小西葫蘆黃花葉病毒dsRNA的原核表達及其對ZYMV的防治效果

解昆侖，劉莉銘，劉美，彭斌，吳會杰，古勤生

小西葫蘆黃花葉病毒dsRNA的原核表達及其對ZYMV的防治效果

解昆侖，劉莉銘，劉美，彭斌，吳會杰，古勤生

（中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所，鄭州 450009）

【目的】小西葫蘆黃花葉病毒（，ZYMV）是危害西瓜最為普遍的病毒，在西瓜上利用外源噴施病毒基因dsRNA的方法實現(xiàn)對ZYMV的預防和治療?！痉椒ā渴紫纫詫嶒炇乙延械腪YMV病毒序列為依據(jù)，針對其不同的基因片段，利用NCBI數(shù)據(jù)庫找出與其相似的序列。隨后利用軟件DNAMAN8對序列進行多重比對分析，找出其保守區(qū)域，根據(jù)分析結(jié)果選擇長度介于200—350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5個基因片段，同時選擇長度為190 bp的GUS基因片段作為對照。PCR擴增得到這6個片段后，利用同源重組的方法將它們插入到含有雙T7啟動子的L4440載體中，并利用RNAⅢ酶缺陷型大腸桿菌HT115建立原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)dsRNA，采用超聲波破碎的方法釋放dsRNA，利用TE（10 mmol·L-1Tris-Hcl和1 mmol·L-1EDTA）緩沖液溶解dsRNA，最后比較和分析IPTG使用濃度、誘導時間以及超聲波破碎時間對dsRNA表達和釋放的影響。在西瓜植株上采用噴施的方法施用dsRNA，設計先噴施dsRNA后接種病毒的預防試驗和先接種病毒后噴施dsRNA的治療試驗，通過統(tǒng)計分析接種病毒后21 d發(fā)病率的方法評價dsRNA預防和治療ZYMV的效果。【結(jié)果】針對ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5個基因片段以及GUS基因片段建立了能夠高效穩(wěn)定表達和釋放dsRNA的生產(chǎn)體系。在IPTG誘導濃度為8 mmol·L-1，誘導時間為7 h，在寧波新芝牌超聲波細胞破碎儀3?的檔位和60%的輸出功率條件下破碎15 min，細胞可以有效產(chǎn)生和釋放dsRNA。在對ZYMV的預防試驗中發(fā)現(xiàn)，噴施GUS基因片段的dsRNA以及TE緩沖液的西瓜植株發(fā)病率均為100%的情況下，對ZYMV防治效果最好的是HC-Pro基因片段，接種ZYMV 21 d后防治效果可達到95%，防治效果相對較差的是NIb基因片段，但也可達到80%。在此基礎上對HC-Pro片段預防和治療ZYMV的效果進行了深入分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在噴施HC-Pro片段的dsRNA后第3、5、7天接種ZYMV，植株發(fā)病率分別為16%、63%、63%，在接種ZYMV后第1、3、5、7天分別噴施HC-Pro片段的dsRNA，無明顯的治療效果，僅起到延遲植株發(fā)病的效果。【結(jié)論】建立了針對ZYMV不同基因片段的dsRNA原核表達體系，并發(fā)現(xiàn)基于HC-Pro基因片段產(chǎn)生的dsRNA對ZYMV防治效果最好，可顯著降低植株的發(fā)病率、延遲植株發(fā)病時間，具有應用潛力。

西瓜；小西葫蘆黃花葉病毒；原核表達；外源噴施；雙鏈RNA；防治效果

0 引言

【研究意義】西瓜（）屬于葫蘆科作物，是我國重要的夏季水果。我國是西瓜最大生產(chǎn)國和消費國，但是每年由于病毒病的發(fā)生會造成西瓜大面積的減產(chǎn)甚至絕收[1]，其中小西葫蘆黃花葉病毒（，ZYMV）是分布最廣、在我國危害較普遍的病毒[2]，屬于馬鈴薯Y病毒屬（），通過機械、蚜蟲、種子等途徑傳播[3]，目前尚缺乏有效的防治方法。因此，探尋防治該病毒病的有效方法具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種在生物進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）產(chǎn)生的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）誘導信使RNA（messenger RNA，mRNA）高效特異性降解的現(xiàn)象，是生物本身一種天然的防御機制，能夠有效地抵御外來核酸的侵擾。自2003年Tenllado等[4]利用體外噴施dsRNA的方法防治病毒病以來，一種新的利用dsRNA防治病害的方法得以出現(xiàn)。2016年，Koch等將其命名為噴施誘導的基因沉默（spray-induced gene silencing，SIGS）[5]。該方法在防治昆蟲[6-7]、真菌[5,8]、病毒[9-11]等植物病蟲害上已有廣泛研究。2017年，Mitter等[9]利用納米材料LDH（layered double hydroxide）包裹裸露的dsRNA，使噴施的dsRNA能夠穩(wěn)定的在葉片表面存在近一個月，在此期間植株能夠有效地抵抗病毒病的侵染；2018年，Kaldis等[11]利用體外轉(zhuǎn)錄的方法用試劑盒在體外生產(chǎn)了ZYMV的HC-Pro和CP片段的dsRNA，隨后將其和病毒汁液混合后摩擦接種，發(fā)現(xiàn)ZYMV HC-Pro片段的dsRNA在西瓜、黃瓜和南瓜上的防治效果分別為50%、82%和18%，而ZYMV CP片段的dsRNA防治效果分別為43%、70%和16%。【本研究切入點】雖然外部利用體外轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)的dsRNA防治ZYMV已有報道，但是體外轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)dsRNA的成本高，目前應用于實際生產(chǎn)有很大的限制，而利用生產(chǎn)成本較低的原核表達體系生產(chǎn)dsRNA用來防治ZYMV尚無研究，本研究探索利用原核表達的方法生產(chǎn)dsRNA，摸索其生產(chǎn)條件并評價防治效果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建一個能夠表達dsRNA的原核表達體系，探明不同片段dsRNA、不同的施用時間對病毒病的預防和治療效果，為該方法的實際應用打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所完成。

1.1 試驗材料

西瓜品種‘紅和平’種子購于浙江浙農(nóng)種業(yè)有限公司。西瓜植株的培養(yǎng)條件為溫度（26±2）℃，光周期L﹕D=16 h﹕8 h。ZYMV毒源、ZYMV侵染性克隆及pCAMBIA3301質(zhì)粒均由本實驗室保存。RNAⅢ酶缺陷型大腸桿菌HT115菌株及含有雙T7啟動子的RNAi沉默載體L4440[12]均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。PCR擴增用的Mix購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，膠回收試劑盒為Axygen公司生產(chǎn)，所用內(nèi)切酶I和Ⅲ均為NEB公司產(chǎn)品，同源重組試劑盒為近岸科技有限公司生產(chǎn)（NovoRec? plus One step PCR Cloning Kit），DNase I、RNase A、IPTG、Tris-Hcl以及EDTA均為索萊寶生產(chǎn)，DAS-ELISA所用的檢測ZYMV的試劑盒為Agdia公司生產(chǎn)，PBS、PBST等試劑均為實驗室自行配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的片段的選取與擴增 首先以ZYMV侵染性克隆為基礎，根據(jù)其全長序列（登錄號：MN296124），對ZYMV不同基因片段分別進行BLAST比對分析。針對不同片段分別選取BLAST出來的19條序列，利用軟件DNAMAN 8對這20條序列進行多序列比對分析其保守性，從中選出保守性相對較高的5個片段，它們分別屬于ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、Nib、P3區(qū)域，這些片段大小約200—350 bp。190 bp GUS片段從pCAMBIA3301 載體擴增。

利用Primer5.0軟件，根據(jù)ZYMV病毒序列以及載體L4440上的I和dⅢ這兩個酶切位點，分別設計ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、Nib、P3片段和GUS片段的特異性引物（表1），以ZYMV侵染性克隆的質(zhì)粒和pCAMBIA3301質(zhì)粒為模板分別擴增這6個片段。

1.2.2 同源重組構(gòu)建原核表達載體 利用同源重組的方法構(gòu)建原核表達載體，首先PCR反應擴增得到ZYMV的5個目的片段和GUS的目的片段，PCR反應程序：94℃預變性3 min，然后按照94℃ 2 min，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行30次循環(huán)反應，最后于72℃延伸5 min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段的PCR產(chǎn)物，并用膠回收試劑盒（Axygen）純化回收目的DNA片段。同時利用I和dⅢ對載體雙酶切，得到線性化的載體，然后利用同源重組試劑盒（NovoRec Plus PCR一步定向克隆試劑盒）進行同源重組，將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化HT115感受態(tài)（筆者實驗室制備），利用L4440載體通用引物M13-F20/ L4440，PCR擴增確定陽性克隆后，將菌液送至上海生工生物工程有限公司測序，利用Clustalx比對，將測序結(jié)果正確的菌液-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本研究所用引物

下劃線表示該引物和載體L4440的同源序列 The homologous sequence of the primer and vector L4440 is underlined

1.2.3 原核表達體系的建立與優(yōu)化 將成功導入質(zhì)粒的菌液，以1﹕100的比例加入含有氨芐青霉素（Amp）和四環(huán)素（Tet）抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/mim搖床過夜培養(yǎng)。第2天將菌液以1﹕100重新稀釋培養(yǎng)，37℃搖床220 r/min培養(yǎng)3 h，分光光度計測菌液OD值，達到0.5時加入IPTG誘導，參考已報道的4—8 mmol·L-1濃度的IPTG[13]，選取4和8 mmol·L-1分別誘導，以不加IPTG作為對照，誘導4 h后利用Trizol抽提細菌總RNA，將dsRNA提取出來。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察不同濃度誘導相同時間其dsRNA表達量。同樣地，利用8 mmol·L-1IPTG分別誘導4、5、6、7 h，提取dsRNA后電泳，觀察表達量。

1.2.4 dsRNA的消化驗證 將Trizol提取的dsRNA，用DNase I和RNase A消化，DNase I可以特異性的消化雙鏈DNA和單鏈DNA，RNase A在高鹽濃度下可以特異性的消化單鏈RNA，通過消化驗證證實經(jīng)誘導得到了dsRNA。

1.2.5 dsRNA噴施液的制作 在摸索最佳的誘導條件后，取2 ml菌液提取RNA，紫外分光光度計測定RNA的濃度，DNase I和RNase A消化后再次測量核酸濃度，并以此濃度作為dsRNA的生產(chǎn)濃度。

將誘導后的菌液8 000 r/min離心5 min，收集菌體，以1﹕1的比例加入相應體積的TE緩沖液，然后利用超聲波細胞破碎儀對細胞進行破碎，將大腸桿菌體內(nèi)的dsRNA釋放出來，在對破碎時間進行篩選的過程中，根據(jù)實驗室已有條件，在超聲波細胞破碎儀3?檔位下，分別設置破碎時間為10、15、20、25 min，篩選出相對合適的破碎時間，制作成可噴施的dsRNA液體。

1.2.6 dsRNA的噴施 設置7個處理，分別噴施 ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、Nib 5個片段，以GUS片段和TE緩沖液作為對照，每個處理20株西瓜苗，重復3次。噴施dsRNA 1 d后即接種ZYMV，接種7 d后利用DAS-ELISA檢測病毒，14、21 d時分別調(diào)查統(tǒng)計發(fā)病率，根據(jù)植株的發(fā)病情況統(tǒng)計，當植株呈現(xiàn)出花葉、畸形、皺縮、黃化等某一癥狀時即認為其發(fā)病。篩選出防治效果最好的片段，用于后續(xù)試驗。

將篩選出來的防治效果最好的片段、GUS以及TE緩沖液3個處理進行預防和治療試驗。預防試驗：在噴施dsRNA或TE緩沖液后 3、5、7 d分別接種ZYMV，21 d后調(diào)查統(tǒng)計發(fā)病率。治療試驗：先接種ZYMV，接種后1、3、5、7 d噴施dsRNA或TE緩沖液，接種21 d后調(diào)查統(tǒng)計發(fā)病率。每個處理10株，對照處理6株，每處理重復3次。

1.2.7 利用DAS-ELISA檢測病毒 DAS-ELISA又叫雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，是病毒檢測中比較常用的方法，其具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點。所用的酶聯(lián)檢測試劑盒購自美國Agdia公司。陽性對照樣品為中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控實驗室保存的接種ZYMV毒源的西瓜植株。

在接種ZYMV 7 d后分別取樣品，按1 g﹕10 mL的比例用提取緩沖液研磨樣品。然后離心取上清，即為待檢樣品。檢測步驟參考試劑盒說明書進行，以健康的西瓜葉片作為陰性對照，感病的葉片為陽性對照，緩沖液為空白對照。

利用酶標儀對反應后的吸光值進行檢測，測出各個孔的吸光值，利用公式計算相應的I/S值， I/S值≥3時即認為其是陽性。計算公式：I/S=（樣品吸光值-緩沖液對照吸光值）/陰性對照的吸光值。

2 結(jié)果

2.1 載體的構(gòu)建

利用ZYMV侵染性克隆和pCAMBIA3301質(zhì)粒為模板擴增ZYMV的5個片段和GUS片段，獲得的PCR產(chǎn)物電泳檢測，得到長度約為215、284、338、287、220、190 bp的目的條帶，與預期大小一致（圖1）。

將擴增的片段和經(jīng)雙酶切處理的L4440載體利用同源重組的方法進行連接，隨后轉(zhuǎn)入HT115菌株的感受態(tài)中。經(jīng)菌液PCR檢測顯示各克隆均為陽性，由于通用引物會擴增載體上的106 bp的片段，因此擴增的片段長為目的片段的長度加上106 bp（圖2）。

M: DL2000; 1: ZYMV-3′UTR (215 bp); 2: ZYMV-6k2 (284 bp); 3: ZYMV-HC-Pro (338 bp); 4: ZYMV-NIb (287 bp); 5: ZYMV-P3 (220 bp); 6: GUS (190 bp)

M: DL2000; 1-5: 3′UTR (215 bp); 6-10: 6K2 (284 bp); 11-15: HC-Pro (338 bp); 16-20: P3 (220 bp); 21-25: NIb (287 bp); 26-30: GUS (190 bp)

2.2 dsRNA誘導表達條件的優(yōu)化

以ZYMV的HC-Pro片段的dsRNA作為研究對象，篩選合適的IPTG誘導濃度和誘導時間。因為L4440載體的兩個T7啟動子之間還有79 bp的序列，因此誘導得到的dsRNA的長度應為HC-Pro片段長度338 bp加上79 bp，即為417 bp，同時有研究指出dsRNA在電泳時遷移速度要低于dsDNA[11]，因此目的片段在利用DL2000作為Mark時，在電泳圖上要略大于標準值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當IPTG的誘導濃度為8mmol·L-1時，誘導4 h后，dsRNA的表達量要比4 mmol·L-1時多，當IPTG濃度為0時，dsRNA表達量為0（圖3）。當IPTG濃度為8 mmol·L-1時，隨著誘導時間的增加，dsRNA的表達量持續(xù)增加，誘導7 h后，表達量相對較高（圖4）。

同樣以ZYMV HC-Pro片段的dsRNA為研究對象，在IPTG濃度為8 mmol·L-1誘導7 h的條件下，利用超聲波細胞破碎儀3?的檔位，60%輸出功率，分別破碎10、15、20、25 min，隨后將破碎后的液體利用瓊脂糖凝膠電泳直接分離溶液中的dsRNA，可以發(fā)現(xiàn)在超聲波破碎15 min后，即可有效釋放dsRNA（圖5）。

M：DL2000；1—3：IPTG濃度分別為0、4、8 mmol·L-1 The concentration of IPTG is 0, 4, 8 mmol·L-1, respectively

M：DL2000；1—4：誘導時間分別為4、5、6、7 h The induced time is 4, 5, 6, 7 h, respectively

2.3 利用DNase I和RNase A消化驗證dsRNA

為驗證提取的總RNA中是否含有dsRNA，利用DNase I和RNase A消化驗證，首先利用DNase I對總RNA進行消化反應，以加入RNase-Free H2O作為對照，隨后將經(jīng)DNase I消化后的反應產(chǎn)物中加入RNase A，在1 mol·l-1的Nacl溶液中，以RNase-Free H2O作為對照，進行消化驗證反應，結(jié)果表明當提取到的總RNA被DNase I和RNase A消化過后，在目的條帶處仍存在清晰的條帶，證明成功誘導表達了dsRNA（圖6）。

M：DL2000；1—4：破碎時間分別為10、15、20、25 min The disruption time is 10, 15, 20, 25 min, respectively

在總RNA被DNase I和RNase A消化過后，利用分光光度計測量核酸濃度，并以此作為誘導的dsRNA濃度，其量約占細菌總RNA的40%，隨后以1﹕1的比例加入TE緩沖液，本試驗中對葉片施用的量大致為4 μg·cm-2。

2.4 噴施dsRNA 1 d后接種ZYMV的預防效果

噴施ZYMV相關(guān)基因片段的dsRNA 1 d后摩擦接種ZYMV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組在接種ZYMV 7 d后無明顯癥狀，14、21 d后植株僅有部分表現(xiàn)出癥狀；而噴施了TE緩沖液以及GUS片段dsRNA的對照組在接種病毒7 d后系統(tǒng)葉即產(chǎn)生了輕微花葉癥狀，14 d后整體植株呈現(xiàn)矮縮現(xiàn)象，葉片呈現(xiàn)花葉黃化、畸形癥狀，21 d后整株呈現(xiàn)嚴重的矮縮、花葉黃化現(xiàn)象，部分植株已經(jīng)死亡（圖7）。

接種ZYMV 7 d后，每個處理隨機采集3個樣品進行混樣，隨后利用DAS-ELISA對ZYMV進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噴施了TE緩沖液以及GUS dsRNA的對照組已經(jīng)非常接近呈現(xiàn)陽性，而噴施了ZYMV的dsRNA的處理組均未檢測到病毒（圖8）。

接種ZYMV 21 d后統(tǒng)計發(fā)病率，發(fā)現(xiàn)噴施了TE緩沖液及GUS的dsRNA對照組植株發(fā)病率均為100%，噴施ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5個片段dsRNA的處理組的平均發(fā)病率分別為10%、15%、5%、10%、20%（圖9）。結(jié)果表明噴施過dsRNA的處理組很好地抵御了ZYMV的侵染，其中HC-Pro片段的防治效果最佳。

M：DL2000；L：dsRNA Ladder；1：ZYMV 3′UTR的dsRNA dsRNA of ZYMV 3′UTR；2：ZYMV 3′UTR片段加水反應30 min后ZYMV 3′UTR fragment reacted with water for 30 min；3：ZYMV的3′UTR片段被DNase I消化后ZYMV 3′UTR fragment was digested by DNase I；4：ZYMV的3′UTR片段被DNase I消化30 min后，加水反應30 min ZYMV 3′UTR fragment was digested by DNase I for 30 min, then reacted with water for 30 min；5：ZYMV的3′UTR片段被RNase I消化后ZYMV 3′UTR fragment was digested by RNase I；6—10：6K2片段的驗證情況，條件如上6K2 fragment verification, conditions as above；11—15：HC-Pro片段的驗證情況，條件如上HC-Pro fragment verification, conditions as above；16—20：P3片段的驗證情況，條件如上P3 fragment verification, conditions as above；21—25：NIb片段的驗證情況，條件如上NIb fragment verification, conditions as above；26—30：GUS片段的驗證情況，條件如上GUS fragment verification, conditions as above

圖7 噴施dsRNA 1 d后接種ZYMV的預防效果

當I/S值≥3時認為樣品為陽性When the I/S value ≥3, the sample is considered positive

利用鄧肯氏多重極差測驗法對發(fā)病率進行方差分析（SPSS軟件），不同小寫字母表示差異顯著（α=0.05）Analysis of variance (SPSS software) of incidence using Duncan’s multiple range test, different lowercase letters indicate significant difference (α=0.05)。下同The same as below

2.5 基于HC-Pro基因片段的dsRNA預防和治療ZYMV效果評價

為了進一步了解dsRNA抗病毒的預防時效及其治療效果，選取防治效果最好的HC-Pro片段作為研究對象。在預防試驗中，發(fā)病率統(tǒng)計結(jié)果顯示噴施dsRNA 3 d后接種病毒，處理組發(fā)病率為16%，而對照組發(fā)病率分別為94%和78%；噴施dsRNA 5 d后接種病毒，處理組發(fā)病率為63%，而對照組發(fā)病率均為100%；噴施dsRNA 7 d后接種病毒，處理組發(fā)病率為63%，對照組發(fā)病率分別為72%和61%，已無顯著差異（圖10）。治療試驗的統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組和對照組之間的發(fā)病率無顯著差異（圖11）。

圖10 噴施dsRNA后間隔不同天數(shù)接種ZYMV的發(fā)病率（21 d）

3 討論

植物可以利用自身的RNAi機制來抵御外來病毒的侵染，而引起植物RNAi反應的主要誘導因子就是dsRNA[14-15]，自植物被證實能夠吸收外源dsRNA且其能在植物體內(nèi)系統(tǒng)性移動以來[16]，利用外源噴施dsRNA防治病害的方法已經(jīng)成為研究的熱點[11,17-18]。目前利用該方法防治病毒病已在多種作物上嘗試[19-20]，但外源噴施原核表達生產(chǎn)的dsRNA用來防治ZYMV尚未有報道?；诖耍狙芯刻剿髁嗽吮磉_體系的構(gòu)件條件、不同片段的防治效果差異以及防治效果持續(xù)時間等問題。

圖11 接種ZYMV后間隔不同天數(shù)噴施dsRNA的發(fā)病率（21 d）

有關(guān)dsRNA長度和結(jié)構(gòu)的選取，已有很多的討論和證實[21-24]，理論上講，當dsRNA與其同源的序列長度能達到30 bp左右即可產(chǎn)生與其同源的siRNA，用來干擾該基因的表達[25]，同時有研究指出，當dsRNA的長度介于200—500 bp時，其沉默效率是比較高的[26]，基于此，本試驗中涉及到的dsRNA的長度均位于200—350 bp；dsRNA可以設計成不同的結(jié)構(gòu)，當dsRNA為發(fā)卡結(jié)構(gòu)時，其沉默效率和穩(wěn)定性要比普通的dsRNA強[27]，但是構(gòu)建成功后不穩(wěn)定，不宜長時間保存，本研究前期利用延長dsRNA莖作為環(huán)的方法，構(gòu)建了發(fā)卡結(jié)構(gòu)的dsRNA，但是發(fā)現(xiàn)其生產(chǎn)dsRNA的效率低下，因此選擇了簡單高效的普通dsRNA方法應用于本試驗。

該方法中，目的基因的選取是非常重要的，由于RNAi的特異性和病毒遺傳物質(zhì)的特性，在長期的相互作用和進化過程中，病毒自身產(chǎn)生了很多可以編碼抑制植物體內(nèi)RNAi效應的基因，稱為RNAi沉默抑制子，研究表明馬鈴薯Y病毒屬中的HC-Pro基因是一種RNAi沉默抑制子，可以通過阻止siRNA的積累來抵御植物的RNAi效應[25]。對比試驗結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)，當沉默HC-Pro片段時其預防效果可高達95%，而沉默其他區(qū)域時預防效果相對較低，因此以后應用此方法時，可先分析病毒不同基因的功能，選取病毒的RNAi沉默抑制子進行沉默，可達到最佳的防治效果。dsRNA雖然較RNA穩(wěn)定，但是其在自然界中裸露的情況下還是非常容易被降解的，因此其在葉片表面持續(xù)的時間長短是一個關(guān)鍵問題，本試驗結(jié)果也表明，噴施裸露的dsRNA 7 d左右，基本上失去預防作用。考慮其原因應該是當植物葉片吸收外源的dsRNA后，利用自身體內(nèi)的酶將dsRNA降解為siRNA，1 d后接種病毒，在病毒進入植物體內(nèi)之后，siRNA即可以和病毒的基因組特異性結(jié)合而將其降解，降解之后又會產(chǎn)生新的siRNA，即RNAi的二級放大效應[28]，所以這時防治效果就比較好。當進入植物的dsRNA被植物體內(nèi)的酶降解成siRNA后，如后續(xù)長時間沒有病毒的入侵，siRNA就會在植物體內(nèi)被慢慢降解而使其失去抵抗病毒的能力。本試驗結(jié)果表明，預噴施dsRNA 5 d后接種病毒，發(fā)病率存在顯著差異，而預噴施7 d后接種病毒就無明顯差異，筆者認為這除了與dsRNA的降解有關(guān)，還與植株的生長有關(guān)，西瓜苗在長出兩片子葉后，其在25℃恒溫恒濕的條件下生長速度很快，植株2 d的生長就會有很大的區(qū)別。Mitter等研究發(fā)現(xiàn)，當利用納米材料包裹dsRNA后，dsRNA的降解速率會大幅度下降[9]，同時由于納米材料的緩釋效果，研究表明無論是在室溫還是4℃放置一段時間后，dsRNA的總量不僅沒有下降，還有小幅上升[18]，隨著納米材料生產(chǎn)的擴大與普及應用，有可能廣泛應用于該領(lǐng)域。從另一方面來說，在田間實際生產(chǎn)中，農(nóng)作物病害的流行有一定的規(guī)律性，在掌握病害的流行規(guī)律之后，可于病害易發(fā)期之前通過連續(xù)噴施，幫助植株度過病害易發(fā)期，從而保證應用效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，當先接種病毒再噴施dsRNA時，僅能起到延遲發(fā)病的效果，推測原因可能與病毒以及dsRNA進入植物的順序有關(guān)，在病毒先進入植物之后，會進行大量的復制增殖，而后dsRNA進入植物時，在植物體內(nèi)形成的siRNA僅抑制了部分病毒的復制增殖，不能完全抑制住病毒的侵染，因此治療效果不佳，后期發(fā)病之后，其癥狀與對照組沒有明顯差別。

目前，尚未有很好的方法防治植物病毒病，但是其在生產(chǎn)上造成的危害又非常嚴重，利用原核表達的方法生產(chǎn)dsRNA，外源噴施dsRNA防治病毒病是一種非常有潛力的方法，解決限制其發(fā)展的生產(chǎn)、包裹、存儲等問題是目前最緊要的任務，如何真正的將該方法應用到實際生產(chǎn)中來，還需要進一步深入研究。

4 結(jié)論

通過設計、擴增、生產(chǎn)ZYMV不同區(qū)域的dsRNA，建立了能夠穩(wěn)定表達和生產(chǎn)dsRNA的原核表達體系，明確了穩(wěn)定生產(chǎn)dsRNA的條件；通過噴施試驗發(fā)現(xiàn)，不同區(qū)域的dsRNA片段均對病毒有很好的預防效果，其中HC-Pro片段的防效最好，能達到95%；但是dsRNA不能長時間在植株表面穩(wěn)定存在，在噴施7 d后，就會喪失預防效果；外源噴施dsRNA的治療效果不明顯，僅能推遲發(fā)病。利用原核表達生產(chǎn)dsRNA，外源噴施的方法防治病毒病是一種很有潛力的方法，探究延長dsRNA在植物表面存在的時間、合適的施用時間以及規(guī)?；a(chǎn)的方法是未來研究的主要方向。

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Prokaryotic expression of dsRNA ofand Its Control efficacy on ZYMV

XIE KunLun, LIU LiMing, LIU Mei, PENG Bin, WU Huijie, GU QinSheng

(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009)

【Objective】(ZYMV) is the most prevalent virus that harms watermelon. The objective of this study is to realize the prevention and treatment of ZYMV by external application of viral gene dsRNA on watermelon. 【Method】Based on the existing ZYMV virus sequence in the laboratory, the NCBI database was used to find the similar sequences for different gene fragments. Then the software DNAMAN8 was used to perform multiple alignment analysis to find the conserved regions. Based on the analysis results, 5 gene fragments of ZYMV 3′UTR, 6K2, HC-Pro, P3 and NIb with a length range of 200-350 bp were selected, at the same time, a GUS gene fragment with a length of 190 bp was selected as a control.Afterthe 6 fragments were amplified by PCR, they were inserted into the vector L4440 containing double T7 promoters by homologous recombination method. the RNAIII enzyme-deficient strain-HT115 was used to construct a prokaryotic expression system for dsRNA production, dsRNA was released by ultrasonic disruption and dissolved in TE buffer (10 mmol·L-1Tris-Hcl and 1 mmol·L-1EDTA). The concentration of IPTG, induction time and ultrasonic breaking time in the production process were compared and analyzed. The dsRNA was applied on watermelon plants by spraying method, two experiments for spraying dsRNA first, then inoculating virus (prevention), and inoculating virus first, then spraying dsRNA (treatment) were designed, and the efficacy of dsRNA prevention and treatment against ZYMV was evaluated by statistical comparison and analysis of the incidence at 21 days after virus inoculation. 【Result】The production system for ZYMV 3′UTR, 6K2, HC-Pro, P3, NIb 5 gene fragments and GUS gene fragment was established, which could express and release dsRNA efficiently and stably. The cells could efficiently produce and release dsRNA after IPTG induced concentration of 8 mmol·L-1, induction time of 7 h, and disruption for 15 min under the condition of Ningbo Xinzhi brand ultrasonic cell disrupter 3? and 60% output power. In the prevention experiment, it was found that the disease incidence of both GUS gene fragment dsRNA and TE buffer spraying treatments was 100%. The best control efficacy on ZYMV was HC-Pro gene fragment, after 21 days of virus inoculation, the efficacy reached 95%, the control efficacy of NIb gene fragment (80%) was relatively poor. On this basis, the efficacy of prevention and treatment of HC-Pro fragment on ZYMV was analyzed in depth. When the ZYMV was inoculated on the 3rd, 5th and 7th day after spraying the dsRNA of HC-Pro fragment, the incidence of disease was 16%, 63% and 63%, respectively. the dsRNA of the HC-Pro fragment was sprayed on the 1st, 3rd, 5th, and 7th day after inoculation of ZYMV, the results show that there is no obvious therapeutic efficacy, and only the onset of disease was delayed.【Conclusion】a prokaryotic expression system was established for dsRNA targeting different gene fragments of ZYMV, and it was found that dsRNA based on HC-Pro gene fragment has the best control efficacy on ZYMV, which can reduce the incidence of disease, delay the onset time of disease, and have the potential for application.

watermelon;(ZYMV); prokaryotic expression; external application; double-stranded RNA (dsRNA); control efficacy

2019-09-09；

2019-11-04

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0201300）、國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-26-13）、中國農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項（1610192019503）

解昆侖，E-mail：xiekunlun1994@163.com。通信000作者古勤生，E-mail：guqinsheng@caas.cn

（責任編輯 岳梅）