基于BMP-Smad/RUNX2信號通路探討固本增骨方含藥血清對大鼠BMSCs增殖和成骨分化的影響＊

宋 敏，鞏彥龍，董 平，2，董萬濤，蔣林博

（1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 蘭州 730000；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 呼和浩特 010110；3. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 蘭州730020；4. 深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院 深圳 518000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的終末分化細(xì)胞是成骨細(xì)胞（Osteoblasts，OB），現(xiàn)有的研究已知OB 和破骨細(xì)胞（Osteoclast，OC）之間的動態(tài)平衡，在維持骨微結(jié)構(gòu)和骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面具有關(guān)鍵作用[1]，這些細(xì)胞參與多種骨病尤其是骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）的病理生理過程。隨著年齡的不斷增加，性激素缺乏等多種因素造成OB 與OC 間動態(tài)平衡關(guān)系被破壞，表現(xiàn)為骨破壞增加而骨形成減少，這在老年女性中最常見，但男性也有較高的風(fēng)險[2]。

雖然OP 被認(rèn)為是老化的預(yù)測結(jié)果，但它是可以避免和可治療的。在過去的幾十年中，主要是通過應(yīng)用雙膦酸鹽阻止骨吸收，近年來，更多研究的注意力集中在通過促進(jìn)骨形成方法來治療OP，現(xiàn)有治療OP的西藥主要包括抗骨吸收和促進(jìn)骨合成的作用，盡管這些藥物在防治OP 的機(jī)制中有一定的改進(jìn)，但是由于擔(dān)心抗再吸收藥物的異常副作用，以及缺乏對維持其長期有效性的確認(rèn)，導(dǎo)致許多患者不易接受這些藥物[3]。而中醫(yī)藥通過對機(jī)體的整體調(diào)節(jié)防治OP，療效顯著、副作用小，對OP 的防治有積極作用。近年，基于誘導(dǎo)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化治療OP 已成為治療骨質(zhì)疏松癥的一種方法[4]。本實(shí)驗(yàn)研究通過體外建立大鼠BMSCs 定向誘導(dǎo)向OB 分化的模型，運(yùn)用固本增骨方含藥血清進(jìn)行干預(yù)，觀察固本增骨方對大鼠BMSCs增殖及成骨分化過程的影響并探討其可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 動物與細(xì)胞

3月齡SPF 級Wistar 大鼠30 只，雌雄各半，體重（200±20）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，在SPF級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，光線晝夜交替各12 h，實(shí)驗(yàn)室溫度：（22 ± 2）℃，濕度：（55 ± 5）%，給予實(shí)驗(yàn)室專用純凈水及飼料喂養(yǎng)，每2天更換墊料1次。Wistar大鼠BMSCs（廣州賽業(yè)生物科技有限公司提供，貨號：RAWMX-01001）。

1.2 藥品與試劑

固本增骨方主要成分：炙黃芪、岷當(dāng)歸、燙狗脊等，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。將上方煎煮、濃縮后制成粉末，生理鹽水配制成25 g·L-1混懸液。BMSCs 完全培養(yǎng)基、BMSCs 成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基、0.1% 明膠（RAWMX-90011，RAWMX-90021，T170313G001），廣州賽業(yè)生物科技有限公司；堿性磷酸酶染液（T170512G001），廣州賽業(yè)生物科技有限公司提供；BGP ELISA 試劑盒（MM-0700R2）、COL-I ELISA 試 劑 盒（MM-0665R2）、OPN ELISA 試 劑 盒（MM-0701R2）、ALP ELISA 試劑盒（MM-0217R2），酶免公司提供。RIZOI 試劑（94206），美國ambion 公司；逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量試劑盒（0000238439）美國Promega公司；PCR 引物（CHPQ332），大連寶生物工程有限公司。

1.3 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-18AIC[UV]），日本SANYO公司；低溫高速離心機(jī)（D37520），美國Kendro 公司；PCR熒光定量儀（C1000），美國BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 固本增骨方含藥血清的制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為2 組，空白血清組10 只、含藥血清組20 只。依據(jù)人與大鼠“體表面積換算法”，按臨床等效劑量給藥，含藥血清組按照10 ml·kg-1固本增骨方混懸液灌胃，空白血清組給予相同體積生理鹽水。連續(xù)給藥7 天，早晚各1 次。末次給藥2 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血，3000 rpm離心15 min取血清，過濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Wistar大鼠BMSCs的培養(yǎng)

復(fù)蘇BMSCs，將其用0.25%胰蛋白酶、0.04%EDTA 消化液在37℃消化2 min 左右后，吸取細(xì)胞懸液至離心管，離心機(jī)設(shè)置3000 rpm 離心5 min，去掉上清，加入培養(yǎng)基重懸。臺盼藍(lán)染色行活細(xì)胞計數(shù)，以3.0 × 104個活細(xì)胞/cm2密度將細(xì)胞接種分瓶后置入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，最終培養(yǎng)出符合實(shí)驗(yàn)要求的BMSCs。

2.3 分組與造模

挑選長勢優(yōu)良的P3 代BMSCs，隨機(jī)分為6 組：依次為空白血清組，傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組，5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組。將P3 代BMSCs 分別接種于5 塊96 孔培養(yǎng)板，每孔依次加入200 ul BMSCs 完全培養(yǎng)基，每組5孔，后置于飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 小時，并吸棄掉各孔培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)分組依次向5 塊培養(yǎng)板加入空白血清、傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素和100 mg·ml-1鏈霉素、抗環(huán)血酸50 mg·L-1，β-甘油 磷 酸 鈉10 mmol·L-1、地 塞 米 松10-7mol·L-1的LDMEM 培養(yǎng)基）[5]、（5%、10%、20%、30%）含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后對各組細(xì)胞測量計數(shù)，每天檢測1 塊培養(yǎng)板，連續(xù)5天。

2.4 大鼠BMSCs增殖的檢測

向上述各組加入相應(yīng)培養(yǎng)液，24 小時后測量6 組細(xì)胞計數(shù)，每天測一塊96 孔板，連續(xù)檢測4 天。向孔板每孔內(nèi)加入MTT及培養(yǎng)液，置37%培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，后吸去培養(yǎng)液，加入DMSO 甘氨酸緩沖液，搖床振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測量OD值，依次測定各組細(xì)胞的相對增殖率。

圖1 P1、P2、P3代BMSCs鏡下形態(tài)×10

表1 組間OD值比較（±s）

表1 組間OD值比較（±s）

注：與空白組比較▲P＞0.05，與空白組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較ΔP＜0.05，與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較■P＜0.05，與5%、10%及30%含藥血清組□P＜0.05。

120hOD值0.394±0.051Δ■0.459±0.228Δ■0.667±0.054Δ■□0.541±0.062Δ■0.435±0.0460.473±0.022Δ組別5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組30%含藥血清組空白組傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組24hOD值0.078±0.001Δ 0.103±0.012Δ 0.108±0.035Δ 0.106±0.004Δ 0.074±0.0010.072±0.002▲48hOD值0.093±0.011Δ■0.273±0.054Δ■0.362±0.013Δ■□0.202±0.012Δ■0.067±0.0110.090±0.012Δ 72hOD值0.426±0.050Δ■0.453±0.026Δ■0.612±0.123Δ■□0.419±0.114Δ■0.363±0.0720.414±0.107Δ 96hOD值0.479±0.041Δ■0.506±0.043Δ■0.705±0.163Δ■□0.546±0.091Δ■0.466±0.0230.476±0.061Δ

2.5 堿性磷酸酶染色

成骨誘導(dǎo)2周后，吸棄培養(yǎng)基，4%中性甲醛固定，按堿性磷酸酶染色試劑盒說明書進(jìn)行染色、固定，光鏡下觀察各組細(xì)胞藍(lán)紫色區(qū)域的密集程度。

2.6 BMSCs成骨標(biāo)志蛋白的檢測

分別取空白對照組、傳統(tǒng)誘導(dǎo)組、固本增骨含藥血清（5%、10%、20%、30%）組1 × 106BMSCs，在4℃用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，加入的RIPA 裂解液（含1%PMSF），于冰上裂解30分鐘，后收集細(xì)胞裂解物，設(shè)置12000 rpm、離心10 分鐘，吸取上清液。按ELISA 試劑盒說明書步驟，檢測一型膠原蛋白（COL-I）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣蛋白（BGP）、骨橋蛋白（OPN）四種蛋白OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及所對應(yīng)OD 值，繪制每組蛋四種蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線（R＞0.99），后根據(jù)函數(shù)式計算各組四種蛋白的濃度，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.7 BMPs信號通路相關(guān)基因的檢測

取空白對照血清組、（5%、10%、20%、30%）濃度含藥血清，培養(yǎng)7 天，采用trizol 法提取總RNA，核酸蛋白儀檢測總RNA 的濃度及純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。設(shè)計引物及反應(yīng)體系。后在RT-PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。檢測樣本的中BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2的CT值。根據(jù)各組樣本CT值與2-ΔΔCT值，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法，LSD 方法進(jìn)行多組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BMSCs培養(yǎng)結(jié)果

BMSCs P1 代培養(yǎng)1 天后，鏡下觀察可見細(xì)胞呈圓形且折光性強(qiáng)；培養(yǎng)5 天小時后，見形態(tài)呈條柱狀、分叉狀貼壁生長；P2、P3 代培養(yǎng)5 天后見細(xì)胞增殖分裂加快，逐漸呈纖維細(xì)胞長梭狀形態(tài)，結(jié)果見圖1。

3.2 各組BMSCs的增殖

在最初24 h 傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組與空白組OD 值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但各含藥血清組與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組及空白組OD 值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；后面四個時間點(diǎn)各藥物組OD 值與空白組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各含藥血清組與空白組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組（何為傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)？）OD 值比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且20%含藥血清組與5%、10%及30%含藥血清組OD 值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表1。

3.3 各組細(xì)胞堿性磷酸酶染色結(jié)果比較

堿性磷酸酶染色后鏡下觀察可見各濃度固本增骨膠囊含藥血清組及傳統(tǒng)誘導(dǎo)組細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)紫色染色陽性區(qū)，且藍(lán)紫色染色陽性區(qū)隨含藥血清濃度增加染色區(qū)域逐漸密集，在濃度為20%時染色區(qū)域最密集，當(dāng)濃度為30%時，染色區(qū)域減少，結(jié)果見圖2。

圖2 各組細(xì)胞堿性磷酸酶染色結(jié)果100×

3.4 各組BMSCs 成骨標(biāo)志蛋白BGP、OPN、ALP、COL-I含量

5%、10%、20%含藥血清組與其他各組比較，BGP、OPN、ALP、COL-I四種成骨標(biāo)志蛋白含量具有明顯差異（P＜0.05），其中20%含藥血清組與5%、10%含藥血清組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而30%含藥血清組與空白組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較，四種成骨標(biāo)志蛋白含量無明顯差異（P＞0.05），傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組與空白組四種成骨標(biāo)志蛋白含量比較無明顯差異（P＞0.05），結(jié)果見表2。

表2 各組BMSCs成骨標(biāo)志蛋白含量比較（±s，μg/L）

表2 各組BMSCs成骨標(biāo)志蛋白含量比較（±s，μg/L）

注：與30%含藥血清組、空白組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較▲P＜0.05，與5%、10%含藥血清組ΔP＜0.05，與空白組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較■P＞0.05，與空白組比較P＞0.05。

COL-I 15.934±3.544▲21.38±3.627▲25.34±5.239▲Δ 6.479±1.253■6.097±0.8956.448±1.002□組別5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組30%含藥血清組空白組傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組BGP 7.493±1.986▲7.992±1.91▲9.509±2.393▲Δ 1.405±0.328■1.468±0.2701.611±0.389□OPN 16.551±3.094▲18.405±2.149▲21.773±8.064▲Δ 1.648±0.725■1.645±0.2771.778±0.322□ALP 22.829±1.472▲26.63±4.652▲27.804±4.358▲Δ 6.266±0.133■6.145±0.0336.186±0.101□

3.5 各組細(xì)胞BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA表達(dá)比較

20%含藥血清組與其他各組蛋白表達(dá)比較有顯著差異（P＜0.05），5%、10%及30%含藥血清組與空白組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)蛋白表達(dá)比較無明顯差異（P＞0.05），傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組與空白組蛋白表達(dá)比較無明顯差異（P＞0.05），結(jié)果見表3。

4 討論

OP是一種多因素疾病，其表現(xiàn)為骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致典型的低能量脆性骨折發(fā)生率增加[6]。人口老齡化對OP 的發(fā)生和進(jìn)展具有巨大的影響，這在絕經(jīng)后婦女中更為明顯，其中骨轉(zhuǎn)換的比例隨著雌激素的缺乏而增加，并導(dǎo)致持續(xù)的骨損傷[7]。據(jù)統(tǒng)計全世界有2 億多人患有骨質(zhì)疏松癥，50 歲以上的女性中近1/2 和男性中近1/5 可能發(fā)生骨折[8]。治療OP 的目的是減少骨丟失，維持骨密度，新療法如基于BMSCs 高成骨分化能力為基礎(chǔ)的治療，能通過增加患者缺失的礦物質(zhì)密度和駐留BMSCs 的數(shù)量及其功能返回[9]，可運(yùn)用不同方式誘導(dǎo)BMSCs 向成骨增殖和分化，BMSCs 向成骨細(xì)胞的生成和對破骨細(xì)胞的抑制可減少骨密度損失[10]，阻止骨質(zhì)疏松，進(jìn)而降低OP 骨折發(fā)生率。已有的研究顯示[11]將異基因BMSCs 注射在去卵巢OP 大鼠模型或糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)OP 大鼠模型中，都能刺激OB 的發(fā)生和連續(xù)持續(xù)的骨形成，而改變了骨量和骨強(qiáng)度，這是不同因素的作用誘導(dǎo)BMSCs 向OB 分化和BMSCs 的作用使OB 的成骨作用增強(qiáng)，但是如何有效的誘導(dǎo)BMSCs 在體內(nèi)外向OB 分化并促進(jìn)其成骨作用，仍然有多種不確定的因素。研究顯示[12-14]，中醫(yī)藥可以調(diào)控基因、信號通路、細(xì)胞因子等多途徑誘導(dǎo)BMSCs 向OB 分化并促進(jìn)其成骨作用。本實(shí)驗(yàn)研究運(yùn)用固本增骨方含藥血清進(jìn)行干預(yù)BMSCs 誘導(dǎo)其向OB 分化，觀察固本增骨方對大鼠BMSCs 增殖及成骨分化過程的影響并探討其可能的機(jī)制。

表3 各組細(xì)胞BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組細(xì)胞BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與其他各組比較▲P＜0.05，與空白組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較ΔP＞0.05，與空白組比較■P＞0.05。

RUNX21.144±0.287Δ 1.282±0.391Δ 1.825±0.103▲1.061±0.113Δ 0.932±0.0840.968±0.119■組別5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組30%含藥血清組空白組傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組BMP21.053±0.259Δ 1.171±0.264Δ 1.776±0.381▲1.015±0.152Δ 0.923±0.1280.993±0.270■BMP41.163±0.012Δ 1.252±0.014Δ 1.72±0.049▲1.009±0.021Δ 0.958±0.2200.981±0.080■Smad11.09±0.15Δ 1.32±0.19Δ 1.84±0.45▲1.017±0.09bΔ 0.94±0.010.94±0.02■

BMSCs 的增殖情況來看，各組固本增骨方含藥血清組在培養(yǎng)24小時后比空白組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組OD值比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明且固本增骨方含藥血清能促進(jìn)BMSCs增殖，并且在20%含藥血清組較5%、10%及30%含藥血清組OD 值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明20%含藥血清對BMSCs 增殖最具促進(jìn)作用，堿性磷酸酶染色后鏡下觀察細(xì)胞增殖情況，也印證了這一結(jié)果，可見藍(lán)紫色陽性區(qū)隨含藥血清濃度增加染色而逐漸逐漸密集，在濃度為20%時染色區(qū)域最密集，當(dāng)濃度為30%時，染色區(qū)域減少。BGP、OPN、ALP、COL-I 是成骨標(biāo)志蛋白，非膠原蛋白BGP 是骨形成的特異性標(biāo)志物，其能夠抑制異常的羥磷灰石結(jié)晶的形成及軟骨的礦化速率，進(jìn)而維持骨量、參與骨重塑[15]；ALP 在誘導(dǎo)BMSCs 向OB分化及維持骨代謝平衡過程中具有重要的意義[16]；OPN 可能是影響絕經(jīng)后婦女腰椎骨量丟失的關(guān)鍵因子[17]；COL-I 的結(jié)果、含量及穩(wěn)定性改變，與OP 的發(fā)生關(guān)系密切[18]；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5%、10%、20%含藥血清組與其他各組BGP、OPN、ALP、COL-I 含量比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且20%含藥血清組與5%、10%含藥血清組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明20%含藥血清組最具有促進(jìn)BMSCs 成骨的作用。BMPSmad信號通路在成骨細(xì)胞增殖、遷移及促進(jìn)骨形成過程中起著關(guān)鍵作用，其與OP 的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，Smad 參與了BMP（包括BMP2、BMP4）對RUNX2 表達(dá)的上調(diào)，研究顯示，原硅酸誘導(dǎo)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化及成骨過程中，BMP-Smad/RUNX2信號通路的活化促進(jìn)BGP、OPN、COL-I 的合成[19]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20%含藥血清組與其他各組BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA 表達(dá)比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明20% 含藥血清組能促進(jìn)BMSCs 成骨BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA的表達(dá)。

目前西醫(yī)對OP 的治療通過抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成，這些西藥又有不同程度的不良反應(yīng)、患者依從性差等。固本增骨方是甘肅中醫(yī)藥大學(xué)宋敏教授經(jīng)驗(yàn)方，由道地中藥材炙黃芪、岷當(dāng)歸、燙狗脊等組成，治療OP 以整體觀念、辨證論治為原則，具有服用方便，療效穩(wěn)定，副作用小等優(yōu)點(diǎn)，具有益氣健脾、補(bǔ)腎壯骨、活血通絡(luò)之功效，標(biāo)本兼顧，能有效緩解老年脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松癥狀[20-21]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，固本增骨方能促進(jìn)BMSCs 的增殖，并且能促進(jìn)成骨標(biāo)志蛋白BGP、OPN、ALP、COL-I 蛋白含量的增加，這個機(jī)制可能是激活了BMP-Smad/RUNX2 信號通路實(shí)現(xiàn)的。