菊粉內(nèi)切酶在畢赤酵母中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

王 淮，羅文浩，普元倩，徐春萍，楊健康

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南，大理 671000； 2. 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院，廣東，廣州 510080）

1998 年Uhm 等人從無花果曲霉（Aspergillus ficuum）中分離到了一種新的菊粉內(nèi)切酶基因，命名為inu2[1]。該基因編碼了一個(gè)493 個(gè)氨基酸的蛋白，分子量約54 KD。N 端含有的一個(gè)23 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，使得該蛋白可以分泌到胞外。畢赤酵母（Pichia pastoris）作為高效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，到目前為止已經(jīng)有上百種外源蛋白成功地在該系統(tǒng)中得到表達(dá)[2-3]。作為使用廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有比較明顯的優(yōu)點(diǎn)：在基因工程上操作起來比較簡(jiǎn)單、可以比較高的密度進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，相比原核表達(dá)系統(tǒng)它可以對(duì)表達(dá)的重組蛋白翻譯后進(jìn)行加工修飾等[4-5]。但是畢赤酵母中并不是所有想要表達(dá)的外源基因都是高表達(dá)，部分基因表達(dá)低的原因之一是由于不同種屬間對(duì)使用的密碼子的偏好性不同及外源表達(dá)序列沒有合理的（G+C）含量造成的。研究表明，對(duì)外源蛋白編碼基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，大部分情況下都能提高外源蛋白的表達(dá)水平[6-7]。因此，我們下載了無花果曲霉菊粉內(nèi)切酶基因的編碼序列，做了密碼子優(yōu)化后對(duì)基因進(jìn)行了全合成，然后在畢赤酵母GS115 中利用分泌載體pPIC9K 進(jìn)行了分泌表達(dá)，在上清渡中獲得了很高的酶活。同時(shí)，我們對(duì)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)菊粉內(nèi)切酶酶解底物菊粉的最終產(chǎn)物進(jìn)行了高效液相色譜（HPLC）分析。

1 材料與方法

1.1 基因

下載無花果曲霉菊粉內(nèi)切酶基因（inu2）的序列（NCBI 編號(hào)AJ006951），編碼序列長(zhǎng)度為1,551 bp，編碼了一個(gè)516 個(gè)氨基酸的蛋白。N 端含有一個(gè)23 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，使得該蛋白可以分泌到胞外。因?yàn)楸磉_(dá)載體pPIC9K 帶有自己的信號(hào)肽序列，所以需要去除基因自己的信號(hào)肽，去除信號(hào)肽序列后，基因編碼序列長(zhǎng)度為1,482 bp。

1.2 方法

1.2.1 密碼子優(yōu)化及評(píng)估

使用在線優(yōu)化軟件JCat（http://www.jcat.de）對(duì)菊粉內(nèi)切酶基因進(jìn)行優(yōu)化[8]，JCat 根據(jù)原核生物和真核生物的密碼子使用偏好不同對(duì)待表達(dá)基因的序列進(jìn)行一定的優(yōu)化調(diào)整。我們選擇根據(jù)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的密碼子使用偏好對(duì)無花果曲霉的菊粉內(nèi)切酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。

調(diào)整優(yōu)化后的序列用BioEdit 軟件將DNA 序列翻譯為蛋白質(zhì)序列并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，比較優(yōu)化前后的蛋白質(zhì)序列，要確認(rèn)蛋白質(zhì)序列沒有因?yàn)槊艽a子優(yōu)化而改變。因?yàn)榈鞍追g的效率同RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過影響蛋白的翻譯從而影響了基因的表達(dá)水平，所以根據(jù)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以對(duì)基因能否高表達(dá)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前的預(yù)測(cè)分析[9]。本研究使用RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件ViennaRNA Web Services ( http://rna.tbi.univie.ac.at ) 中的RNAfold Server，得到密碼子優(yōu)化前后基因序列的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)[10]。

1.2.2 全基因合成及載體構(gòu)建

由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行全基因合成，兩頭含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。全基因合成后的基因片段構(gòu)建于pGH 質(zhì)粒中，pGH 質(zhì)粒為Amp 抗性。抽提質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ對(duì)pGH 質(zhì)粒以及即將連入的pPIC9K 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收1.5 kb inu2 基因片段，并與pPIC9K 質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建pPIC9K-inu2 質(zhì)粒，并測(cè)序保證序列正確。

1.2.3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化、多拷貝菌株篩選及搖瓶培養(yǎng)

用BglⅡ限制性內(nèi)切酶酶切pPIC9K-inu2 質(zhì)粒使載體線性化，并采用LiCl 法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115細(xì)胞。涂布于MD 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d。從MD 平板上挑取生長(zhǎng)良好的菌體少許，在含有不同抗生素G418 濃度（2、3、4 mg/mL）的YPD 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3 d。在不同G418 濃度都生長(zhǎng)較好的克隆即為高拷貝菌種。

將具有多個(gè)拷貝的克隆分別接種到BMGY 搖瓶培養(yǎng)基內(nèi)，在30 ℃培養(yǎng)24 h。離心收集菌體，將收集的菌體轉(zhuǎn)接到BMMY 搖瓶培養(yǎng)基中，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)3 d 后，收集搖瓶的上清液。

1.2.4 菊粉內(nèi)切酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.4.1 酶活測(cè)定

采用SDS-PAGE 分析目的蛋白[11]。將收集的上清液稀釋10 倍，取50 μL 稀釋后的上清液加入450 μL菊粉標(biāo)準(zhǔn)溶液中（2%菊粉溶解在NaAC-HAC 的緩沖液中，pH6.0），55 ℃反應(yīng)10 s。用二硝基水楊酸法（DNS 法）測(cè)定菊粉內(nèi)切酶將菊粉酶解后產(chǎn)生的還原糖[12-13]。100 ℃高溫煮沸10 min，使上清液中的菊粉內(nèi)切酶失去活性并作為對(duì)照。

酶活力定義為1 min 內(nèi)產(chǎn)生1 μmol 還原糖所需的菊粉內(nèi)切酶為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.4.2 酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

分別在不同溫度（40、45、50、55、60、65、70 ℃）測(cè)定酶活，研究菊粉內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度；研究該酶的熱穩(wěn)定性，將酶在不同溫度（40、50、60 ℃）放置，在12、24、36、48、60、72 h 取樣分別測(cè)定酶剩下的酶活，從而確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.4.3 酶的最適反應(yīng)pH 值

分別在不同的pH（4.0～9.0）條件下測(cè)定菊粉內(nèi)切酶酶活，研究確定該酶的最適反應(yīng)pH 值。

1.2.5 菊粉內(nèi)切酶水解產(chǎn)物分析

用醋酸緩沖液配制 2%（w/v）菊粉溶液，在450 μL 底物溶液中加入50 μL 稀釋10 倍的酶液，置于50 ℃中水解反應(yīng)，反應(yīng)12 h 后在沸水中加熱，使酶活性喪失，停止反應(yīng)。12,000 rpm 離心10 min后用超濾管超濾去除蛋白，取超濾到管中的液體用于HPLC 分析。在安捷倫液相色譜儀上分析，采用視差折光檢測(cè)器檢測(cè)，以乙腈和水為流動(dòng)相，比例為70:30，流速為1 mL/min，柱溫設(shè)為40 ℃，進(jìn)樣量10 μL[14]。用葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、四糖、五糖配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各組分濃度均為1.0 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子優(yōu)化結(jié)果

從NCBI 下載了inu2 的基因序列，用Jcat 在線軟件優(yōu)化后，原序列中的密碼子都優(yōu)化為最優(yōu)密碼子，同時(shí)優(yōu)化時(shí)避免限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生。原始序列GC 含量為54%，密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）為0.05，優(yōu)化后序列GC 含量降低到52%，CAI 提高到0.73。RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響基因的蛋白表達(dá)水平，用軟件RNAfold Server 預(yù)測(cè)優(yōu)化前后的基因序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)見圖1。從圖可知，優(yōu)化后的序列其結(jié)構(gòu)分支減少了，可以推測(cè)優(yōu)化后序列的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)較原來序列的結(jié)構(gòu)更優(yōu)，表達(dá)水平也可能更高。

2.2 菊粉內(nèi)切酶酶活

將inu2 基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上，測(cè)序保證序列正確，見圖2。經(jīng)BglⅡ線性化轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，抗生素G418 篩選高拷貝克隆。SDS-PAGE 分析表明，菊粉內(nèi)切酶基因表達(dá)的蛋白大小正確（圖3）。用DNS 法對(duì)菊粉內(nèi)切酶的酶活進(jìn)行測(cè)定，酶活力為420 U/mL。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

將酶活的最大值設(shè)定為100%，在不同的溫度下（40、45、50、55、60、65、70 ℃）測(cè)定酶活，作出酶的最適反應(yīng)溫度曲線，如圖4 所示，酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在50～60 ℃范圍內(nèi)該酶活性較高；酶的熱穩(wěn)定性，酶在40 ℃條件下非常穩(wěn)定，溫浴72 h酶仍然可以保持60%以上的活性，而50 ℃下溫浴12 h 后酶就僅剩下60%左右的活性，60 ℃下溫浴12 h 后酶的活性基本喪失；在不同pH（4.0～9.0）條件下測(cè)定酶的活性，將最高酶活設(shè)定為100%，作出酶的最適反應(yīng)pH 曲線，如圖4 所示，該酶的最適反應(yīng)pH 為6.0，在低于pH4.0 或高于9.0 時(shí)則幾乎檢測(cè)不到活性。

圖2 密碼子優(yōu)化后序列測(cè)序圖 Fig.2 Sequencing diagram of codon optimized sequence

圖3 菊粉內(nèi)切酶蛋白的SDS-PAGE 圖譜 Fig.3 SDS-PAGE of endoinulinase protein

圖4 菊粉內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度（a）和最適反應(yīng)pH 值(b) Fig. 4 Optimal reaction temperature of endoinulinase (a) and optimum pH (b)

2.4 酶水解菊粉產(chǎn)物分析

酶水解菊粉產(chǎn)物的HPLC 圖譜如圖5 所示。由于只購(gòu)買到聚合度為3-5 的低聚果糖，因此在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的情況下沒有對(duì)聚合度大于5 的糖進(jìn)行分析。從圖5 可以看出酶水解菊粉的產(chǎn)物主要是聚合度為3-5 的低聚果糖，此外還有少量聚合度大于5的低聚果糖。

圖5 菊粉水解產(chǎn)物HPLC 圖譜 Fig.5 HPLC chromatogram of inulin hydrolysate

3 討論

本研究利用異源基因表達(dá)技術(shù)對(duì)來自曲霉的基因在畢赤酵母中進(jìn)行了分泌表達(dá)，并對(duì)菊粉內(nèi)切酶基因inu2 密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，構(gòu)建了畢赤酵母pPIC9K-inu2/GS115 菌株，其表達(dá)的酶活力為420 U/mL。還對(duì)inu2 基因在釀酒酵母中的表達(dá)進(jìn)行過研究，但蛋白表達(dá)量和酶的活性都比較低，無法應(yīng)用于生產(chǎn)[15]。這說明菊粉內(nèi)切酶基因的表達(dá)受表達(dá)體系的影響較大，在不同體系中表達(dá)水平差異很大。外源基因表達(dá)效率受到密碼子偏好性的影響，不同物種密碼子偏好性不同，無花果曲霉與酵母就存在很大的差異，這種偏好性實(shí)質(zhì)反應(yīng)的是物種間不同轉(zhuǎn)運(yùn)tRNA 含量的差異。如果基因含有稀有密碼子，而相應(yīng)的tRNA 含量不足，就會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)水平低。同時(shí)，mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)影響與核糖體的結(jié)合，密碼子優(yōu)化時(shí)也要考慮二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。綜合考慮基因密碼子偏好性以及mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，我們對(duì)無花果曲霉的菊粉內(nèi)切酶基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明表達(dá)量有了很大的提高。

畢赤酵母的表達(dá)載體pPIC9K 屬于分泌型載體，表達(dá)的蛋白分泌到胞外，有利于酶的分離和純化。該載體成功地表達(dá)了多種外源蛋白質(zhì)，本研究也發(fā)現(xiàn)利用畢赤酵母以及表達(dá)載體pPIC9K 能夠?qū)崿F(xiàn)inu2 基因的高表達(dá)。inu2 基因有自身的分泌型信號(hào)肽序列，長(zhǎng)度為23 個(gè)氨基酸，而表達(dá)載體pPIC9K本來就有α-factor 分泌信號(hào)肽。曾有研究報(bào)道[16]，使用自身信號(hào)肽的菊粉內(nèi)切酶在酶活上低于使用α-factor 分泌信號(hào)肽的菊粉內(nèi)切酶。因此在本研究中通過去除inu2 基因自身23 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列，使用表達(dá)載體的α-factor 分泌信號(hào)肽。

目前知道可以產(chǎn)生菊粉內(nèi)切酶的微生物有很多，包括細(xì)菌、真菌、酵母菌和放線菌等。為了獲得高酶活的菊粉內(nèi)切酶，研究者從上述微生物中都克隆了菊粉內(nèi)切酶基因并放入畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)，獲得了高產(chǎn)的重組菌株。Wang 等人將從Aspergillus niger 9891 獲得的菊粉內(nèi)切酶基因克隆表達(dá)在畢赤酵母GS115 中，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行7 升高密度發(fā)酵，菊粉酶活力達(dá)到291 U/mL，酶活力是原始菌株的273 倍[17]。林勝?gòu)?qiáng)等對(duì)表達(dá)菊粉內(nèi)切酶的畢赤酵母工程菌inu2-26 進(jìn)行高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化，酶活最高可達(dá)570 U/mL[18]。我們構(gòu)建的pPIC9K- inu2/GS115基因工程菌表達(dá)的菊粉內(nèi)切酶酶活力為420 U/mL，并不是最高的。我們目前使用的是搖瓶發(fā)酵，如果下一步上發(fā)酵罐進(jìn)行高密度補(bǔ)料誘導(dǎo)發(fā)酵，酶活還有進(jìn)一步的提高空間，曾有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)酵罐高密度發(fā)酵可以使酶活再提高2～3 倍[18-19]。

低聚果糖主要指蔗果三糖、四糖、五糖，一些研究將聚合度更高的蔗果六糖也稱為低聚果糖。低聚果糖不會(huì)被人體消化道內(nèi)的各種消化酶消化分解，所以可以作用于腸道雙歧桿菌等有益菌，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，改善腸道的微環(huán)境，從而間接促進(jìn)人體的健康。此外，研究發(fā)現(xiàn)低聚果糖可以改善人體脂質(zhì)代謝，能夠用于減肥和糖尿病的防治[20]。利用基因工程菌生產(chǎn)的菊粉內(nèi)切酶酶解菊粉制備低聚果糖，這一方法僅僅需要進(jìn)行一次酶解就可以生成純度比較高的低聚果糖，生產(chǎn)成本比較低，因此該方法在低聚果糖生產(chǎn)上應(yīng)該有比較好的前景。