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    7個(gè)地方山羊品種遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析

    2020-07-10 06:42:14張樂超劉月琴段春輝張英杰王泳郭云霞
    生物技術(shù)通報(bào) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:遺傳變異絨山羊多態(tài)

    張樂超 劉月琴 段春輝 張英杰 王泳 郭云霞

    (1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,保定 071000;2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科技學(xué)院,保定 071000)

    山羊是人類馴化較早的動(dòng)物,為人們提供肉、絨、毛、皮、奶等多種畜產(chǎn)品,在畜牧生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。我國山羊品種資源豐富,有著悠久的馴化和養(yǎng)殖歷史,就河北省及周邊地區(qū)就存在多個(gè)優(yōu)良地方山羊品種,如武安山羊、承德無角山羊、太行山羊、燕山絨山羊、遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和濟(jì)寧青山羊等。這些地方品種,無論是在促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展還是在促進(jìn)我國出口創(chuàng)匯中,均占有重要地位。隨著國外羊品種的大量引進(jìn)及肉用綿羊的大量養(yǎng)殖,這些優(yōu)秀的地方山羊品種的養(yǎng)殖規(guī)模和存欄數(shù)量不斷減少,作為生物多樣性的重要組成部分,亟需加強(qiáng)保護(hù)和利用。

    有許多研究表明,分子標(biāo)記可用于基因多樣性分析。到目前為止,有各種分子標(biāo)記研究遺傳多樣性,例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphi,RFLP)、 隨 機(jī) 擴(kuò) 增 多態(tài) 性 DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Rmplified fragment length polymorphism,AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat,SSR)和單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNP) 等[1-5]。SSR 又 稱為微衛(wèi)星標(biāo)記,由于其共顯性遺傳、高程度的等位基因多樣化、相對(duì)多態(tài)性豐富和廣泛的基因組分布,可以有效地促進(jìn)遺傳關(guān)系的建立,是分析生物遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的常用方法[6]。

    為充分保護(hù)和利用地方山羊遺傳資源的多樣性,本研究選取15對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析河北省及周邊地區(qū)7個(gè)地方山羊群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu),旨在為地方山羊品種的種質(zhì)資源保護(hù)和利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    采集30只燕山絨山羊(青龍利紅絨山羊技術(shù)服務(wù)中心)、23只濟(jì)寧青山羊(灤平虎什哈養(yǎng)殖場(chǎng))、30只承德無角山羊(寬城立東養(yǎng)殖有限公司)、30只太行山羊(阜平縣銀洞山肉羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社)、36只武安山羊(武安市馬家莊太行飼養(yǎng)場(chǎng))、31只遼寧絨山羊(遼寧絨山羊科技示范場(chǎng))的血液樣品,以及33只內(nèi)蒙古絨山羊(阿拉善型)(內(nèi)蒙古億維白絨山羊有限責(zé)任公司)的耳組織,213份樣品均為隨機(jī)取樣,且均為沒有親緣關(guān)系的母羊。利用血液基因組DNA提取試劑盒(DP348)天根生化科技有限公司(北京)提取基因組DNA(圖1)。

    圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

    1.2 方法

    1.2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì) 參照聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)及國際遺傳學(xué)會(huì)(ISAG)的推薦并查閱相關(guān)文獻(xiàn),選用15對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物(表1),引物由通用生物系統(tǒng)有限公司合成(安徽)。

    1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:ddH2O 14.8 μL,dNTP 0.4 μL,Buffer 2 μL,F(xiàn) 0.3 μL(20μmol/L),R 0.3 μL(20 μmol/L),DNA 模 板 2 μL,Taq 0.2 μL,共 20 μL。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,54℃退火35 s,72℃延伸40 s,共35個(gè)循環(huán);最終72℃延伸3 min(圖2)。

    1.2.3 毛細(xì)管電泳 將甲酰胺與分子量?jī)?nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后,取15 μL加入上樣板中,再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物,然后使用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳(圖3)。

    1.2.4 遺傳變異分析 利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析軟件對(duì)測(cè)序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,將各泳道內(nèi)分子量?jī)?nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置做比較分析,得到片段大小。把15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因片段大小進(jìn)行編號(hào),由大到小依次為1-21。利用Popgene32計(jì)算等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Effective numbers of alleles,Ne)、期望雜 合 度(Expected heterozygosity,He)、觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、F統(tǒng)計(jì)量(Fit和Fst)、基因流(Gene flow,Nm)、Shannon指數(shù)(I)等指標(biāo)。利用PIC-Calc軟件計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)。利用Dispan軟件統(tǒng)計(jì)各群體Nei’s遺傳距離,并聚類分析。利用MEGA4.0軟件構(gòu)建群體UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹。

    表1 15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列

    圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖3 毛細(xì)管電泳檢測(cè)部分結(jié)果

    2 結(jié)果

    2.1 7個(gè)地方山羊品種群體內(nèi)遺傳變異分析

    7個(gè)地方山羊品種15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率分析結(jié)果見表2。由表2可知,15個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到了172個(gè)等位基因。其中,BM6526位點(diǎn)的等位基因最多,為21個(gè),片段大小為152-191 bp;INRA063位點(diǎn)的等位基因最少,為6個(gè),片段大小為169-179 bp。在所檢測(cè)到的等位基因中ILSTS005位點(diǎn)181 bp片段基因頻率最高為0.689 6,其次為BM1225位點(diǎn)221 bp片段,基因頻率為0.669;而OarFCB48標(biāo)記的163 bp片段、OarFCB20標(biāo)記的112 bp片段、CSRD247標(biāo)記的248 bp片段、ILSTS087標(biāo)記的164 bp片段、TGLA53標(biāo)記的158 bp片段、BM1225標(biāo)記的252 bp片段和BMS574標(biāo)記的122 bp片段的基因頻率最低,均為0.002 3。

    7個(gè)地方山羊品種15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性分析結(jié)果見表3。由表3可知,所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)范圍為1.928 1(ILSTS005)-10.257(BM6526), 觀 察 雜 合 度(Ho) 范 圍 為 0.436 6(BM1225)- 0.887 3(BMS574),期望雜合度(He)范圍為 0.482 5(ILST005)-0.904 7(BM6526),平均多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.439 9(ILSTS005)-0.894 9(BM6526),均屬于高度多態(tài)。

    7個(gè)地方山羊品種15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳變異分析結(jié)果見表4。由表4可知,7個(gè)地方山羊群體15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)Shannon指數(shù)(I)均大于1,有效等位基因數(shù)在3-5之間,等位基因數(shù)較多,有較高的觀察雜合度和較高的期望雜合度,平均多態(tài)信息含量范圍為0.637 1-0.748 5,為高度多態(tài)。

    2.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳分化

    各微衛(wèi)星位點(diǎn)F-統(tǒng)計(jì)量分析見表5。由表5可知,7個(gè)山羊群體的平均群體間基因分化系數(shù)(Fst)為0.544 2,平均基因流(Nm)為0.209 4,總?cè)后w近交系數(shù)(Fit)為0.088 3。

    表2 7個(gè)地方品種山羊15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率

    2.3 7個(gè)地方山羊品種遺傳距離及聚類分析

    由表6可知,7個(gè)地方山羊品種的相似系數(shù)范圍為0.764 8-0.927 4,遺傳距離范圍為0.075 4-0268 2。武安山羊和承德無角山羊相似系數(shù)最大(0.927 4),遺傳距離最近(0.075 4);太行山羊和燕山絨山羊相似系數(shù)最小(0.764 8),遺傳距離最遠(yuǎn)(0.268 2)。同時(shí),依據(jù)遺傳相似系數(shù)對(duì)7個(gè)地方山羊群體進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖4,7個(gè)山羊群體被聚為2類,濟(jì)寧青山羊、承德無角山羊、武安山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和太行山羊聚為一類,燕山絨山羊和遼寧絨山羊聚為一類。

    表3 7個(gè)地方山羊品種15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)信息指標(biāo)

    表4 7個(gè)山羊群體在15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳變異結(jié)果

    表5 15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)F-統(tǒng)計(jì)量分析表

    表6 7個(gè)地方山羊群體間的Nei’s遺傳距離和相似系數(shù)

    3 討論

    3.1 7個(gè)地方山羊品種群體內(nèi)遺傳變異分析

    等位基因頻率是衡量動(dòng)物群體遺傳結(jié)構(gòu)、估計(jì)遺傳變異的重要指標(biāo)[7],群體中頻率最高、片段最大的等位基因是該物種最保守的基因,而其余等位基因則是在進(jìn)化過程中由該基因突變產(chǎn)生的[8]。王可等[9]利用12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究濟(jì)寧青山羊群體遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)SRCRSP8位點(diǎn)的230 bp和232 bp片段的基因頻率為0.281 3和0.322 9,遠(yuǎn)大于236 bp和240 bp的基因頻率0.010 4,認(rèn)為前兩個(gè)片段可能為原始基因,后兩個(gè)片段可能是突變基因。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了基因頻率相差較大的片段,如ILSTS005位點(diǎn)181 bp片段基因頻率為0.689 6,173 bp片段基因頻率為0.002 4,推測(cè)181 bp片段可能為原始基因,173 bp片段可能為突變基因。有效等位基因數(shù)可反映群體遺傳變異,其數(shù)值越接近等位基因數(shù),等位基因在群體中分布越均勻[10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BM6526位點(diǎn)等位基因數(shù)最多(21個(gè))片段大小為152-191 bp,說明BM6526位點(diǎn)變異程度大,對(duì)研究山羊選育更有價(jià)值。武志娟等[11]利用14個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析5個(gè)黑山羊群體,發(fā)現(xiàn)其中有11個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)差異大,認(rèn)為這種不平衡可能是由于地理隔離和人工選擇導(dǎo)致的。Lin等[12]研究亞洲10個(gè)山羊群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),群體離馴養(yǎng)中心越遠(yuǎn),其遺傳多樣性漸漸下降。王可等[13]研究濟(jì)寧青山羊4個(gè)群體同樣發(fā)現(xiàn)等位基因數(shù)要高于Ne。Hines等[14]認(rèn)為等位基因分布不均可能與近交有關(guān)。本試驗(yàn)中15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)與Ne相差較多,片段大小不同,頻率分布不均勻,說明7個(gè)地方山羊群體有豐富的遺傳多樣性。

    基因雜合度與品種的變異程度具有正相關(guān)關(guān)系,即基因雜合度越大,品種的變異程度越大[15]。若一個(gè)群體的平均雜合度大于0.5,表明該群體的遺傳多樣性豐富[16]。郭丹等[17]利用7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析遼寧絨山羊遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)群體的平均雜合度為0.638,說明遼寧絨山羊品種內(nèi)的遺傳變異處于較高水平,選擇潛力大。趙艷紅[18]分析阿拉善型內(nèi)蒙古絨山羊的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)群體的平均雜合度為0.613 6,同樣說明內(nèi)蒙古絨山羊遺傳多樣性豐富。本研究中,所檢測(cè)的群體內(nèi)平均雜合度比較高,說明群體的遺傳變異較大,適應(yīng)環(huán)境的能力較強(qiáng)。并且,不同微衛(wèi)星在同一山羊群體,同一微衛(wèi)星在不同山羊群體中變異程度也有很大差別。BM6526位點(diǎn)的He最高為0.904 7,ILSTS005位點(diǎn)相對(duì)其它微衛(wèi)星位點(diǎn)較低為0.482 5;燕山絨山羊最低為0.647 9,內(nèi)蒙古絨山羊的He最高為0.760 2。7個(gè)群體中僅太行山羊Ho > He,其他6個(gè)群體均是Ho < He,說明除太行山羊外,其他6個(gè)群體均存在不同程度的近交,承德無角山羊近交程度高于其他群體。王可等[9]研究濟(jì)寧青山羊遺傳多樣性發(fā)現(xiàn),各標(biāo)記的觀測(cè)雜合度在0.428 6-0.904 8之間,期望雜合度在

    0.598 1-0.839 7之間,平均期望雜合度為0.757 4,屬于高度雜合,遺傳變異大。I是研究物種多樣性的指標(biāo)之一,與群體的遺傳變異程度有正相關(guān)關(guān)系,即I值越大,群體的遺傳變異程度越高[19]。本試驗(yàn)中,7個(gè)地方山羊群體I值均大于1,表明試驗(yàn)群體遺傳變異程度較高,受近交的影響較小。多態(tài)信息含量(PIC)反映了微衛(wèi)星標(biāo)記的變異程度和估計(jì)群體內(nèi)的遺傳變異程度,PIC < 0.25時(shí)為低度多態(tài),0.25 0.5時(shí)為高度多態(tài)[20],PIC > 0.7時(shí)認(rèn)為是最優(yōu)的遺傳標(biāo)記[21]。本試驗(yàn)的15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)僅有ILSTS005為中度多態(tài),其余均為高度多態(tài),有11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)大于0.7,說明試驗(yàn)地方山羊群體具有豐富的遺傳基礎(chǔ),有很大的保種潛力。

    圖4 7個(gè)地方山羊群體聚類系統(tǒng)發(fā)育樹

    3.2 7個(gè)地方山羊品種的遺傳距離及聚類分析

    Fst反映了群體間的遺傳分化程度,F(xiàn)st在0-0.05時(shí),各群體間遺傳分化很小,在0.05-0.15時(shí),為中等程度的遺傳分化,在0.15-0.25時(shí),為高度遺傳分化;Nm數(shù)值小于1時(shí),群體可能向遺傳分化的方向發(fā)展,Nm數(shù)值大于1時(shí),群體能有效地抑制由遺傳漂變引起的遺傳分化[22]。Radhika等[23]利用 10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析印度本地山羊和雜交山羊品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),二者均具有高的遺傳多樣性,并且Fst值為0.02,說明群體間遺傳分化很小。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在7個(gè)山羊群體的Fst值均在0.484以上,說明群體間的遺傳分化程度很大。Nm值均在0.162 7以上,說明7個(gè)群體間的基因交流較少。Fit反應(yīng)了總?cè)后w的近交程度,表示整個(gè)群體中攜帶的一對(duì)等位基因是同源的概率[24]。本試驗(yàn)Fit值為0.088 3,表明群體間存在8.83%的遺傳變異來自遠(yuǎn)交,占的比例相對(duì)較小。

    遺傳距離表示不同種群或品種間的基因差異程度,通常利用等位基因頻率計(jì)算[25],是研究物種遺傳多樣性的基礎(chǔ),可反映群體的系統(tǒng)進(jìn)化,群體分化時(shí)間越短,遺傳距離就越小[26]。趙艷紅等[27]分析中國6個(gè)山羊群體遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)遼寧絨山羊和內(nèi)蒙古絨山羊(阿拉善型)遺傳距離為0.134,與本試驗(yàn)的結(jié)果(0.1589)相似。楊清芳[28]利用15個(gè)微衛(wèi)星研究5個(gè)山羊品種遺傳多樣性發(fā)現(xiàn),遼寧絨山羊與承德無角山羊的遺傳距離為0.2270,與本試驗(yàn)研究結(jié)果(0.2341)相似。劉恩民[29]利用SNP芯片分析中國地方山羊品種的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古絨山羊和太行山羊聚在一大類,與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。Alatiyat等[30]利用17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)UPGMA聚類分析3種沙特山羊發(fā)現(xiàn),Jabli、Bishi和Tohami聚為一大類。本研究結(jié)果顯示,燕山絨山羊與遼寧絨山羊聚為一類,說明這兩個(gè)群體遺傳距離較近,燕山絨山羊與太行山羊遺傳距離為0.268 2,相對(duì)于其他群體最遠(yuǎn)。

    4 結(jié)論

    燕山絨山羊、遼寧絨山羊、承德無角山羊、濟(jì)寧青山羊、太行山羊、武安山羊和內(nèi)蒙古絨山羊7個(gè)地方山羊群體遺傳多樣性豐富,群體間遺傳分化程度大,基因交流少,受近交程度影響小,具有較高的利用價(jià)值和潛力。

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