HPLC同時(shí)測(cè)定止咳丸中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量

王 玉

(淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 淮安 223300)

止咳丸是傳統(tǒng)中成藥品種，創(chuàng)制于清光緒33年，是由麻黃、陳皮、枳殼、紫蘇子、甘草、黃芩(酒炙)等二十幾種中藥材加工制成的復(fù)方純中藥制劑[1]。該制劑收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十一冊(cè)》，具降氣化痰，止咳定喘之功效，可用于風(fēng)寒入肺、肺氣不宣引起的咳嗽痰多，喘促胸悶，周身酸痛或久咳不止，以及老年急慢性支氣管炎，療效卓著[2]。但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有顯微鑒別和理化鑒別，局限性大，難以準(zhǔn)確控制制劑質(zhì)量，因此需要建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的定量分析方法來(lái)控制其內(nèi)在含量。本實(shí)驗(yàn)分析該方方劑組成，選擇柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷作為本品的質(zhì)控指標(biāo)，為該制劑的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)提高提供科學(xué)依據(jù)[3]。

1 儀器、藥品與試劑

1.1 儀 器

UltiMate 3000高效液相色譜儀，DIONEX公司；XP-6電子天平，梅特勒電子有限公司；XS205-DU電子天平，梅特勒電子有限公司；KH72000數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；HWS26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

止咳丸(生產(chǎn)單位：昆明中藥廠有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z53021162；生產(chǎn)批號(hào)：281477、291859、291659)；柚皮苷對(duì)照品(純度91.7%，批號(hào)：110722-201815)、橙皮苷對(duì)照品(純度96.2%，批號(hào)：110721-201818)、新橙皮苷對(duì)照品(純度99.2%，批號(hào)：111857-201703)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品研究院。

甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%冰醋酸溶液(31∶69)；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

分別精密稱取柚皮苷6.335 mg、橙皮苷3.170 mg、新橙皮苷2.911 mg置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照貯備溶液。

2.2.2 供試品溶液

取本品(生產(chǎn)批號(hào)：281477)適量，除去糖衣，研細(xì)，精密稱取1 g，置具塞具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液

制備缺陳皮和枳殼的陰性對(duì)照樣品，精密稱取1 g，按“2.2.2”方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

圖1 對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard sample, Zhike Wan sample and negative sample

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL，照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果顯示，目標(biāo)成分分離效果好，且陰性對(duì)照溶液在目標(biāo)成分相同保留時(shí)間處未檢出色譜峰。表明該方法專屬性強(qiáng)。

2.4 線性范圍考察

精密吸取對(duì)照貯備液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取5 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。柚皮苷的回歸方程：y=5.1331x(r=0.9996)；橙皮苷的回歸方程：y=5.0754x(r=0.9999)；新橙皮苷的回歸方程：y=54.9323x(r=0.9996)。

結(jié)果表明，柚皮苷在11.62～232.36 μg/mL、橙皮苷在6.10～121.98 μg/mL、新橙皮苷在5.78～115.5 μg/mL的范圍內(nèi)與面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，柚皮苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.15%，橙皮苷峰面積的RSD為0.78%，新橙皮苷峰面積的RSD為0.86%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在0、1、2、4、8、12、24、48 h分別進(jìn)樣5 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷峰面積RSD分別為0.76%、0.88%、1.03%，說(shuō)明該供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)(生產(chǎn)批號(hào)：281477)供試品6份1.0007 g、1.0008 g、1.0041 g、1.0039 g、1.0038 g、1.0094 g，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果表明，柚皮苷平均含量為1.95 mg/g，RSD為0.78%；橙皮苷平均含量為3.78 mg/g，RSD為0.46%；新橙皮苷平均含量為1.13 mg/g，RSD為0.83%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批(生產(chǎn)批號(hào)：281477；含量：柚皮苷含量為1.95 mg/g、橙皮苷含量為3.78 mg/g、新橙皮苷含量為1.13 mg/g)供試品6份，每份約0.5 g，分別精密加入一定量的3種成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果(n=6)Table 1 Results of recovery rate tests(n=6)

續(xù)表1

2.9 樣品測(cè)定

取3批次止咳丸，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of content determination of samples

3 討 論

3.1 提取條件的選擇

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)提取溶劑(70%乙醇、甲醇、50%甲醇)、提取方法(超聲30 min、回流30 min)、提取時(shí)間(回流30 min、回流1 h、回流1.5 h)、提取溶劑用量(25 mL、50 mL、100 mL)進(jìn)行了考察[4-6]，結(jié)果表明以50 mL甲醇為溶劑，回流30 min的提取效果最好。

3.2 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.2%冰醋酸作為流動(dòng)相[7]。結(jié)果顯示甲醇-0.2%冰醋酸(31∶69)分離度、對(duì)稱因子最佳；另在實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣量為20 μL或10 μL時(shí)峰形均較差，對(duì)稱因子過(guò)小，不符合要求，故設(shè)定進(jìn)樣量為5 μL。

此外，本研究從柱溫(30 ℃、35 ℃、40 ℃)、流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)和不同品牌色譜柱{Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)}三方面考察了該法的耐用性。結(jié)果顯示：柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰均能實(shí)現(xiàn)良好分離。說(shuō)明該法可靠。

3.3 結(jié) 論

止咳中成藥在中成藥中占有相當(dāng)大的比例，而化學(xué)成分是治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，但止咳丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)任何含量測(cè)定項(xiàng)目，這具有很大的局限性。方中的陳皮、枳殼是常用止咳藥配方，而黃酮類成分為其主要活性成分[8-10]。本研究建立HPLC法，同時(shí)測(cè)定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷三種成分，體現(xiàn)了一法多測(cè)的分析理念，能有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，也為止咳丸標(biāo)準(zhǔn)提高提供基礎(chǔ)支撐。