(CTV),(CEVd),(CCDaV), Citrus tatter leaf virus (CTLV) and(CYVCV) using their own reported primers, separately. Two pairs of primers (Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1 and Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2) were designed based on the supervariant gene regions corresponding to two prophage types (SC1 and SC2), and the genetic diversity of CLas prophage regions was analyzed using ordinary PCR method.【Result】The results of CLas detection showed that only the sample from one orchard (Honey pummelo base in Shunxing Company in Dapu County) in September, 2018 was free, other inspected areas in Meizhou all had CLas. Overall, the CLas detection rate of navel orange in Meizhou was 55.3%, the honey pummelo was 61.5%, and the Shatian pummelo was 61.7%. Among them, the CLas detection rate of honey pummelo and Shatian pummelo collected from Datuo Town, Pingyuan County in 2017 was 100%, the detection rate of honey pummelo and Shatian pummelo in Baima Town, Xingning City was 100% and 80%, respectively. The detection rate of samples in other sampling areas was 16.7%-83.3%. Although the detection rate in some areas of Meizhou was high, the content of pathogenic bacteria was not high, most of them were at the early and middle stages of HLB, which belonged to a preventable and controllable stage. In the same region, the total detection rate of citrus viruses in Meizhou City was not high. CTV, CTLV and CYVCV were the main viruses in Meizhou, CEVd and CCDaV were not detected. The detection rate of CTV, CTLV and CYVCV on navel orange was 78.9%, 7.9% and 21.1%, on honey pummelo was 15.4%, 25.0%, and 9.6%, on Shatian pummelo was 6.4%, 2.1%, and 4.3%, respectively. Through prophage genetic diversity analysis of CLas strains in Meizhou city, four CLas prophage amplicon types (SC1-1, SC1-2, SC2-1 and SC2-2) were observed in the CLas from all the tested samples, SC2-1 represented the predominant CLas type in navel orange and Shatian pummelo in Meizhou city, and SC1-1 was predominant in honey pummelo.【Conclusion】The citrus HLB in Meizhou citrus producing area is currently at a controllable stage. The prophage of its pathogenic CLas strain is unique in different varieties. due to the existence of citrus virus diseases during spot inspection, seedling supervision needs to be strengthened during the planting process and effective measures should be taken to prevent and control HLB and.

citrus Huanglongbing; ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas); citrus virus disease; prophage; genetic diversity

2019-09-16；

2019-11-18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0201500，2017YFD0202000）、科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金（高水平農(nóng)科院建設(shè)，R2018QD-059）、廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（2019KJ108，2018LM1077）、植物疫病防控省級(jí)項(xiàng)目（0835-190Z22803281）、梅州市政府購(gòu)買服務(wù)合同項(xiàng)目（2018063001）

崔一平，E-mail：kktracy@163.com。通信作者彭埃天，E-mail：pengait@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）