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    N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的固定化及固定化酶性質(zhì)研究

    2020-07-10 06:42:12王惠蘭吳金勇陳祥松袁麗霞朱薇薇姚建銘
    生物技術(shù)通報(bào) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:乙酰緩沖液游離

    王惠蘭 吳金勇 陳祥松 袁麗霞 朱薇薇 姚建銘

    (1. 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院等離子體物理研究所,合肥 230031;2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué),合肥 230026;3. 淮南新能源研究中心,淮南 232001)

    N-乙 酰 神 經(jīng) 氨 酸(N-acetylneuraminicacid,Neu5Ac)是一種具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖,是細(xì)胞膜蛋白的重要組成部分,參與細(xì)胞表面多種生理功能[1]。如提高嬰幼兒智力和記憶力[2]、抗老年癡呆[3]、用作治療病毒感染的藥物[4]、檢測(cè)惡性腫瘤的診斷試劑[5]。鑒于此,研究Neu5Ac的工業(yè)化生產(chǎn)方法顯得十分重要。

    Neu5Ac的生產(chǎn)方法主要包括天然抽提法[6]、化學(xué)合成法[7]、微生物發(fā)酵法[8-10]和生物酶法[11-14]等。天然抽提法產(chǎn)率低;化學(xué)合成法反應(yīng)條件苛刻,污染環(huán)境;微生物發(fā)酵法周期長(zhǎng),不易分離純化;生物酶法反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物較少,屬于環(huán)境友好型方法。而目前Neu5Ac的酶法制備主要是以N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine,GlcNAc)和丙酮酸(Pyruvic acid,Pyr)為底物,先利用N-乙酰葡萄糖胺差向異構(gòu)酶(N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase,AGE) 將 GlcNAc異 構(gòu) 成 N-乙 酰 甘露糖胺(N-acetyl-D-manosamine,ManNAc),再通過N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(N-acetylneuraminic acid aldolase,NAL)催化ManNAc和Pyr生成Neu5Ac。

    由上可知,NAL是酶法制備Neu5Ac途徑中的關(guān)鍵酶。相比較于游離酶,固定化酶可以較大程度上彌補(bǔ)穩(wěn)定性差、產(chǎn)物抽提困難和不可重復(fù)利用等缺點(diǎn)[15-18],更符合工業(yè)規(guī)?;a(chǎn)的要求。酶的固定化方法主要包括物理吸附法、包埋法、直接交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法。其中共價(jià)結(jié)合法主要是通過形成共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合在一起,優(yōu)勢(shì)主要在于操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)、易回收。氨基樹脂是一種高度多孔的固定化載體,經(jīng)戊二醛活化后,具有高比面積,載酶量大,酶活高,機(jī)械強(qiáng)度高,使用周期數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)[19-23]。戊二醛作為雙官能團(tuán)交聯(lián)劑在酶的固定化技術(shù)中心有著廣泛的應(yīng)用,它可以將酶和載體與官能團(tuán)共價(jià)連接[16-18]。

    雖然已有文獻(xiàn)對(duì)于NAL的固定化進(jìn)行了報(bào)道,但選用的是Eupergit? C等[24-25]國(guó)外進(jìn)口或?qū)嶒?yàn)自制,并不能滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的需求。本研究通過對(duì)市面上常見的環(huán)氧樹脂和氨基樹脂進(jìn)行篩選,選擇了國(guó)產(chǎn)商業(yè)化氨基樹脂載體LX-1000HFA對(duì)NAL進(jìn)行固定化工藝研究,優(yōu)化了固定化過程中的反應(yīng)條件,確定了最佳固定化條件,極大地提高了酶的穩(wěn)定性,還對(duì)游離酶與固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較,以期對(duì)工業(yè)化大批量生產(chǎn)Neu5Ac提供數(shù)據(jù)參考和理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 本研究所用菌株為大腸桿菌BL21(DE3)工程菌,由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏,基因來源于大腸桿菌W3110菌株,并克隆到pET24a載體上。

    1.1.2 儀器與試劑 儀器:ZWY-211B恒溫?fù)u床,上海智誠(chéng);5 L發(fā)酵罐:上海保興;FE28 pH計(jì),瑞士梅特勒;JY96超聲破碎儀,寧波新芝;3H16R1高速冷凍離心機(jī),湖南赫西;LC-15c液相色譜儀,日本島津;MB-580 多功能酶標(biāo)分析儀,深圳匯松。

    試劑:ES-1、ES-103B、ES-108、ESR-1,天津南開和成;LX-1000EA、LX-1000EP、LX-1000HA、LX-1000HFA、LX-1000EP,西安藍(lán)曉;N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰葡萄糖胺,分析標(biāo)準(zhǔn)品;蛋白胨,BR級(jí),英國(guó)OXOID;酵母浸粉,BR級(jí),英國(guó)OXOID;瓊脂粉、硫酸卡那霉素,BR級(jí),上海國(guó)藥;Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒,北京索萊寶;其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基(g/L):酵母浸粉5,蛋白胨10,氯化鈉10,必要時(shí)加入瓊脂粉20制備LB固體培養(yǎng)基。高壓蒸汽滅菌121℃,30 min。待冷卻至50-60℃,使用前加入卡那霉素使得終濃度為 30 μg/mL。

    TB液體培養(yǎng)基(g/L):酵母浸粉24,蛋白胨12,磷酸二氫鉀2.31,三水磷酸氫二鉀16.43,甘油5.04,高壓蒸汽滅菌121℃,30 min。待冷卻至50-60℃,使用前加入卡那霉素使得終濃度為30 μg/mL。

    5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12,酵母浸粉8,磷酸氫二鉀4,氯化鈉3,硫酸銨2.5,甘油10,硫酸亞鐵0.3,檸檬酸2.3,硫酸鎂0.49。高壓蒸汽滅菌121℃,30 min。其中硫酸鎂單獨(dú)滅菌。硫酸亞鐵和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)均于超凈臺(tái)中用無菌注射器和0.22 μm過濾。發(fā)酵過程中加入IPTG,至終濃度為0.1 mmol/L。

    補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨22.5,酵母浸粉75,甘油300。高壓蒸汽滅菌121℃,30 min。

    1.2 方法

    1.2.1 酶活的測(cè)定酶活定義:以37℃,pH7.5條件下,1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol N-乙酰神經(jīng)氨酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

    酶活測(cè)定:采用高效液相色譜法分別測(cè)定游離酶和固定化酶的酶活[19]。HPLC條件:色譜柱:Aminex HPX-87H;柱溫:60℃;流動(dòng)相:5 mmol/L H2SO4;流動(dòng)相流速:0.60 mL/min;紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為210 nm;進(jìn)樣量10 μL。相對(duì)酶活:在同一批實(shí)驗(yàn)組中,以測(cè)得最高酶活的實(shí)驗(yàn)組數(shù)值為100%,其余實(shí)驗(yàn)組與之的比值(%)為相對(duì)酶活。

    式(1)中,T為用于固定化的粗酶液的總酶活,A1為固定化酶的總酶活,A2為抽濾上清的總酶活。

    1.2.2 粗酶液的制備 將保藏菌種畫線接種至固體LB平板上活化,37℃培養(yǎng)過夜。然后從平板上挑取一環(huán)菌種,將其接種至LB液體種子培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)20 h,即為一級(jí)種子液;按1%接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)5 h。

    發(fā)酵產(chǎn)酶:全自動(dòng)5L發(fā)酵罐裝液量3L,接種量為5%,起始溫度37℃,補(bǔ)料后降至25℃,起始通氣量1 vvm,進(jìn)氣壓力調(diào)整為0.06 MPa,設(shè)置起始轉(zhuǎn)速為200 r/min,保持溶氧不低于30%,并待pH和溶氧回升時(shí)開始勻速補(bǔ)料,補(bǔ)料速度為4.2 g/L*h。發(fā)酵過程通過25%(M/V)氨水控制pH為7.0,發(fā)酵時(shí)間約為24 h。

    發(fā)酵液于4℃,6 000 r/min離心15min,棄去上清得到濕菌體。稱取濕菌體重懸于100 mmo/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)使得菌體終濃度為100 g/L,超聲波破碎(冰水浴,功率400 W,工作時(shí)間3 s,間歇時(shí)間5 s)15 min,4℃下11 000 r/min離心11 min,上清液即為粗酶液。

    1.2.3 蛋白濃度的測(cè)定 Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。

    1.2.4 樹脂預(yù)處理環(huán)氧樹脂 稱取5 g環(huán)氧樹脂,加入20 mL的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)混勻,25℃,170 r/min振蕩1 h,蒸餾水洗滌干凈。

    氨基樹脂:0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)配制5%戊二醛溶液。稱取5 g氨基樹脂,加入20 mL配制好的5%戊二醛溶液,在25℃,170 r/min活化1 h,20 mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)洗凈至無戊二醛殘留。

    1.2.5 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶固定化方法 稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂載體4 g置于250 mL三角瓶中,加入20 mL 1.0 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)和20 mL NAL粗酶液放置于25℃恒溫?fù)u床中震蕩固定化24 h。真空抽濾,用20 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)洗滌固定化酶顆粒5次,抽干后于4℃保存。

    1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)比較 控制pH相同,在不同的溫度條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的酶活力,并且在不同溫度中處理12 h之后在最適反應(yīng)條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的剩余酶活,考察固定化酶與游離酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性。

    控制溫度相同,在不同的pH條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的酶活力,并且在不同pH中處理12h之后在最適反應(yīng)條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的剩余酶活,考察固定化酶與游離酶的最適pH和pH穩(wěn)定性。

    將游離酶和固定化酶顆粒密封儲(chǔ)存于4℃冰箱中,每間隔一段時(shí)間取出測(cè)殘余酶活,考察固定化酶與游離酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

    1.2.7 固定化 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸在50 mL轉(zhuǎn)化體系中,加入0.4 mol/L的N-乙酰葡萄糖胺,1.0 mol/L的丙酮酸鈉,2.5mmol/L的ATP和7.5 mmol/L的氯化鎂。轉(zhuǎn)化10 h和15 h均補(bǔ)料添加2.75 g丙酮酸鈉。在37℃,pH 7.5,轉(zhuǎn)速170 r/min的條件下,加入400 U的NAL固定化酶顆粒,再加入100 U的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶游離酶,反應(yīng)24 h完成后,用20 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)沖洗抽濾,連續(xù)反應(yīng)10次。

    2 結(jié)果

    2.1 粗酶液蛋白濃度測(cè)定

    粗酶液蛋白濃度為20 mg/mL,比酶活為25 U/mg。

    2.2 樹脂載體的選擇

    分別稱取4 g不同的樹脂載體,進(jìn)行固定化,檢測(cè)不同載體的固定化酶酶活,結(jié)果如表1。由于攜帶官能團(tuán)的不同,不同類型的樹脂對(duì)酶的固定化效果也不同。從表1的結(jié)果可以看出,在9種不同類型的樹脂中,氨基類樹脂LX-1000HFA的固定化效果最好,酶活回收率達(dá)到39.75%。因此,選用LX-1000HFA作為最佳固定化載體進(jìn)行下一步研究。

    表1 不同樹脂載體的固定化效果

    2.3 樹脂投放量對(duì)固定化的影響

    向250 mL的三角瓶中準(zhǔn)確稱取LX-1000HFA載體1 g、2 g、3 g、4 g、5 g、6 g,檢測(cè)不同載量的固定化酶酶活及酶活回收率,結(jié)果如圖1。由圖1中的數(shù)據(jù)可知,固定化酶的相對(duì)酶活隨著載體量的不斷增加在不斷減少,而酶活回收率隨著載體量的不斷增加而增加。載體量為5 g時(shí)酶活回收率達(dá)到45.00%,載體表面的醛基結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)與酶分子結(jié)合達(dá)到了飽和。因此,綜合來看在40 mL的粗酶液中投放5 g載體是最佳的比例。

    圖1 樹脂投放量對(duì)固定化的影響

    2.4 固定化時(shí)間對(duì)固定化的影響

    往250 mL的三角瓶中準(zhǔn)確稱取篩選的載體5 g,固定不同時(shí)間。檢測(cè)不同固定化時(shí)間的固定化酶酶活,結(jié)果如圖2。由圖2可以看出,固定化酶酶活隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降最后逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)。在2-6 h固定化酶酶活是逐漸升高的,在6 h時(shí)酶活最高,這一階段載體與酶蛋白主要是進(jìn)行簡(jiǎn)單的物理吸附作用,并沒有形成牢固的共價(jià)鍵。固定化時(shí)間在6 h后酶活則逐漸下降,下降到12 h時(shí)固定化酶酶活逐漸穩(wěn)定。因此,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇12 h作為固定化時(shí)間。

    圖2 固定化時(shí)間對(duì)固定化的影響

    圖3 緩沖液濃度對(duì)固定化的影響

    2.5 緩沖液濃度對(duì)固定化的影響

    向250 mL的三角瓶中分別加入20 mL的0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L的pH 8.0不同濃度的磷酸鉀緩沖液,并準(zhǔn)確稱取篩選的載體5 g,固定化12 h。檢測(cè)不同緩沖液濃度處理的固定化反應(yīng)下固定化酶酶活,結(jié)果如圖3??梢钥闯?,隨著緩沖液濃度的不斷增大,固定化酶酶活先增加后降低。當(dāng)緩沖液濃度為1.0 mol/L時(shí)固定化酶酶活最大,而后不斷減少。所以本研究選擇1.0 mol/L為最佳緩沖液濃度。

    2.6 緩沖液pH對(duì)固定化的影響

    向250 mL三角瓶中分別加入1.0mol/L的pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸鉀緩沖液,并準(zhǔn)確稱取篩選的載體5g,固定化12 h。檢測(cè)不同pH的固定化反應(yīng)下固定化酶酶活,結(jié)果如圖4。偏堿性環(huán)境更適合NAL的固定化,當(dāng)pH為5.5至7.5時(shí),固定化酶酶活一直隨著pH值的增大而升高。當(dāng)pH為7.5時(shí),固定化酶活是最高的,所以本研究選擇pH7.5作為固定化的最適pH。

    圖4 pH對(duì)固定化的影響

    2.7 溫度對(duì)固定化的影響

    向250 mL的三角瓶中準(zhǔn)確稱取篩選的載體5 g,加入20 mL的1.0 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0),放置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的恒溫?fù)u床,固定化12 h。檢測(cè)不同溫度的固定化反應(yīng)下固定化酶酶活,結(jié)果如圖5。

    由圖5可知,在25℃時(shí)固定化酶活最高,當(dāng)溫度從20℃升高至25℃,固定化酶活是增大的。當(dāng)溫度大于25℃后,固定化酶活則處于一直下降的趨勢(shì)。所以,NAL不適合在高溫下進(jìn)行固定化,本研究選取25℃做固定化的最適溫度。

    圖5 溫度對(duì)固定化的影響

    2.8 酶學(xué)性質(zhì)的比較

    2.8.1 最適反應(yīng)溫度 由圖6可知,游離酶的最適反應(yīng)溫度是35℃,固定化酶的最適反應(yīng)溫度是40℃,NAL被固定化后最適反應(yīng)溫度有所上升。當(dāng)溫度高于40℃,固定化酶和游離酶的酶活都隨著溫度的升高而下降,但固定化酶的下降趨勢(shì)相對(duì)游離酶較平緩。溫度達(dá)55℃時(shí),游離酶僅剩60%的酶活,而固定化酶仍保持有80%的酶活。這可能是由于游離酶在被固定化后載體分子對(duì)酶分子有一定的保護(hù)作用,從而使得固定化酶的適用溫度范圍較游離酶更廣。

    圖6 固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度

    2.8.2 溫度穩(wěn)定性 由圖7可知,游離酶在35℃時(shí)處理12 h保持有85%左右的酶活,但在70℃中處理12 h只殘余30%的酶活。相比而言,在不同溫度條件下處理12 h,固定化酶的殘余酶活下降速度較低,特別地在35℃時(shí)處理12 h酶活基本無損失,在70℃高溫條件下固定化酶酶活仍保持有71%的酶活。所以,固定化酶的熱穩(wěn)定性顯著優(yōu)于游離酶。

    2.8.3 最適反應(yīng)pH 由圖8可以看出,游離酶與固定化酶的最適反應(yīng)pH均是7.5,說明酶在被固定化后最適反應(yīng)pH并不受影響。當(dāng)pH小于7.5時(shí),游離酶和固定化酶的相對(duì)酶活都是隨著pH的增大而增大,但游離酶的變化趨勢(shì)較為劇烈。特別在強(qiáng)酸性(pH5.5)條件下游離酶的相對(duì)酶活只有44%左右,而固定化酶還保有70%的酶活。游離酶的構(gòu)象在酸性條件下比固定化酶更容易改變,從而失去活性。因此,固定化酶比游離酶更適應(yīng)強(qiáng)酸性環(huán)境,具有更廣的pH應(yīng)用范圍。

    圖7 固定化酶和游離酶的溫度穩(wěn)定性

    圖8 固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)pH

    2.8.4 pH穩(wěn)定性 由圖9可以看出,無論是游離酶還是固定化酶,NAL在強(qiáng)堿性(pH9.0)環(huán)境中酶活相對(duì)于強(qiáng)酸性(pH5.0)穩(wěn)定性更好,這可能與酶本身的性質(zhì)有關(guān)。游離酶經(jīng)固定化后pH穩(wěn)定性有非常大的提升,特別是在酸性環(huán)境中。在pH為5.0的條件下處理12 h,游離酶只剩余10%左右的酶活,而固定化酶還保持在70%的酶活。在pH為7.5的條件下處理12 h固定化酶的酶活基本無損失,而在pH為9.0的堿性環(huán)境中處理12 h,固定化酶的酶活仍然保留有78%??傮w來說,固定化酶的pH穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。

    2.8.5 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 從圖10中可以看出,在4℃條件下儲(chǔ)存2 d后,游離酶只保留有57%的酶活,已經(jīng)接近半衰期了,而固定化酶依然保持在96%的酶活水平。在儲(chǔ)存10 d后,游離酶幾乎喪失全部活性,固定化酶只損失了6%的酶活。固定化NAL酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性較好,且易于儲(chǔ)存。

    圖9 固定化酶和游離酶的pH穩(wěn)定性

    圖10 固定化酶和游離酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

    2.8.6 操作穩(wěn)定性 操作穩(wěn)定性是衡量固定化酶效果的一個(gè)重要指標(biāo)之一,它決定著固定化酶在工業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值。從圖11中可以看出,轉(zhuǎn)化1次后產(chǎn)生99.3 g/L Neu5Ac,GlcNAc的轉(zhuǎn)化率為80.03%,生產(chǎn)強(qiáng)度為4.14 g/L/h。在連續(xù)轉(zhuǎn)化第3次時(shí),摩爾轉(zhuǎn)化率為75.18%左右,說明酶的穩(wěn)定性有略微下降的趨勢(shì)。持續(xù)轉(zhuǎn)化10個(gè)批次,最終摩爾轉(zhuǎn)化率能達(dá)到64.67%。故連續(xù)轉(zhuǎn)化10次,酶活能夠保持80%。

    固定化酶初次和連續(xù)10次催化合成Neu5Ac的HPLC色譜對(duì)比圖如圖12所示,峰2、3、4、5分別為Neu5Ac、丙酮酸、ManNAc、GlcNAc,其對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間分別為8.6、9.7、11.6、12.2 min。固定化酶在持續(xù)催化第10次后,其摩爾轉(zhuǎn)化率為64.67%,Neu5Ac產(chǎn)量仍達(dá)到80.0 g/L。

    3 討論

    目前Neu5Ac的酶法制備主要是通過AGE與NAL偶聯(lián)催化實(shí)現(xiàn)的,通常先利用AGE將GlcNAc異構(gòu)成ManNAc,再通過NAL催化ManNAc和Pyr生成Neu5Ac。近些年來,由于固定化酶的可循環(huán)利用性,一些研究者開始將目光投向利用固定化酶生產(chǎn)Neu5Ac。作為酶法生產(chǎn)Neu5Ac的關(guān)鍵酶NAL,其固定化研究早有報(bào)道。2006年楊茂區(qū)等[24]使用Eupergit? C進(jìn)口環(huán)氧樹脂固定化NAL粗酶液,其比酶活僅10.4 U/g。為了提高固定化酶活,2009年胡世元等[25]利用Amberzyme進(jìn)口環(huán)氧樹脂對(duì)NAL純酶進(jìn)行固定化研究,結(jié)果獲得比酶活達(dá)到了69.3 U/g,比之前固定化酶活有較大提高,但酶的純化成本較高,且使用國(guó)外進(jìn)口的樹脂不宜國(guó)內(nèi)進(jìn)行規(guī)?;a(chǎn)。2016年Cheng等[19]使用實(shí)驗(yàn)室自制的氨基樹脂對(duì)純化后的NAL進(jìn)行固定化,最終得到固定化比酶活達(dá)183 U/g,但其固定化酶在連續(xù)轉(zhuǎn)化5次后酶活僅初始酶活的75%。

    圖11 固定化酶的操作穩(wěn)定性

    圖12 固定化酶催化合成Neu5Ac的HPLC色譜圖

    本研究使用不同樹脂對(duì)NAL粗酶液進(jìn)行固定化后發(fā)現(xiàn),采用LX-1000HFA進(jìn)行固定化時(shí)效果最好,可以制備較高酶活的固定化酶。而在固定化過程中,固定化時(shí)間、緩沖液濃度、pH及溫度等因素直接影響了固定化效果。由于LX-1000HFA是一類氨基載體,在2-6 h內(nèi),酶蛋白僅簡(jiǎn)單地被吸附于載體表面。而隨著固定化時(shí)間延長(zhǎng)至12 h,固定化酶活穩(wěn)定在91%左右時(shí),這可能是因?yàn)樯倭棵傅鞍字饾u脫落,大量的酶分子與載體之間形成共價(jià)結(jié)合且達(dá)到飽和狀態(tài)[26-27];適當(dāng)濃度的緩沖液也可能促進(jìn)載體與酶分子的表面疏水作用,促使酶分子被吸附于載體的樹脂表面。當(dāng)緩沖液濃度為1.0 mol/L時(shí)固定化酶活最高,緩沖液濃度為2.0 mol/L時(shí)固定化酶活僅40%左右。這可能是磷酸鹽濃度過高造成酶蛋白變性失活,且易形成較大顆粒,堵塞載體孔徑通道,影響游離酶分子與載體的結(jié)合[28];當(dāng)體系pH為5.5時(shí),固定化酶活僅為pH為7.5的41%左右,可能是pH影響了戊二醛的醛基與載體的氨基基團(tuán)反應(yīng)生成的席夫堿的穩(wěn)定性[29];另外,固定化溫度直接影響了游離酶分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng),且低溫時(shí)酶分子熱運(yùn)動(dòng)效率較低,適當(dāng)提高溫度直接影響載體與酶分子的結(jié)合效率[30],但高溫首先會(huì)直接破壞酶分子的蛋白結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶蛋白變性失活。其次氨基載體固定化酶是共價(jià)結(jié)合的方式,高溫會(huì)破壞共價(jià)鍵的形成。所以固定化溫度為25℃時(shí)固定化效果最好,而溫度上升到45℃時(shí),固定化酶活下降至最高酶活的50%左右。游離酶經(jīng)固定化后,其最佳作用溫度提升5℃,溫度穩(wěn)定性(70℃處理12 h)提高了近2.4倍。最適pH范圍變廣,pH穩(wěn)定性(pH 5.0處理12 h)則提高近7.1倍。值得注意的是,當(dāng)在4℃條件下儲(chǔ)存10 d時(shí),固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性顯著提高(11.4倍)。

    4 結(jié)論

    從9種不同類型的載體中,篩選出氨基樹脂LX-1000HFA對(duì)NAL進(jìn)行固定化,經(jīng)優(yōu)化得到最佳固定化條件為:載體投放量5.0 g,固定化時(shí)間12 h,緩沖液濃度1.0 mol/L,pH 7.5,溫度25℃。在此條件下制備得到的固定化NAL,無需純化,酶活達(dá)200 U/g濕載體。通過對(duì)游離酶與固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性進(jìn)行了對(duì)比研究,結(jié)果相對(duì)于游離酶,固定化酶具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性,可適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的復(fù)雜的操作環(huán)境。

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