釀酒酵母對酚類抑制物耐受性研究

顧翰琦 劉冉 邵玲智 徐巖巖 王東巖 張冬梅 李潔

（河北民族師范學(xué)院生物與食品科學(xué)系，承德 067000）

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)預(yù)處理產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物已經(jīng)成為限制生物煉制產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問題之一。木質(zhì)素衍生的酚類化合物廣泛出現(xiàn)在不同預(yù)處理方式所得的水解物中，并表現(xiàn)出種類復(fù)雜、毒性強和難去除的特性［1-3］。這類抑制物可以分為：酚醛、酚酸和酚醇（酮），其對微生物的毒性依次減弱。雖然酚酸毒性弱于酚醛，但是預(yù)處理水解物中酚酸化合物的種類和含量均高于酚醛和酚醇，且化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定。因此有必要深入分析這類抑制物對典型的纖維素乙醇發(fā)酵微生物釀酒酵母生理特性的影響，并提出具有針對性的應(yīng)對策略。

目前，關(guān)于木質(zhì)素衍生酚類化合物對釀酒酵母抑制作用機制尚不明確，且缺乏有效應(yīng)對措施。以往研究主要集中在酚醛和酚酸的抑制作用強弱比較［4-7］，而缺乏關(guān)于作用機制方面的深入研究。已有研究報道酚酸對細菌類乳酸菌和運動發(fā)酵單胞菌的細胞膜滲透性有影響，導(dǎo)致細胞活性下降［8］。但是缺乏有效的應(yīng)對措施，酚酸物質(zhì)的水中溶解度低，通過常規(guī)水洗脫毒不能有效脫除，反而使其在木質(zhì)纖維素原料上富集［9］。另外，缺乏發(fā)酵微生物對酚酸耐受性相關(guān)的分子生物學(xué)背景信息，并不能夠通過理性的基因工程改造構(gòu)建耐受性菌株。

對微生物進行馴化是一種應(yīng)對惡劣發(fā)酵環(huán)境的有效方法［10］。這種方法具有實際應(yīng)用價值，在培養(yǎng)發(fā)酵種子液的過程中同時進行馴化能夠縮減操作步驟，降低木質(zhì)纖維素原料脫毒成本［11-12］。在惡劣環(huán)境正式發(fā)酵前，先將菌株置于低水平的壓力脅迫下進行短期培養(yǎng)，使其產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而在發(fā)酵初期能夠快速適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。本研究擬通過短期馴化方式提高釀酒酵母對酚酸抑制物的耐受性，并初步探究酚酸耐受機制。以木質(zhì)素3種結(jié)構(gòu)單元對應(yīng)的香草酸、丁香酸和對羥基苯甲酸為酚酸模式化合物，分別考察酚酸對釀酒酵母生長發(fā)酵的影響，比較不同策略馴化的菌株在酚酸環(huán)境中的生長發(fā)酵動力學(xué)指標，并從細胞膜完整性角度分析其酚酸耐受性原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），購自安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑 香草酸、對羥基苯甲酸、丁香酸為分析純，購自上海阿拉丁試劑公司；其余化學(xué)試劑均為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑公司；酵母浸粉為生物試劑，購自西寶生物科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和抑制劑 合成培養(yǎng)基（SM，g/L）：葡萄糖20、磷酸二氫鉀2、七水合硫酸鎂1、硫酸銨1和酵母浸粉10。單一酚酸抑制物母液（g/L）：香草酸母液60、對羥基苯甲酸母液100和丁香酸母液40?；旌戏铀嵋种莆锬敢海╣/L）：香草酸40、對羥基苯甲酸24和丁香酸20。3種酚酸的比例根據(jù)不同禾本植物木質(zhì)纖維素經(jīng)過不同類型預(yù)處理方式產(chǎn)生的水解物中愈創(chuàng)木基、對羥基苯基和紫丁香基類酚酸含量進行設(shè)定［2-3，13］。上述酚酸抑制物母液中，二甲基亞砜（DMSO）作為助溶劑。母液按比例添加到SM中獲得設(shè)定的酚酸濃度，培養(yǎng)基中DMSO含量低于0.7%（V/V）。

1.2 方法

1.2.1 酚酸抑制物對釀酒酵母的影響 酵母菌株以10%接種量在SM中活化18 h（30℃、150 r/min），當(dāng)菌體密度在600 nm處吸光值（OD600）達到7-8，以10%接種量分別轉(zhuǎn)接到不同濃度的香草酸、對羥基苯甲酸和丁香酸和混合酚酸培養(yǎng)基中，30oC，150r/min培養(yǎng)24 h。在設(shè)定時間取樣，10 000 r/min離心5 min，上清液用于液相色譜檢測，菌體沉淀用于測定生長曲線。

1.2.2 酚酸短期馴化策略對釀酒酵母耐受性的影響 策略A：活化的原始菌株以10%的接種量依次在抑制濃度（IC25，IC50和IC75）逐漸升高的混合酚酸培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)，每次在30oC，150 r/min培養(yǎng)12 h后以10%接種量轉(zhuǎn)接到下一個抑制濃度培養(yǎng)基中，最終獲得耐受性菌株。策略B：菌株在抑制濃度IC50保持不變的混合酚酸培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)4次。策略C：菌株依次在抑制濃度IC25，IC75，IC50和IC75脈沖變化的混合酚酸培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)。對照組：將活化后的酵母菌株以10%的接種量接種在不含抑制物的SM中轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4次，其他培養(yǎng)條件同策略A。IC25、IC50、IC75和IC100分別代表能夠?qū)е略季晟L抑制率為25%、50%、75%和100%時對應(yīng)的混合酚酸濃度（表1）。其中生長抑制率是根據(jù)酵母菌株在不同酚酸濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h內(nèi)的最大比生長速率計算所得。將上述菌株以10%的接種量分別轉(zhuǎn)接到能夠?qū)е陆湍干L抑制率為75%的混合酚酸抑制濃度下30oC，150 r/min培養(yǎng)24 h，比較菌株在酚酸脅迫下的生長和發(fā)酵性能。

1.2.3 分析方法 通過UV-VIS分光光度計（UV-752N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）測定菌液在OD600吸光值分析菌體生長。發(fā)酵液中葡萄糖和乙醇濃度通過液相色譜（LC-20，日本島津公司）檢測：檢測器為RID-20A，色譜柱為Aminex-HPX-87H（300 mm×7.8 mm），柱溫箱溫度為65℃，流動相為0.005 mol/L稀硫酸，流速為0.60 mL/min，進樣量為20 μL［14］。流式細胞儀檢測（FACSCaliburTM，美國 BD Biosciences公司）［15］：酵母菌株在IC75的混合酚酸中培養(yǎng)9 h后進行細胞收集，調(diào)整待測菌體濃度為1×106個細胞/mL，用碘化丙啶（PI，10 μg/mL）的PBS（0.1 mol/L，pH7.4）溶液染色。上樣量1 mL，流速為2.0 mL/min，收集20 000個細胞，激發(fā)光波長488 nm，檢測波長564-606 nm條件進行檢測。陽性和陰性對照為原始菌株在不含抑制物的SM中培養(yǎng)9 h后，收集細胞分別在沸水浴處理10 min和不處理。圖4中黑虛線是通過陽性和陰性對照細胞數(shù)量標記的PI染色和未染色細胞的界線，右側(cè)為被染色的細胞比例。

1.2.4 計算方法 酵母在不同酚酸抑制物培養(yǎng)基中的生長性能由比生長速率（μ）和菌體最大生物量（Biomass）表示。計算公式如下：μ=ln（xt/x0）/t，式中xt、x0分別為t和0時刻菌體濃度，單位g/L；t為菌體濃度x0到xt的間隔時間，單位h。釀酒酵母發(fā)酵性能分別由最大葡萄糖消耗速率（QGlu）和乙醇生產(chǎn)速率（QEth）表示，計算公式如下［9］：QGlu=（G0-Gt）/t；QEth=Eth/t，式中 G0和Gt分別是 0和 t時刻葡萄糖濃度，單位g/L；Eth是最大乙醇濃度，單位g/L；t為發(fā)酵時間，單位h。馴化菌株的生長和發(fā)酵性能變化以Dx表示，Dx=（Xt-Xp）/Xp×100%，其中Xt和Xp分別代表馴化菌株和原始菌株的生長和發(fā)酵性能各項指標。

表1 混合酚酸培養(yǎng)基濃度

2 結(jié)果

2.1 酚酸對釀酒酵母生長和發(fā)酵的影響

首先考察單一酚酸對釀酒酵母生長和發(fā)酵的影響。生長方面，低濃度酚酸對酵母比生長速率沒有明顯抑制，隨著濃度增加，生長抑制作用逐漸增強。得到香草酸、丁香酸和對羥基苯甲酸的最小致死濃度分別為3.03、3.82和5.04 g/L（圖1-A）。其中，由于丁香酸水中溶解度較低［16］，其濃度高于2.0 g/L對酵母產(chǎn)生的抑制作用未能進行實驗檢測。而其最小致死濃度是參考已有研究報道的方法，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)通過非線性擬合曲線向外延伸與x軸的交點推測所得［5］。發(fā)酵方面，糖耗速率和乙醇生產(chǎn)速率變化趨勢與生長變化趨勢一致。雖然香草酸和對羥基苯甲酸對乙醇發(fā)酵速率有明顯抑制作用，但是并未影響乙醇最高濃度。而丁香酸在本實驗濃度范圍內(nèi)對酵母的糖耗和乙醇發(fā)酵沒有明顯的抑制作用。（圖1-B-D）。

進一步考察混合酚酸之間相互作用對酵母菌的協(xié)同抑制。隨混合酚酸濃度增加，菌體最大生物量和比生長速率均受到明顯抑制，生長延滯期由3 h延長至24 h（圖2-A）。同時，糖耗速率和乙醇生產(chǎn)速率逐漸降低，乙醇最高濃度從8.33 g/L降低為0。當(dāng)混合酚酸中香草酸、對羥基苯甲酸和丁香酸濃度分別為1.91、1.14和0.95 g/L時，在培養(yǎng)15 h內(nèi)酵母生長收到完全抑制，發(fā)酵性能受到嚴重影響（圖2-B）。

2.2 短期馴化策略提高釀酒酵母的耐受性

通過不同馴化策略提高釀酒酵母對酚酸耐受能力，分別在馴化培養(yǎng)過程中逐漸提高（策略A）、保持恒定（策略B）和脈沖式提高（策略C）酚酸濃度。結(jié)果表明，在單獨和混合酚酸作用下，策略B馴化菌株的比生長速率、最大生物量和乙醇生產(chǎn)速率均高于其他馴化菌株，其中比生長速率的提高最顯著，可達70%以上。另外，對羥基苯甲酸作用下，策略C馴化菌株的葡萄糖消耗速率略高于其他馴化菌株，相比原始菌株提高了46.73%。馴化菌株生長和發(fā)酵性能均比原始菌株得到顯著提升，其中，策略B馴化菌株的比生長速率、最大生物量和乙醇生產(chǎn)速率均高于其他馴化菌株，在生長和乙醇發(fā)酵方面對酚酸均表現(xiàn)出良好的耐受性（圖3）。

2.3 酵母細胞膜完整性分析

細胞膜是發(fā)酵微生物對有害物質(zhì)的選擇性屏障，因此通過熒光探針對酚酸作用下酵母細胞膜完整性進行檢測，分析其對酚酸耐受性的原因。碘化丙啶（PI）是一種熒光染料，能夠穿過破損的細胞膜與胞內(nèi)DNA結(jié)合形成能夠產(chǎn)生紅色熒光的復(fù)合物，從而標記細胞膜受損細胞。流式細胞檢測結(jié)果表明原始菌株（PS）和馴化策略培養(yǎng)過程的對照組菌株（Control）被PI染色的細胞率分別是28.8%和26.0%，明顯高于策略A、B和C馴化菌株，其中策略B馴化菌株P(guān)I染色細胞率最低，僅為10.8%（圖4），這與上述酚酸作用下生長發(fā)酵性能的結(jié)果一致。

圖1 單一酚酸化合物對酵母生長和發(fā)酵的影響

圖2 混合酚酸化合物對酵母生長和發(fā)酵性能的影響

3 討論

木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中主要產(chǎn)生呋喃、弱酸和酚類三大類抑制物［17］，其中對于酚類抑制物的研究主要集中于毒性較強的酚醛抑制物，而對于酚酸類抑制物的作用機制和應(yīng)對措施并未徹底研究清楚。單一和混合酚酸對釀酒酵母生長和發(fā)酵性能的影響表明，單一酚酸在低濃度時，對釀酒酵母的生長和發(fā)酵沒有明顯的抑制作用；當(dāng)增加到一定濃度時，對比生長速率、糖耗速率和乙醇生產(chǎn)速率有明顯的抑制作用，但對產(chǎn)生乙醇的最高濃度沒有影響。這與之前關(guān)于酚酸對其他微生物抑制作用的研究結(jié)果一致［7，9，13］。這可能因為酚酸主要對酵母的生長產(chǎn)生抑制，而并不直接作用于乙醇發(fā)酵代謝路徑，從而表現(xiàn)出生長速率下降進而限制糖耗和乙醇生產(chǎn)速率。另外，本實驗所選用酚酸的抑制作用順序為香草酸>丁香酸>對羥基苯甲酸，這可能與其官能團類型和位置有關(guān)［5］?；旌戏铀釋湍妇纳L和發(fā)酵抑制作用顯著增強，特別對發(fā)酵可達最高乙醇濃度有嚴重影響。這與相關(guān)研究報道的混合酚酸對其他種類微生物的生長具有協(xié)同抑制作用的結(jié)果相似［7，18］。

圖3 短期酚酸脅迫策略對酵母酚酸耐受性影響

圖4 酚酸對酵母細胞膜完整性影響

馴化策略在微生物育種構(gòu)建魯棒性工業(yè)發(fā)酵微生物方面是一種非常有效的方法［16，19-20］。短期馴化方法適合工業(yè)發(fā)酵實際應(yīng)用，將馴化過程整合到種子液培養(yǎng)過程同時完成，簡化操作步驟。本實驗比較不同短期馴化策略對釀酒酵母酚酸耐受性的影響。結(jié)果表明，馴化策略均能提高酵母菌株在單一和混合酚酸環(huán)境中的生長和發(fā)酵性能，特別是比生長速率和葡萄糖消耗速率提高比較明顯。這與之前研究報道短期馴化提高酵母對高滲透壓和抑制物等惡劣條件耐受能力的結(jié)果類似［21-22］。但是，短期馴化獲得的菌株所產(chǎn)生的酚酸耐受性表型，在撤去酚酸壓力脅迫后并不能在子代中穩(wěn)定遺傳（相關(guān)數(shù)據(jù)本文沒有列舉），因此推測短期馴化并未導(dǎo)致原始菌株產(chǎn)生相應(yīng)的基因突變。而酵母菌株產(chǎn)生酚酸耐受性提高現(xiàn)象的原因可能是短期酚酸壓力脅迫使酵母產(chǎn)生應(yīng)激作用，并形成了對酚酸應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄記憶，當(dāng)馴化后將其轉(zhuǎn)接到酚酸培養(yǎng)基中，在初始階段酵母細胞能夠很快表現(xiàn)出對酚酸耐受性狀［23-24］。另外，策略B馴化菌株在生長和發(fā)酵方面均優(yōu)于其他馴化菌株，這可能與不同馴化過程中酚酸濃度變化情況有關(guān)。保持恒定酚酸濃度可能更容易使細胞產(chǎn)生表觀遺傳的轉(zhuǎn)錄記憶。

酚類化合物因其具有較強的疏水性，能夠插入細胞膜脂質(zhì)分子層破壞細胞膜的完整性，從而導(dǎo)致細胞凋亡［25］。實驗結(jié)果說明，酚酸能夠破壞釀酒酵母的細胞膜完整性，這與其他酚類化合物對微生物的破壞作用機制相同。經(jīng)過短期馴化策略能使酵母細胞膜在酚酸作用下能夠保持良好的完整性，從而提高對酚酸的耐受性。對于更為深入的耐受性機制分析，將在后續(xù)研究中通過透射電鏡直接觀察其結(jié)構(gòu)形態(tài)變化，以及分析其細胞膜脂質(zhì)成分的變化，從而揭示酵母細胞應(yīng)對酚酸的作用機制。

4 結(jié)論

木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程產(chǎn)生的酚酸類化合物對釀酒酵母的生長有抑制作用，從而導(dǎo)致乙醇發(fā)酵性能下降。多種酚酸混合后因彼此之間的相互作用會對酵母產(chǎn)生更強的抑制作用；短期馴化策略能夠有效提高酵母菌株在混合酚酸脅迫下的生長和發(fā)酵性能。馴化菌株酚酸耐受性的強弱與馴化過程中酚酸脅迫壓力水平變化方式有關(guān)；短期馴化提高酵母酚酸耐受性可能與細胞膜應(yīng)激反應(yīng)保持其完整性有關(guān)。后續(xù)將從細胞膜的結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)成分，以及相關(guān)基因等方面進行脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，進一步解釋其內(nèi)在作用機制。