調(diào)衡方對Lewis肺癌荷瘤體巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響＊

張宏方，鄭 玉，李文俠，劉 洋，徐洋洋，王媛媛，張怡敏

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)病原微生物及檢驗(yàn)學(xué)教研室 咸陽 712046）

理沖湯為近代醫(yī)學(xué)家張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》里的治療婦人經(jīng)閉不行，或產(chǎn)后惡露不盡，結(jié)為癥瘕的經(jīng)典名方，現(xiàn)代臨床多用于對婦科腫瘤、女子不月、盆腔炎等女子常見病癥的治療[1]。我校腫瘤學(xué)科組，經(jīng)多年的實(shí)驗(yàn)和臨床研究經(jīng)驗(yàn)積累，以“理沖湯”（來源于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》）為基礎(chǔ)，化裁出對腫瘤具有抑制其轉(zhuǎn)移、增殖與調(diào)節(jié)荷瘤體免疫功能的調(diào)衡方。調(diào)衡方前期研究結(jié)果顯示[2-9]本方對抑制Lewis 肺癌的轉(zhuǎn)移有一定效果，該方提取的粗多糖可提升體外巨噬細(xì)胞的吞噬力及荷瘤體紅細(xì)胞免疫等功能，但調(diào)衡方對荷瘤體內(nèi)巨噬細(xì)胞的作用如何？這方面仍未揭示清楚，本次實(shí)驗(yàn)以荷瘤體腹腔巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)，從調(diào)控巨噬細(xì)胞吞噬能力及胞內(nèi)酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）活性等途徑切入，探討調(diào)衡方抗瘤的巨噬細(xì)胞免疫作用及機(jī)制?，F(xiàn)總結(jié)如下文。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器和試劑

本研究的主要儀器包括：寶特Epoch 微孔板酶標(biāo)儀為美國BioTek公司生產(chǎn)；ImagePro plus 6.0圖形分析版軟件為MediaCybernetic 公司產(chǎn)品；培養(yǎng)板與細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自Coming 公司；CKX-41 型倒置顯微鏡購自O(shè)lympus 公司；CO2 培養(yǎng)箱為Napco 公司產(chǎn)品；722E 型分光光度計(jì)為上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平為上海精密儀器公司產(chǎn)品（FA1104N），層流凈化工作臺為北京市半導(dǎo)體設(shè)備廠產(chǎn)品），分析天平（ALC-110型，德國賽多利斯公司)；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-1型，天津市泰斯特儀器有限公司），離心機(jī)（LD4-2A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。細(xì)胞計(jì)數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；PH 值測定儀，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

本研究的主要試劑包括：貞芪扶正膠囊為甘肅新蘭藥藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號J201510501。IL-1、IL-6、TNF-α試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。Lewis 肺癌株，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。細(xì) 胞 培 養(yǎng) 液RPMI1640（Gibco），β-甘 油 磷 酸 鈉（Sigma），胰蛋白酶（華美生物工程公司產(chǎn)品）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC26112（購自北京中國藥品生物制品檢定所）；FBS（fetal bovine serum）胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品）；青霉素與鏈霉素均為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品；墨汁為倉南縣構(gòu)思紙塑制品廠生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

調(diào)衡方組方中有生山藥30 g，生黃芪30 g，白花舌蛇草30 g，天花粉12 g，西洋參15 g，天門冬、生雞內(nèi)金、莪術(shù)各10 g，水蛭3 g等，處方中的中藥經(jīng)陜西中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科主任中藥師王凡的鑒定，全部符合二零一五版藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。對上述組方中的藥物，依據(jù)其性質(zhì)，按一定的制備工藝，加工為lmL含生藥3 g流浸膏，分裝滅菌后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6 雄性小鼠（購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心），二級，體重（20±2）g，6～8 周齡，置本校生物技術(shù)與免疫實(shí)驗(yàn)中心二級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。動物合格證號：SCXK（陜）2012-003。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模與給藥方法

按體重法將C57BL/6小鼠隨機(jī)分6組，每組10只，分別為正常組、荷瘤模型組、貞芪膠囊組（陽性組）、調(diào)衡方小、中、大劑組。將培養(yǎng)計(jì)數(shù)為6.5×106個/mL 的Lewis 肺癌接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，每只0.2 mL，復(fù)制成模型荷瘤小鼠（正常組除外）。于接種24 h 后灌胃給藥，用生理鹽水將調(diào)衡方每l mL 含生藥3 g 濃縮液稀釋為大、中、小劑組，且調(diào)配為等容積每只鼠0.2 mL 灌胃。依據(jù)動物與人體表面積折算公式，經(jīng)換算貞芪膠囊組（陽性組）用藥量為41.5 g/kg，調(diào)衡方大、中、小劑量組為50 g/kg、25 g/kg、12.5 g/kg，即每日每只小鼠灌胃生藥量陽性組0.83 g，調(diào)衡方大、中、小劑組用生藥量為1.0 g、0.5 g、0.25 g；荷瘤模型組給予生理鹽水等容量灌胃，給藥8天。

2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)、菌懸液的制取

依據(jù)文獻(xiàn)[10]與經(jīng)驗(yàn)，于用藥8 天后，用75%酒精將脫頸處死的C57BL/6小鼠浸泡6 min左右，取出仰臥平放于無菌操作臺固定，從小鼠尾部至上腹部剝開小鼠毛皮，腹腔肌肉層露出，將無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液5 mL注入小鼠腹腔，靜待5 min左右（小鼠腹部輕揉2～3 min）后，用5 mL 無菌針管從腹腔兩側(cè)抽取約4.5 mL腹腔液，離心（1200 r·min-1，10 min）洗滌后顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞至所需濃度（培養(yǎng)液為含雙抗及10% 胎牛血清的RPMI-1640），置巨噬細(xì)胞于有無菌蓋玻片的6 孔板及24 孔板內(nèi)，放入37℃5% CO2培養(yǎng)箱中，12 h后換液除去未貼壁的少數(shù)雜細(xì)胞，培養(yǎng)待用。

取菌種金黃色葡萄球菌接種在細(xì)菌固體平板培養(yǎng)基上，置37℃溫箱18～24 h 后，用接種環(huán)獲取5個左右菌落，放入無菌生理鹽水中混勻，用0.5 麥?zhǔn)媳葷峁苄Ｕ錆岫葹?.5 × 108CFU（colony-forming units，CFU）/mL 的菌落形成單位，將此制備活化后的金葡菌的菌懸液貯存于4℃冰箱中備用。

2.3 指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 調(diào)衡方各干預(yù)組、荷瘤模型組與正常組活細(xì)胞的形態(tài)觀察

取調(diào)衡方各干預(yù)組、荷瘤模型組與正常組腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，置于倒置顯微鏡下觀察各組巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化特征。

2.3.2 墨汁吞噬試驗(yàn)

各干預(yù)組培養(yǎng)48 h 后的巨噬細(xì)胞，每孔中加入墨汁（稀釋2 倍）20 μL，6 孔板繼續(xù)放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約4 h 左右，觀察（倒置顯微鏡下）各干預(yù)組巨噬細(xì)胞吞噬墨汁的狀況。當(dāng)發(fā)現(xiàn)各干預(yù)組及正常對照組細(xì)胞有墨汁顆粒被吞入時，洗滌細(xì)胞（用RPMI-1640不含血清的培養(yǎng)液），然后用10%甲醛固定細(xì)胞，甘油明膠封片，再用有照相功能的倒置顯微鏡觀察拍照。用ImagePro plus 6.0 圖形分析軟件計(jì)算其陽性表達(dá)百分率。

2.3.3 吞噬金葡菌試驗(yàn)

各干預(yù)組培養(yǎng)48 h 后的巨噬細(xì)胞，每孔中加入金黃色葡萄球菌懸液50 μL，24 孔板繼續(xù)放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約隔24 h，輕吸各組10 孔中的菌懸液，加入722E 型分光光度計(jì)比色皿內(nèi)，于560 nm 處測定每組的吸光度A值。

圖1 不同各組對巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響（200×）

2.3.4 胞內(nèi)經(jīng)ACP染色的Mφ活性觀察

各干預(yù)組培養(yǎng)48 h 后的巨噬細(xì)胞，棄去每孔中的培養(yǎng)液，于4℃冰箱內(nèi)用10%中性甲醛固定細(xì)胞30 min，然后用水洗5 min，再用酸性磷酸酶孵育液（含蒸餾水90 mL，5%醋酸鉛4 mL，2%β-甘油磷酸鈉4 mL，0.2 mol/L 磷酸緩沖液10 mL）于37℃溫育30 min，自來水漂洗，再用1%硫化銨處理4 min 左右，繼續(xù)用自來水沖洗后，用鑷子取出爬有Mφ的蓋玻片，明膠甘油封片，再用有照相功能的倒置顯微鏡觀察胞內(nèi)經(jīng)ACP 染色的Mφ活性并拍照。用ImagePro plus 6.0 圖形分析軟件計(jì)算其陽性表達(dá)百分率。

2.3.5 酶聯(lián)免疫吸附測定檢測巨噬細(xì)胞上清中IL-1、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平

將獲取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞去雜純化后，均勻接種到培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)48 h，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各培養(yǎng)組Mφ上清中IL-1、IL-6、TNF-α三項(xiàng)指標(biāo)，在450 nm處使用酶標(biāo)儀測定其A值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是以各實(shí)驗(yàn)組與荷瘤模型組進(jìn)行兩組間t檢驗(yàn)，各數(shù)據(jù)均采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。

3 結(jié)果

3.1 調(diào)衡方干預(yù)及荷瘤模型組對巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

荷瘤對照Mφ組與正常組Mφ形態(tài)比較，其在形態(tài)上大小、數(shù)量有較大的差異，荷瘤對照組巨噬細(xì)胞形態(tài)瘦小，數(shù)量稀少，多為小圓形，表明固有Mφ免疫功能極度低下。正常組的Mφ形態(tài)多呈橢圓形、圓形及帶尾的三角形，有的巨噬細(xì)胞形態(tài)帶有長的尾巴呈蝌蚪行，一些Mφ有偽足或突起且數(shù)量多而飽滿；而調(diào)衡方干預(yù)各組、貞芪膠囊組巨噬細(xì)胞的體積較荷瘤模型組的明顯增大。見圖1A，B，C，D，E，F(xiàn)。

3.2 調(diào)衡方干預(yù)及荷瘤模型組對巨噬細(xì)胞吞噬墨汁的影響

調(diào)衡方各組干預(yù)后，體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞48 h，再加墨汁4 h 左右，荷瘤對照組與正常組巨噬細(xì)胞吞噬墨汁相比，荷瘤模型組吞噬墨汁顆粒數(shù)量顯著降低，差異非常顯著（P＜0.01），本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，調(diào)衡方大、中劑量組及貞芪組Mφ吞噬的墨汁顆粒數(shù)目比之荷瘤組及小劑量組明顯增多。而在墨汁吞噬陽性面積的計(jì)算中，調(diào)衡方大、中劑量組及貞芪組與荷瘤組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而小劑量濃度組細(xì)胞內(nèi)的墨汁顆粒與對照組比較增多不明顯（P＞0.05）。見圖2中A，B，C，D，E，F(xiàn)和圖3。

表1 調(diào)衡方對荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞中吞噬墨汁、酸性磷酸酶染色及對金葡菌吸光度值的測定結(jié)果（±s）

表1 調(diào)衡方對荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞中吞噬墨汁、酸性磷酸酶染色及對金葡菌吸光度值的測定結(jié)果（±s）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與荷瘤對照組比較，※P＜0.05；※※P＜0.01；NS：0.9%氯化鈉；☆：各組動物均為10只。

組別☆正常對照組荷瘤對照組貞芪膠囊組調(diào)衡方小劑量組調(diào)衡方中劑量組調(diào)衡方大劑量組劑量/（g·kg-1）NS NS 41.512.52550吞噬墨汁陽性率/%4.43±0.60※※1.14±0.33△△3.70±0.82※※2.38±1.915.42±1.50※※6.72±1.28※※ACP染色陽性率/%2.19±0.86※※1.02±0.59△△3.67±1.91※※1.54±0.594.66±1.50※※5.18±1.53※※A值/吸光度值0.313±0.038※0.355±0.045△0.286±0.037※※0.341±0.0590.273±0.051※※0.245±0.037※※

3.3 調(diào)衡方干預(yù)及荷瘤模型組對巨噬細(xì)胞吞噬金葡菌的影響

用藥各組體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞48 h，在金葡菌懸液干預(yù)后，荷瘤模型組與正常組比較，吸光度值明顯降低（P＜0.05），而調(diào)衡方干預(yù)各組與荷瘤模型組比較，大、中濃度組及貞芪膠囊組巨噬細(xì)胞吞噬作用明顯，吸光度值明顯降低（P＜0.01），而調(diào)衡方小劑組無明顯差異（P＞0.05），說明調(diào)衡方能增強(qiáng)Mφ對金葡菌的清除力。見表1和圖4。

圖3 不同各組培養(yǎng)巨噬細(xì)胞48 h后的吞噬墨汁狀態(tài)

3.4 調(diào)衡方干預(yù)及荷瘤模型組對巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的影響

各干預(yù)組培養(yǎng)48 h 后的Mφ組與荷瘤模型組比較，發(fā)現(xiàn)調(diào)衡方各組Mφ內(nèi)ACP染色的顏色較深，且呈劑量依賴性，劑量越大，染色越深，這說明調(diào)衡方對Mφ內(nèi)ACP 含量有顯著提高作用，且在ACP 染色陽性面積的計(jì)算中，大、中劑量組與荷瘤組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。貞芪組不論是鏡下觀察還是在面積百分比計(jì)算中，同樣表現(xiàn)出對Mφ強(qiáng)大的激活作用（P＜0.01），而調(diào)衡方小劑組無明顯差異（P＞0.05）。見圖5中A，B，C，D，E，F(xiàn)和圖6。

3.5 調(diào)衡方對巨噬細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α的影響

小鼠接種荷瘤后IL-1、IL-6及TNF-α均有不同程度升高（P＜0.01），與荷瘤組比較，調(diào)衡方大、中劑量以及貞芪組中Mφ上清因子IL-1、IL-6 以及TNF-α含量顯著下降（P＜0.05；P＜0.01），但小劑量組無明顯變化。調(diào)衡方劑量的大小與IL-1、IL-6以及TNF-α的含量呈負(fù)相關(guān)，說明調(diào)衡方能夠通過降低Mφ分泌上清因子如IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子來減少腫瘤的浸潤，從而減緩腫瘤的發(fā)展。見表2、圖7。

圖4 各組巨噬細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌的吸光度A值狀況

4 討論

圖7 各組上清液中IL-1、IL-6、TNF-α濃度（與荷瘤對照組比）

肺癌位于惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率的前列，其生存率不足20%，且沒有明顯的提升跡象，男性惡性腫瘤中肺癌居首位，而女性僅排其后[11-12]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)多以手術(shù)與化療來治療該病，其短期療效明確而肯定，但長期療效因免疫受損低下而致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與化療毒副作用的制約而不容樂觀。肺癌屬于“肺積”“癌病”“積聚”等范疇，其病機(jī)是氣、血、痰、瘀、毒凝滯而成。調(diào)衡方具有益氣生血養(yǎng)陰、清熱解毒、活血祛瘀之功效。前期研究結(jié)果顯示[2-9]本方可抑制Lewis 肺癌的轉(zhuǎn)移，可提升機(jī)體免疫等功能，本研究以荷瘤體腹腔Mφ為作用點(diǎn)，從調(diào)控Mφ吞噬能力及胞內(nèi)ACP 的活性等的途徑切入，探討了調(diào)衡方對荷瘤鼠的巨噬細(xì)胞免疫作用的影響。

表2 各組上清液中IL-1、IL-6、TNF-α的含量（單位pg/mL，±s）

表2 各組上清液中IL-1、IL-6、TNF-α的含量（單位pg/mL，±s）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與荷瘤對照組比較，※P＜0.05；※※P＜0.01；NS：0.9%氯化鈉；☆：各組動物均為10只。

組別☆正常對照組荷瘤對照組貞芪膠囊組調(diào)衡方小劑量組調(diào)衡方中劑量組調(diào)衡方大劑量組劑量/（g·kg-1）NS NS 41.512.52550 IL-113.9±4.2534.75±1.65△△20.16±3.55※※32.79±2.5026.19±3.09※19.53±4.67※※IL-664.4±7.98117.9±17.36△△71.86±7.87※※107.07±14.7691.44±10.26※67.16±8.28※※TNF-α 72.36±8.89101.62±3.83△△81.57±6.89※※98.15±5.8286.13±6.69※79.19±9.42※※

現(xiàn)代研究表明，長期機(jī)體免疫抑制或低下，發(fā)生腫瘤的概率將高，同時，腫瘤增殖期間患者的免疫功能被抑制，二者也互為因果[13]。針對腫瘤免疫力低下病變的預(yù)防治療，中醫(yī)藥已有數(shù)千年的理論及臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，中醫(yī)的“益氣”可直接扶助正氣；“解毒”能減少邪氣對正氣的耗傷；“活血化瘀”能夠祛除局部瘀血阻滯，消除積聚或癥瘕，恢復(fù)病灶的血液循環(huán)，使瘀血去，新血生，化生正氣。則“益氣解毒化瘀”能增加機(jī)體的“正氣”,而“正氣”盛,則機(jī)體的“免疫力”強(qiáng)。因此，采用益氣生血養(yǎng)陰、清熱解毒、活血祛瘀之功效的調(diào)衡經(jīng)驗(yàn)方，可用于治療轉(zhuǎn)移性肺癌。況大量研究表明，“益氣生血、化瘀解毒”復(fù)方中藥可通過多方面調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，從而達(dá)到抑制腫瘤的作用[14-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)衡方大、中各組對Mφ吞噬墨汁力明顯增強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌菌懸液的廓清吞噬力明顯提升，與荷瘤對照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與荷瘤對照組比較，調(diào)衡方各組干預(yù)后的ACP 活性含量均表現(xiàn)出不同程度的提升，隨著劑量增大，Mφ胞內(nèi)ACP 活性增加明顯。

巨噬細(xì)胞主要參與體內(nèi)固有免疫應(yīng)答，也作為重要的抗原提呈細(xì)胞而參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其表面有多種受體，如Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）與脂多糖（lipoplysaccharide，LPS）受體等，其胞內(nèi)有多種酶，巨噬細(xì)胞兩個最大的特征就是強(qiáng)大的吞噬外來異物（如吞噬墨汁、雞紅細(xì)胞）與ACP 酶活性高。當(dāng)外來異物與巨噬細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，其便被激活，這時其體積增大，吞噬活力巨增，胞內(nèi)多種酶活性顯著增強(qiáng)，尤其是ACP 升高是巨噬細(xì)胞被激活的標(biāo)志之一[19-20]，同時，Mφ廓清異物的功能增強(qiáng)，Mφ清除胞內(nèi)物主要靠其吞噬溶酶體消化處理，強(qiáng)大的吞噬溶酶體除了清除異物外，還可以將異物的特異性抗原肽提呈給T 淋巴細(xì)胞，即Mφ不僅參與固有免疫應(yīng)答，還參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，調(diào)衡方能夠增強(qiáng)Mφ吞噬及廓清能力，激活A(yù)CP 酶活性，刺激Mφ成熟活化，而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

炎性因子TNF-α,IL-1 及IL-6 為Mφ所分泌，Mφ對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著不可忽略的正/負(fù)調(diào)節(jié)，已有研究證實(shí)IL-1、IL-6、TNF-α在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著“雙刃劍”的角色[21-25]。腫瘤生長的早期階段，Mφ的免疫吞噬作用及抗原呈遞作用表現(xiàn)為高水平的Mφ浸潤可以抑制腫瘤生長，而在低濃度下支持腫瘤生長[26-27]。在炎性過程中Mφ所分泌的TNF-α,IL-1 及IL-6 炎性因子起到關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，調(diào)衡方能夠抑制Mφ分泌炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α，從而降低腫瘤浸潤，延緩腫瘤轉(zhuǎn)移及發(fā)展。

綜上所述，可推測調(diào)衡方對Lewis 肺癌荷瘤體的治療，可能與其降低炎癥細(xì)胞因子，提升巨噬細(xì)胞吞噬廓清力及胞內(nèi)ACP 酶活性增高有關(guān)。而IL-1、IL-6、TNF-α又是調(diào)控巨噬細(xì)胞分型的重要細(xì)胞因子。這為本課題組后續(xù)探討調(diào)衡方是否重塑Mφ以M1 增多為主，指明了研究方向。