葡萄ERECTA基因過表達(dá)提高擬南芥生長量和耐熱性

劉敏 房玉林

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，楊凌 712100；3. 陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100）

植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)受到一系列基因的調(diào)控。據(jù)報道，ERECTA基因是一個多功能基因，既與葉片、氣孔、花和胚珠的發(fā)育有關(guān)，又參與植物在生物和非生物脅迫下的生理響應(yīng)［1］。早在1957年就發(fā)現(xiàn)了ERECTA基因缺失的擬南芥突變體 Landsbergerecta（Ler），直到 1996年 Torii等才將擬南芥ERECTA基因克隆出來，并進(jìn)行了序列分析［2］。ERECTA基因編碼一個富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucine-rich repeat，LRR）的類受體激酶（Receptorlike kinase，RLK），定位于細(xì)胞膜上，是一個跨膜蛋白，由胞外的LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域3部分組成［2］。ERECTA蛋白的結(jié)構(gòu)特點決定了其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用。在擬南芥中，ERECTA基因還有兩個同系物，分別為ERL1和ERL2，這3個基因組成了ERECTA基因家族。

ERECTA基因家族可以抑制氣孔發(fā)育，ERECTA/ERL1/ERL2基因過表達(dá)可以減少氣孔的數(shù)量，而3個基因同時缺失會形成氣孔簇［3］。ERECTA家族蛋白可與類受體蛋白TOO MANY MOUTHS（TMM）形成異源二聚體［4］，該二聚體受氣孔蛋白EPF1和EPF2的激活和氣孔蛋白STOMAGEN的抑制。TMM缺失后植株表型與er erl1 erl2突變體相同，說明TMM對于ERECTA家族蛋白功能的正常發(fā)揮是必須的［3］。Meng等［5］發(fā)現(xiàn) ERECTA 可與 SERK 和 TMM形成多蛋白受體來調(diào)控氣孔形態(tài)。此外，該基因家族與植物形態(tài)建成有關(guān)。ERECTA基因缺失表現(xiàn)為植株矮小，花序緊湊，而且花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊、角果、葉柄等都有減小的趨勢，在er erl1 erl2三缺突變體中，矮化程度更為嚴(yán)重［2］。

ERECTA基因家族是植物脅迫響應(yīng)信號通路中的重要組分。有研究表明，ERECTA基因與植物的抗旱能力密切相關(guān)，該基因可以提高植物的蒸騰效率。與野生型相比，erecta突變體的蒸騰效率顯著降低，而基因互補可以使其蒸騰效率恢復(fù)到野生型的水平［6］。將擬南芥ERECTA基因在番茄中過表達(dá)可提高植株的蒸騰效率［7］。楊樹ERECTA基因在擬南芥中過表達(dá)，可導(dǎo)致苗期初生根變長，葉面積變大，植株的蒸騰效率顯著提高［8-9］。水稻phy B突變體中ERECTA家族基因上調(diào)表達(dá)，可使水稻葉片表皮細(xì)胞增大，氣孔密度降低，植株蒸騰效率提高［10］。蒸騰效率可以表示植物的水分利用率，蒸騰效率越高，說明水分利用率越高。對菜豆ERECTA基因與抗旱性的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明在野生品種ERECTA基因5'端顯示出比栽培品種更高的多樣性，且抗旱性更強［11］。ERECTA基因還參與植物的高溫響應(yīng)。小麥ERECTA基因過表達(dá)后，在高溫脅迫下葉片中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性和可溶性糖含量顯著提高，有利于減少高溫對于植株的損傷［12］。ERECTA基因家族在植物非生物脅迫響應(yīng)中的作用可能與鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）有關(guān)。CaM是植物中普遍存在的多功能多肽信號分子［13-14］，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ERECTA胞外富亮氨酸區(qū)域含有CaM結(jié)合域，并且通過酵母泛素系統(tǒng)和SPR傳感芯片標(biāo)記證實擬南芥ERECTA胞外結(jié)構(gòu)域可與CaM2相互作用［15］。

目前已經(jīng)在番茄、馬鈴薯、楊樹、水稻、小麥、大豆等基因組中鑒定出ERECTA基因，本課題組已將葡萄ERECTA基因鑒定和克隆出來［16］。為了進(jìn)一步研究該基因在植物生長發(fā)育和高溫響應(yīng)中的作用，本研究將葡萄ERECTA基因在擬南芥中過表達(dá)，觀察其表型變化和對高溫的耐受性。實驗結(jié)果將為培育葡萄抗性新品種提供新的基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

將一年生歐亞種“赤霞珠”（Vitis viniferaL.‘Cabernet Sauvignon’）扦插苗種植在塑料盆（直徑14 cm，高度10 cm）中，營養(yǎng)土與珍珠巖比例為4∶1，在西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為22-27℃，濕度為70%-90%，每周澆2次水。移栽3個月后，植株長至10-12片，選擇健康無病蟲害、長勢一致的植株進(jìn)行試驗處理。將“赤霞珠”植株移至25℃植物培養(yǎng)箱中適應(yīng)2 d，濕度70%，光照12 000 Lux，第3天將植株分別置于45℃植物培養(yǎng)箱中連續(xù)處理48 h，晝夜16 h/8 h，每個處理5 盆［17］。

在葡萄種質(zhì)資源圃（陜西楊陵，34.29 °N，108.35 °E）于花期采集赤霞珠的根、莖、老葉、幼葉、花、卷須、夏芽和冬芽，用于分析ERECTA基因的組織特異性表達(dá)。

1.2 方法

1.2.1 基因表達(dá)量的測定 將葡萄組織在液氮中研磨成粉末，用植物總RNA提取試劑盒（百泰克，北京）提取RNA；將0.5 μg RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾維贊，南京）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以葉片cDNA為模板，用Icycler iQ5熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）檢測葡萄ERECTA基因的表達(dá)量。根據(jù)基因序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，上游引物：5'-CTGCTCCACTTCCATCTAC-3'，下游引物：5'-ACTGCCTCATCACTCACT-3'。qRT-PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR qPCR Master Mix（2×）10 μL（諾維贊，南京），上下游引物（10 μmol/L）各0.4μL，cDNA 模板（50 ng/μL）1 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，57℃退火30 s，共40個循環(huán)，設(shè)3次重復(fù)。以GAPDH（XM_002263109）為內(nèi)參基因，計算基因相對表達(dá)量 2-ΔΔCt［18］。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將赤霞珠葉片在液氮保護(hù)下研磨成粉末，用MiniBEST植物基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa，大連）提取基因組DNA（gDNA）。根據(jù)NCBI中葡萄ERECTA基因組序列和pBI121載體序列，使用CE Design V1.04軟件設(shè)計引物，上游引物：ACGGGGGACTCTAGAGGATCCATG AGGTGGTTTGCGAGGTCA，下游引物：CGATCGGG GAAATTCGAGCTCGTCCAGCCAGGCTCCACAG（下劃線部分為同源臂）。以葉片gDNA為模板，使用Q5熱啟動超保真DNA聚合酶（NEB，美國）進(jìn)行PCR，獲得目的片段葡萄ERECTA基因組DNA。用BamHI和SacI（NEB，美國）對pBI121載體進(jìn)行雙酶切，用ClonExpress II一步克隆試劑盒（諾維贊，南京）進(jìn)行同源重組，經(jīng)雙酶切驗證后，獲得植物表達(dá)載體pBI121-gER。

1.2.3 擬南芥轉(zhuǎn)化 用含有重組質(zhì)粒pBI121-gER的農(nóng)桿菌，對野生型擬南芥Col進(jìn)行轉(zhuǎn)化，待其成熟收獲種子記為T0代。經(jīng)卡那霉素篩選后得到T1代植株，單株收取種子，繼續(xù)進(jìn)行抗性篩選，直至獲得轉(zhuǎn)基因純合系（T3代）［19］。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定 將野生型Col、ERECTA基因缺失型Ler和過表達(dá)型ER-OE的擬南芥植株在溫度22℃、濕度70%、晝夜16 h/8 h條件下培養(yǎng)。在第4周統(tǒng)計葉片數(shù)目，測量葉片長度和寬度，在植株停止生長后，測量株高、角果長度和直徑，隨機選取20個植株進(jìn)行測量，取平均值。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱性鑒定 轉(zhuǎn)基因幼苗的耐熱性鑒定：將野生型Col、缺失型Ler和過表達(dá)ER-OE的種子置于1/2 MS培養(yǎng)基上，4℃春化3 d后，45℃高溫處理1 h，然后在植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，溫度22℃，濕度70%，晝夜16 h/8 h，統(tǒng)計萌發(fā)率并觀察幼苗形態(tài)變化，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)100粒種子。

轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性鑒定：將4周齡野生型Col、缺失型Ler和過表達(dá)ER-OE的擬南芥植株在40℃條件下處理4 d，濕度70%，光照12 000 Lux，晝夜16 h/8 h，然后在22℃條件下恢復(fù)5 d，觀察植株形態(tài)變化，檢測電導(dǎo)率并統(tǒng)計存活率，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)20棵植株。

2 結(jié)果

2.1 高溫處理對葡萄ERECTA基因表達(dá)的影響

在高溫處理1 h后，葡萄葉片中ERECTA基因顯著上調(diào)表達(dá)，在處理8 h后表達(dá)量最高，是處理前的31倍（圖1）。之后基因表達(dá)量逐漸降低，但在處理48 h后，ERECTA基因表達(dá)量仍顯著高于處理前。結(jié)果表明，ERECTA基因在葡萄高溫應(yīng)答中起到一定作用。

圖1 高溫處理后葡萄ERECTA基因表達(dá)量的變化

2.2 葡萄ERECTA基因的組織特異性表達(dá)

對葡萄不同組織中ERECTA基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該基因在幼葉和花中的表達(dá)量較高，在冬芽和夏芽中的表達(dá)量次之，在莖、老葉、卷須和根中的表達(dá)量較低（圖2）。

圖2 葡萄ERECTA基因在不同組織中的表達(dá)量

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

ERECTA基因的內(nèi)含子和Poly A尾巴對基因的表達(dá)具有重要作用，為了后續(xù)的轉(zhuǎn)基因試驗，我們對赤霞珠ERECTA基因組DNA進(jìn)行克隆，序列是從ATG到TAA再加上Poly A尾巴，長度為7 928 bp，電泳結(jié)果如圖3。用同源重組法構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-gER，雙酶切驗證結(jié)果如圖4。

圖3 目的基因的擴(kuò)增

圖4 植物表達(dá)載體的雙酶切驗證

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定

對4周齡的野生型Col、缺失型Ler和過表達(dá)型ER-OE的擬南芥植株進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Ler的葉片較小，呈近圓形，葉柄短，而ER-OE的葉片較大，呈橢圓形，葉柄長（圖5-A），經(jīng)過測量Col、Ler和ER-OE葉片的平均長度分別為15.29、9.19、17.44 cm（圖6-A），平均寬度分別為8.99、5.63、和10.49 cm（圖6-B）。由此可見，ERECTA過表達(dá)后，葉片長度和寬度顯著增加，葉面積變大。

在花期觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Ler花梗短粗，花序緊湊，而ER-OE花梗細(xì)長，花序松散（圖5-B）。Ler角果與野生型相比也出現(xiàn)短而粗的現(xiàn)象，而ER-OE的角果較長（圖5-C），經(jīng)測量Col、Ler、ER-OE的角果長度分別為13.74、9.43、14.51mm（圖6-C），角果直徑分別為 0.79、1.04、0.79 mm（圖 6-D）。由此可見，ERECTA過表達(dá)后，花梗變細(xì)長，角果長度顯著增加，而角果直徑無顯著變化。

在花全部凋落、植株停止生長時測量Col、Ler和ER-OE的株高，分別為24.80、18.86和27.84 cm（圖6-E），葉片數(shù)分別為16、11和18/株（圖6-F）。由此可見，ERECTA過表達(dá)可以增加植株高度和葉片數(shù)量。

圖5 Col、Ler和ER-OE的表型觀察（Bar=1 cm）

圖6 Col、Ler和ER-OE的形態(tài)指標(biāo)

圖7 Col、Ler和ER-OE幼苗的高溫處理結(jié)果

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱性鑒定

2.5.1 轉(zhuǎn)基因幼苗的耐熱性鑒定 將擬南芥種子在高溫處理后常溫培養(yǎng)2 d，觀察發(fā)現(xiàn)Col、Ler和ER-OE種子均可以正常萌發(fā)，萌芽率均為100%。但三者生長情況不同，Ler幼苗因受到高溫脅迫，大部分幼苗發(fā)育不正常，表現(xiàn)為葉面積小，顏色較深，為墨綠色；約一半Col幼苗發(fā)育不正常；ER-OE幼苗未受到高溫脅迫的影響，幼苗長勢一致，葉子發(fā)育正常，顏色為嫩綠色（圖7）。以上結(jié)果說明葡萄ERECTA在擬南芥中過表達(dá)提高了幼苗的耐熱性。

2.5.2 轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性鑒定 40℃高溫處理4 d后，所有Ler植株都出現(xiàn)了高溫?fù)p傷，葉片發(fā)黃、卷曲變形；Col植株只有一部分出現(xiàn)葉片邊緣發(fā)黃的現(xiàn)象；ER-OE植株的耐熱性明顯高于野生型和缺失型，僅有個別植株出現(xiàn)損傷（圖8-A）。在22℃恢復(fù)5 d后，Col、Ler和ER-OE的存活率分別為33%、12%和83%（圖8-B）。在高溫處理過程中檢測擬南芥葉片的電導(dǎo)率，結(jié)果顯示在處理第1天Col、Ler和ER-OE電導(dǎo)率出現(xiàn)顯著差異，大小順序為Ler>Col>ER-OE。隨著高溫處理時間的延長，電導(dǎo)率逐漸升高，在處理第4天ER-OE電導(dǎo)率為50.70%，而Col和Ler細(xì)胞受損嚴(yán)重，電導(dǎo)率分別達(dá)到66.37%和77.20%（圖8-C）。

圖8 4周齡Col、Ler和ER-OE植株的高溫處理結(jié)果

3 討論

3.1 ERECTA基因?qū)χ仓晟L發(fā)育的影響

在本研究中，ERECTA基因在葡萄幼葉中表達(dá)量較高，該基因在擬南芥和番茄的幼葉中也具有較高的表達(dá)量［20-21］，而且ERECTA基因在未成熟番茄果實中的表達(dá)量顯著高于成熟果實［21］。以上結(jié)果說明ERECTA基因在植物發(fā)育的早期發(fā)揮重要作用。葡萄ERECTA基因在擬南芥中過表達(dá)使葉片、花梗、角果的長度和株高顯著高于野生型，這與前人研究結(jié)果一致［22］。Uchida等［23］發(fā)現(xiàn)erecta突變體中莖、花梗、角果和葉片的伸長缺陷可以通過韌皮部ERECTA基因的表達(dá)而恢復(fù)，而在木質(zhì)部或表皮中表達(dá)不能恢復(fù)，說明韌皮部ERECTA的表達(dá)對植株形態(tài)具有決定性作用；同時發(fā)現(xiàn)EPFL4和EPFL6配體對ERECTA的活性具有調(diào)控作用。epfl4 epfl6突變體具有erecta突變體的表型，使用內(nèi)表皮特異性啟動子SCARECROW表達(dá)EPFL4或EPFL6基因可使其恢復(fù)表型，說明ERECTA的活性受內(nèi)表皮中 EPFL4和 EPFL6配體的調(diào)控［23］。ERECTA基因缺失會導(dǎo)致葉肉細(xì)胞、花梗皮層細(xì)胞和花瓣表皮細(xì)胞的數(shù)量減少［3，6，24］，說明該基因是通過促進(jìn)細(xì)胞增殖的方式來影響植株地上組織的大小和形態(tài)，而與細(xì)胞伸長無關(guān)。已有研究表明生長素、赤霉素、油菜素內(nèi)酯等激素參與了植物細(xì)胞的增殖，因此ERECTA介導(dǎo)的信號途徑很可能與這些激素信號具有交互作用［25-27］。

在本研究中，葡萄ERECTA基因過表達(dá)導(dǎo)致葉片數(shù)量增加，這是由于該基因可以促進(jìn)葉原基的形成。葉原基的形成與頂端分生組織（SAM）中生長素的含量和分布密切相關(guān)［28］。有研究表明，ERECTA基因家族在協(xié)調(diào)SAM外層和內(nèi)層細(xì)胞功能方面起到重要作用［29］。與野生型相比，er erl1 erl2突變體的葉原基減少，葉序異常，研究表明這種表型是由生長素運輸缺陷引起的。在生長素運輸過程中起主要作用的是載體PIN1，pin1-6突變體與er erl1 erl2突變體的表型相同。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在er erl1 erl2突變體的SAM中PIN1基因表達(dá)量與野生型相比無顯著差異，而是蛋白含量顯著降低，說明ERECTA基因家族是在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控PIN1的表達(dá)［30］。

3.2 ERECTA基因在高溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用

隨著氣候變暖和極端高溫天氣頻發(fā)，高溫脅迫已成為影響植物生長發(fā)育的主要脅迫之一。植物的高溫應(yīng)答涉及多個基因、多種蛋白和多個信號通路，是一個非常復(fù)雜的過程。ERECTA是一種跨膜蛋白，可以接受胞外信號并傳遞到胞內(nèi)，目前研究較多是其在植物生長發(fā)育過程中的作用，而在逆境脅迫中的作用研究較少。在本研究中我們將葡萄ERECTA基因在擬南芥中過表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株在高溫下的存活率顯著高于Col和Ler。Shen等［22］發(fā)現(xiàn)將AtERECTA在擬南芥、番茄和水稻中過表達(dá)，可以顯著提高植株的耐熱性，并用實驗證明植株耐熱性的提高與蒸騰作用無關(guān)，推測可能是ERECTA在高溫下對細(xì)胞膜具有一定保護(hù)作用，但缺乏足夠的證據(jù)。我們認(rèn)為ERECTA基因提高植株耐熱性與其在高溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用有關(guān)。在調(diào)控細(xì)胞增殖方面，ERECTA位于MAPK級聯(lián)系統(tǒng)的上游［24］，由此推測高溫條件下ERECTA也是通過MAPK系統(tǒng)來傳遞信號。具體來說，高溫促進(jìn)了ERECTA與配體結(jié)合，激活了胞內(nèi)蛋白激酶，將信號傳遞給MAPK級聯(lián)系統(tǒng)，接著轉(zhuǎn)錄因子通過磷酸化作用被激活，進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，促進(jìn)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)；高溫下ABA、SA、MeJA等逆境激素含量增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)ERECTA基因的表達(dá)［16］，并增強MAPK信號；高溫下線粒體和葉綠體產(chǎn)生大量ROS，可以增強MAPK信號［31］，但其含量受到抗氧化酶的抑制。ROS是否可以誘導(dǎo)ERECTA基因的表達(dá)、ERECTA是否可以磷酸化MEKK1等問題還不清楚，需要進(jìn)一步用實驗證實。度、寬度和數(shù)量，花梗變細(xì)長，角果長度和株高也顯著增加。ERECTA基因既可以提高植株的耐熱性，又可以增加生長量，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有很好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

葡萄ERECTA在擬南芥中過表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗和植株的耐熱性，增加了葉片的長