甜玉米蔗糖合成酶基因ZmSus6和ZmSus7的克隆及組織表達(dá)特異性檢測(cè)

陳慧敏 李敏慧 馮送聯(lián) 楊泉女 上官?lài)?guó)蓮 鐘希瓊 李國(guó)強(qiáng) 汪躍華 王蘊(yùn)波 吳富旺

摘要：【目的】克隆甜玉米蔗糖合成酶（Sus）基因ZmSus6和ZmSus7，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析及組織表達(dá)特異性檢測(cè)，為深入研究其在甜玉米生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)形成過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供理論參考?！痉椒ā恳蕴鹩衩灼贩N佛甜10號(hào)為材料，采用RT-PCR克隆ZmSus6和ZmSus7基因，通過(guò)ProtParam、SOPMA、SignalP 4.0 Server等進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其組織表達(dá)特異性?！窘Y(jié)果】ZmSus6和ZmSus7基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度分別為2550和2574 bp，編碼849和857個(gè)氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)的蛋白分子量為96.27和97.79 kD，理論等電點(diǎn)為7.63和8.19，均無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。ZmSus6蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白，定位于葉綠體或線粒體;ZmSus7蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中。ZmSus6和ZmSus7蛋白歸屬于PLN00142家族（Sus超級(jí)家族），具有Sus和糖基轉(zhuǎn)移酶的兩個(gè)功能域，分別與高粱SbSus6和SbSus7蛋白的氨基酸序列同源性最高，其同源性對(duì)應(yīng)為88.44%和96.62%，歸屬為單子葉植物III型Sus基因家族。ZmSus6和ZmSus7基因在甜玉米的根、莖、葉、玉米芯和籽粒中均有表達(dá)，但存在顯著差異（P<0.05），分別以葉和根中的相對(duì)表達(dá)量最高。【結(jié)論】ZmSus6和ZmSus7基因具有一定的組織表達(dá)特異性，可能在甜玉米生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 甜玉米;蔗糖合成酶;基因克隆;生物信息學(xué);基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： S513.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）05-1098-10

Abstract：【Objective】To lay the foundation for further revealing role of genes ZmSus6 and ZmSus7 in sweet corn growth and quality formation， the sucrose synthase（Sus） genes ZmSus6 and ZmSus7 of sweet corn were cloned， and their bioinformatics and tissue expression specificity were analyzed. 【Method】RT-PCR was applied to clone ZmSus6 and ZmSus7 genes from sweet corn variety Fotian No. 10， then their biological information was analyzed by ProtParam，SOPMA，SignalP 4.0 Server，the phylogenetic tree was established using MEGA 6.0， and the tissue expression specificity was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. 【Results】The open reading frames（ORF） of ZmSus6 and ZmSus7 genes were 2550 and 2574 bp，encoding 849 and 857 amino acids residues，with molecular weights of 96.27 and 97.79 kD，and theoretical isoelectric points（pI） of 7.63 and 8.19，respectively. In addiction，both of protein peptide chains had no signal peptide or obvious transmembrane region，and the secondary structure were mainly α-helix. Stability prediction indicated that SbSus6 was an unstable hydrophilicprotein but ZmSus7 was stable hydrophilic protein. Subcellular localization prediction showed ZmSus6 might locate in the chloroplast or mitochondria，while ZmSus7 in the cytoplasm. Domain ana-lysis suggested both ZmSus6 and ZmSus7 belonged to PLN00142 family（Sus superfamily） including Sus and glycosyltransferase fuctional domains. Moreover，amino acid sequence alignment showed that ZmSus6 had highest homology with SbSus6（88.44%） protein of Sorghum bicolor，while ZmSus7 had the highest homology（96.62%） with SbSus7 of S. bico-lor，respectively，and assigned to the monocotyledonous type III Sus gene family. Finally，the ZmSus6 and ZmSus7 genes widely expressed in root，stem，leaf，cob and kernel of sweet corn with significant differences（P<0.05），but the highest expressions of ZmSus6 and ZmSus7 genes? were in leaves and root tissues respectively. 【Conclusion】The ZmSus6 and ZmSus7 genes have certain tissue specificity expression，and their encoded proteins may play an important role in the growth and quality formation of sweet corn.

Key words： sweet corn; sucrose synthase; gene cloning; bioinformatics analysis; gene expression

Foundation item： National Natural Science Foundation of China for Youth（31701670）; Key Area Research and Development Program of Guangdong（2018B020202008）; Scientific and Technological Innovation Platform of Fresh Food Storage and Processing Construction Project of Foshan（2015AG10011）

0 引言

【研究意義】甜玉米（Zea mays L. saccharata Sturt）為玉米屬中的甜質(zhì)類(lèi)型，原產(chǎn)于美洲，也稱(chēng)為果蔬玉米或水果玉米。我國(guó)華南地區(qū)是甜玉米的主產(chǎn)區(qū)和主要消費(fèi)區(qū)，在國(guó)家農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮重要作用。植物生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老等過(guò)程所需的能量主要來(lái)源于糖代謝，包括糖類(lèi)的積累、運(yùn)輸及轉(zhuǎn)化等。當(dāng)植物遭遇低溫、干旱和鹽堿等極端條件時(shí)，蔗糖的積累不僅有利于維持植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性，避免蛋白降解，還能在遭受環(huán)境脅迫后為植物代謝過(guò)程提供能量來(lái)源（Yang et al.，2001;Strand et al.，2003;呂文遠(yuǎn)等，2018）。蔗糖合成酶（Sucrose synthase，Sus）作為蔗糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)調(diào)控植物不同組織中細(xì)胞壁成分或淀粉合成，與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)。因此，克隆甜玉米Sus基因并檢測(cè)其組織表達(dá)特異性對(duì)了解甜玉米糖類(lèi)代謝及其品質(zhì)形成具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已在甜玉米抗逆脅迫、生長(zhǎng)發(fā)育、分子雜交育種等方面開(kāi)展大量研究工作（林婕等，2018;Baseggio et al.，2019;李余良等，2019;Yang et al.，2019），但對(duì)甜玉米品質(zhì)形成和成熟衰老過(guò)程仍缺乏深層次的認(rèn)識(shí)，尤其是關(guān)于Sus基因家族在糖分代謝中作用的研究報(bào)道較少。Hardin和Huber（2004）研究表明，在玉米葉片中的Sus可通過(guò)磷酸化修飾選擇性地激活蔗糖水解酶活性，從而增強(qiáng)其對(duì)底物的親和性。Wei等（2017）研究表明，低溫貯藏能增強(qiáng)枇杷中的蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）和Sus活性，提高果糖含量，從而增強(qiáng)果實(shí)抗冷性，維持果實(shí)的外觀品質(zhì)。Zhu等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，糖類(lèi)含量（蔗糖）與果實(shí)品質(zhì)密切相關(guān)，而Sus活性能直接影響果實(shí)中蔗糖的積累水平。趙云等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，開(kāi)花后高溫處理能抑制小麥籽粒的Sus活性，從而影響籽粒中淀粉的累積。Moshchenskayaa等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，植物的Sus活性不僅受大氣、pH、溫度、土壤濕度及肥料等外界環(huán)境因素的影響，還受基因表達(dá)水平和翻譯后水平調(diào)控的影響。Liu等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，ERF72轉(zhuǎn)錄因子（Ethylene-responsive factor）通過(guò)負(fù)調(diào)控Sus1基因表達(dá)，從而影響木薯根莖中淀粉的積累。此外，大量研究表明，植物組織中存在不同活性的Sus同工酶，其基因表達(dá)也可能具有生長(zhǎng)發(fā)育特異性和組織特異性。自第一個(gè)Sus基因（ZmSH1，Shrunken1）從玉米中克隆后，大量Sus基因家族成員被發(fā)現(xiàn)，且不同物種中Sus基因家族成員的數(shù)量不同。如擬南芥（Baud et al.，2004）、桃（Zhang et al.，2015）和水稻（Fan et al.，2019）等植物中含有6～10個(gè)Sus基因家族成員，而在白楊（An et al.，2014）、煙草（Wang et al.，2015）、蘋(píng)果（Tong et al.，2018）和中華梨（Abdullah et al.，2018）等植物中含有較多數(shù)量的Sus基因家族成員，分別為11、15、14和30個(gè)。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在玉米基因組中存在5個(gè)Sus基因家族成員，其中ZmSH1、ZmSus1和ZmSus3基因已被成功克隆，且其表達(dá)模式也已明確（Hardin and Huber，2004;Duncan et al.，2006）。【本研究切入點(diǎn)】目前，尚未見(jiàn)有關(guān)ZmSus6和ZmSus7基因克隆及組織表達(dá)特異性的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以甜玉米品種佛甜10號(hào)的根、莖、葉和果穗為材料，利用RT-PCR克隆ZmSus6和ZmSus7基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其組織表達(dá)特異性，為深入探究二者對(duì)甜玉米糖類(lèi)代謝的調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試甜玉米品種佛甜10號(hào)種植于廣東省佛山市南海區(qū)顏峰社區(qū)試驗(yàn)地。RNA提取所需試劑如脫氧膽酸鈉、蛋白酶K、Tris、SDS、DTT和無(wú)水乙醇等購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;硼酸鈉十水、EGTA、氯化鋰、醋酸鉀和氯化鉀等購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;基因克隆及表達(dá)分析的主要試劑為T(mén)ranTaq? DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）、EasyTaq? PCR SuperMix、pEASY-T1載體、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell等，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DL5000 DNA Marker和TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）等購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自廣州艾基生物技術(shù)有限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 樣品采集 甜玉米授粉后24 d植株生長(zhǎng)狀態(tài)較佳，籽?？扇苄蕴呛枯^高，為最佳采收期，此時(shí)取玉米芯、籽粒、根、莖和葉等組織，分別用液氮快速凍存，30 min內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 參照改良的熱硼酸法（Wan and Wilkins，1994）提取佛甜10號(hào)不同組織的總RNA，用1.2%瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳進(jìn)行檢測(cè)，并利用Nanodrop微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。參照TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 2. 3 基因克隆及陽(yáng)性克隆鑒定 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索玉米Sus基因序列信息，得到2個(gè)Sus注釋基因即Sus6（XM_008680885.2）和Sus7（XM_008646897.3）。根據(jù)二者的核苷酸序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異引物（表1）。參照TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）說(shuō)明克隆ZmSus6和ZmSus7基因全長(zhǎng)序列。其反應(yīng)體系50.0 μL：10×TansTaq? HiFi Buffer I 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各3.0 μL，cDNA模板20 ng，TransTag? HiFi DNA Polymerase 0.3 μL，滅菌超純水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收目的片段，將其連接至pEASY--T1載體，再轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。

1. 2. 4 生物信息學(xué)分析 將基因測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST比對(duì)。采用DNAMAN 8.0對(duì)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線預(yù)測(cè)編碼蛋白的理化性質(zhì);利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);通過(guò)SignalP 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）在線預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽;利用TMHMM Server V.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu);采用Wolf Psort（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1. 2. 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異引物（表1）。利用TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）熒光定量PCR試劑盒，以玉米微管蛋白基因（TUB）為內(nèi)參基因，在ABI 7500熒光定量PCR儀系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo)基因表達(dá)量檢測(cè)（Galli et al.，2013）。其反應(yīng)體系20.0 μL：TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（2×） 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference dye II（50×） 0.4 μL，cDNA模板20 ng，滅菌超純水補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，并使用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析。其中，根部的基因相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1，其他組織的基因相對(duì)表達(dá)量為3個(gè)重復(fù)樣品的平均值，用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA提取結(jié)果

由圖1可知，28S和18S RNA條帶清晰，說(shuō)明RNA的提取質(zhì)量較優(yōu)。各組織RNA樣品的OD260/OD280為1.9～2.1，說(shuō)明RNA純度較高，可用于cDNA合成。

2. 2 ZmSus6和ZmSus7基因克隆及測(cè)序結(jié)果

以甜玉米葉片組織cDNA為模板，PCR擴(kuò)增ZmSus6和ZmSus7基因，結(jié)果（圖2）顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物約為2500和2600 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果顯示，ZmSus6基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）為2550 bp，編碼849個(gè)氨基酸殘基;ZmSus7基因的ORF為2574 bp，編碼857個(gè)氨基酸殘基。

2. 3 ZmSus6和ZmSus7蛋白序列分析結(jié)果

由圖3可知，ZmSus6和ZmSus7蛋白歸屬于PLN00142家族（Sus超級(jí)家族），具有Sus和糖基轉(zhuǎn)移酶的兩個(gè)功能域。由圖4可知，ZmSus6和ZmSus7蛋白的氨基酸序列高度保守，其中，ZmSus6與高粱SbSus6（XP_021315397.1）的同源性最高，為88.44%，其次為黍（XP_025799116.1），為80.66%。非保守序列主要位于N端。由圖5可知，ZmSus7與高粱SbSus7（XP_021305179.1）的同源性最高，為96.62%，其次為小米（XP_004966535.2），為95.10%，非保守序列主要位于C端?？梢?jiàn)，甜玉米和高粱的Sus蛋白親緣關(guān)系最近，與黍和小米的Sus蛋白親緣關(guān)系次之。由圖6可知，ZmSus6和ZmSus7蛋白歸屬于單子葉植物III型Sus基因家族，二者的親緣關(guān)系較近，而ZmSH1和ZmSus1屬于單子葉植物I型Sus基因家族，ZmSus3屬于單子葉植物II型Sus基因家族。

2. 4 ZmSus6和ZmSus7蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

ZmSus6蛋白分子式為C4302H6721N1189O1253S35，分子量為96.27 kD，理論等電點(diǎn)為7.63，不穩(wěn)定系數(shù)46.24（≤40為穩(wěn)定蛋白），為不穩(wěn)定蛋白;ZmSus7蛋白分子式C4393H6896N1176O1286S32，分子量為97.79 kD，理論等電點(diǎn)為8.19，不穩(wěn)定系數(shù)34.91，為穩(wěn)定蛋白。其次，ZmSus6和ZmSus7親水性平均系數(shù)分別為-0.339和-0.403，推測(cè)二者為親水性蛋白。此外，ZmSus6和ZmSus7的肽鏈中亮氨酸（Leu）含量較高，分別為10.4%和10.0%，其他種類(lèi)的氨基酸含量均小于10.0%。

2. 5 ZmSus6和ZmSus7蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)SignalP 4.0 Server在線預(yù)測(cè)ZmSus6和ZmSus7蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果如圖7所示，ZmSus6和ZmSus7蛋白的C、S及Y值的平均值均小于0.2，推測(cè)二者無(wú)信號(hào)肽。

2. 6 ZmSus6和ZmSus7蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

利用TMHMM Server V.2.0對(duì)ZmSus6和ZmSus7蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖8）顯示，ZmSus6和ZmSus7蛋白肽鏈均不在細(xì)胞生物膜上，無(wú)明顯跨膜區(qū)域，說(shuō)明二者為非跨膜蛋白（非分泌蛋白），可能存在于細(xì)胞器基質(zhì)中。

2. 7 ZmSus6和ZmSus7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)SOPMA對(duì)ZmSus6和ZmSus7蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖9所示。ZmSus6和ZmSus7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主，分別占50.88%和52.04%，其次為無(wú)規(guī)則卷曲，分別占30.51%和27.77%，延伸鏈結(jié)構(gòu)分別占12.01%和13.07%;β-折疊結(jié)構(gòu)的比例最少，分別占6.60%和7.12%。

2. 8 ZmSus6和ZmSus7蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果

利用Wolf Psort對(duì)ZmSus6和ZmSus7蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，ZmSus6可能定位于葉綠體或線粒體，而ZmSus7可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2. 9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

以玉米TUB作為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ZmSus6和ZmSus7基因在不同組織器官中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖10）顯示，ZmSus6和ZmSus7基因在根、莖、葉、玉米芯和籽粒中均有表達(dá)，但存在顯著差異（P<0.05），二者均在根和葉中的相對(duì)表達(dá)量較高，但不同的是，ZmSus6基因在葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，而ZmSus7基因在根中的相對(duì)表達(dá)量最高。

3 討論

植物糖分含量變化主要是由蔗糖轉(zhuǎn)化及淀粉合成引起。Sus作為一種可逆酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解。至今，已先后從馬鈴薯、甜菜、白楊、擬南芥、煙草、水稻、蘋(píng)果、梨、桃和甘蔗等植物中成功克隆多個(gè)Sus基因家族成員，研究發(fā)現(xiàn)高等植物SuS基因家族可分為Sus I、Sus II和Sus Ⅲ 3個(gè)亞家族，而每個(gè)亞家族又可分為單子葉組和雙子葉組（Stein and Granot，2019）。本研究從甜玉米品種佛甜10號(hào)中克隆獲得ZmSus6和ZmSus7基因，分別編碼849和857個(gè)氨基酸殘基，與高粱和小米等物種具有較高的同源性，在不同物種間具有較高的保守性，歸屬于單子葉植物III型Sus基因家族。目前，在水稻和玉米等模式植物中，Sus I和Sus II基因亞家族已廣泛報(bào)道，但有關(guān)Sus III亞家族基因的生物學(xué)功能仍缺乏深入研究（Brzin et al.，2011;Fan et al.，2019）。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同基因家族成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮不同的生理作用（Wei et al.，2014）。本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，ZmSus6和ZmSus7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主，不具信號(hào)肽，為非分泌蛋白，但不同的是：ZmSus6蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白，可能定位于葉綠體或線粒體中;ZmSus7為穩(wěn)定的親水性蛋白，可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。由此推測(cè)，ZmSus6和ZmSus7基因發(fā)揮不同的生理調(diào)控功能，也與Sus I和Sus II基因亞家族成員（ZmSH1、ZmSus1和ZmSus3）間存在明顯的功能差異有關(guān)。

Sus基因家族中不同成員間不僅在基因調(diào)控上存在差異，在基因表達(dá)上也具有生長(zhǎng)發(fā)育和組織表達(dá)特異性（Wang et al.，2015）。在擬南芥中，Sus基因家族不同成員能受到不同外界條件的誘導(dǎo)，其中，厭氧條件可誘導(dǎo)Sus1和Sus4基因表達(dá)，水分脅迫則誘導(dǎo)Sus3基因在不同組織中表達(dá)，Sus2基因在開(kāi)花后12 d特異性表達(dá)，可作為種子成熟的標(biāo)記基因，而Sus5和Sus6基因是組成型表達(dá)（Baud et al.，2004）。同一基因在不同物種中的功能也存在差異，如Sus7基因在水稻的根、花和未成熟種子中能大量表達(dá)（Cho et al.，2011），在甘蔗中則作為管家基因組成型表達(dá)（Thirugnanasambandam et al.，2019）。在玉米中，Sus1基因在根、莖和葉中表達(dá)，為淀粉合成提供前體，Sus3基因則在胚乳、胚珠、幼芽和根中表達(dá)，而SH1基因在玉米胚乳中特異表達(dá)，影響纖維素的合成（Hardin and Huber，2004;Duncan et al.，2006）。本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ZmSus6和ZmSus7基因在根、莖、葉、玉米芯和籽粒中均有表達(dá)，但ZmSus6基因在葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，而ZmSus7基因在根中的相對(duì)表達(dá)量最高。由此推測(cè)，ZmSus6和ZmSus7基因與甜玉米Sus I和Sus II基因亞家族成員（ZmSH1、ZmSus1和ZmSus3）可能存在不同的表達(dá)模式，參與不同的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

此外，本研究中ZmSus6和ZmSus7基因在根和葉中的相對(duì)表達(dá)量較高，尤其是ZmSus7基因在根中的相對(duì)表達(dá)量最高，說(shuō)明二者具有較強(qiáng)的組織表達(dá)特異性。Fan等（2019）研究表明，OsSus1～OsSus6基因在水稻中超表達(dá)后，均能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂和淀粉積累從而提高谷粒的大小和重量。Fan等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜CsSus4基因表達(dá)下調(diào)可抑制其花器官和果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育。Liu等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子ERF72可抑制木薯Sus1基因的表達(dá)，進(jìn)而影響根莖中淀粉的積累。由此可見(jiàn)，Sus不僅與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，還能影響其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。因此，在今后的研究中可通過(guò)構(gòu)建ZmSus6和ZmSus7超表達(dá)載體或突變體進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，從而揭示其參與甜玉米生長(zhǎng)發(fā)育、品質(zhì)形成等過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

ZmSus6和ZmSus7基因具有一定的組織特異性，其編碼蛋白可能在甜玉米生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)：

李余良，索海翠，韓福光，劉建華，胡建廣，高磊，李武. 2019. 基于SLAF-seq技術(shù)分析甜、糯玉米種質(zhì)遺傳多樣性[J]. 玉米科學(xué)，27（4）：71-78. [Li Y L，Suo H C，Han F G，Liu J H，Hu J G，Gao L，Li W. 2019. Analysis of genetic diversity of sweet and wax corn germplasms using SLAF-seq technology[J]. Journal of Maize Sciences，27（4）：71-78.]

林婕，于永濤，馬三梅，胡建廣. 2018. 玉米NAC轉(zhuǎn)錄因子基因ZmNAM的克隆及表達(dá)分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，32（5）：864-874. [Lin J，Yu Y T，Ma S M，Hu J G. 2018. Cloning and expression analysis of transcription factor gene ZmNAM in maize（Zea mays L.）[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，32（5）：864-874.]

呂文遠(yuǎn)，張玲，王延秀，高清華，段可. 2018. 草莓蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因FaSUT5對(duì)“申陽(yáng)”草莓果實(shí)糖分積累的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，30（8）：16-20. [Lü W Y，Zhang L，Wang Y X，Gao Q H，Duan K. 2018. Influence of strawberry sucrose transporter gene FaSUT5 on sugar accumulation in fruits of strawberry “Shenyang”[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（8）：16-20.]

趙云，李鵬兵，唐冬梅，林靜，馮寬，李衛(wèi)華. 2018. 花后高溫對(duì)小麥籽粒淀粉合成及相關(guān)酶活性的影響[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，55（2）：210-218. [Zhao Y，Li P B，Tang D M，Lin J，F(xiàn)eng K，Li W H. 2018. Effects of post-anthesis high temperature stress on starch synthesis and activities of related enzymes in wheat grain[J]. Xinjiang Agricultural Sciences，55（2）：210-218.]

Abdullah M，Cao Y P，Cheng X，Meng D D，Chen Y，Shakoor A，Gao J S，Cai Y P. 2018. The sucrose synthase gene family in Chinese pear（Pyrus bretschneideri Rehd.）：Structure，expression，and evolution[J]. Molecules，23（5）：1144.

An X M，Chen Z，Wang J C，Ye M X，Ji L X，Wang J，Liao W H，Ma H D. 2014. Identification and characterization of the Populus sucrose synthase gene family[J]. Gene，539（1）：58-67.

Baseggio M，Murray M，Magallanes-Lundback N，Kaczmar N，Chamness J，Buckler E S，Smith M E，DellaPenna D，Tracy W F，Gore M A. 2019. Genome-wide association and genomic prediction models of tocochromanols in fresh sweet corn kernels[J]. Plant Genome，12（1）：UNSP 180038.

Baud S，Vaultier M N，Rochat C. 2004. Structure and expre-ssion profile of the sucrose synthase multigene family in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany，55（396）：397-409.

Brzin J，Petrovic N，Ravnikar M，Kovac M. 2011. Induction of sucrose synthase in the phloem of phytoplasma infec-ted maize[J]. Biologia Plantarum，55（4）：711-715.

Cho J I，Kim H B，Kim C Y，Hahn T R，Jeon J S. 2011. Identification and characterization of the duplicate rice sucrose synthase genes OsSUS5 and OsSUS7 which are associated with the plasma membrane[J]. Molecules and Cells，31（6）：553-561.

Duncan K A，Hardin S，Huber S C. 2006. The three maize sucrose synthase isoforms differ in distribution，localization，and phosphorylation[J]. Plant Cell Physiology，47（7）：959-971.

Fan C F，Wang G Y，Wang Y M，Zhang R，Wang Y T，F(xiàn)eng S Q，Luo K M，Peng L C. 2019. Sucrose synthase enhances hull size and grain weight by regulating cell division and starch accumulation in transgenic rice[J]. International Journal of Molecular Sciences，20（20）：4971-4984.

Fan J W，Wang H Y，Li X，Sui X L，Zhang Z X. 2019. Down-regulating cucumber sucrose synthase 4（CsSUS4） suppresses the growth and development of flowers and fruits[J]. Plant and Cell Physiology，60（4）：752-764.

Galli V，Messias R D，Silva S D D E，Rombaldi C V. 2013. Selection of reliable reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction studies in maize grains[J]. Plant Cell Reports，32（12）：1869-1877.

Hardin S C，Huber S C. 2004. Proteasome activity and the post-translational control of sucrose synthase stability in maize leaves[J]. Plant Physiology and Biochemistry，42（3）：197-208.

Liu C，Chen X，Ma P A，Zhang S K，Zeng C Y，Jiang X Y，Wang B Q. 2018. Ethylene responsive factor MeERF72 negatively regulates sucrose synthase 1 gene in cassava[J]. International Journal of Molecular Sciences，19（5）：1281.

Moshchenskayaa Y L，Galibinaa N A，Novitskayaa L L，Nikerovaa K M. 2019. The role of sucrose synthase in sink organs of woody plants[J]. Russian Journal of Plant Physiology，66（1）：10-21.

Stein O，Granot D. 2019. An overview of sucrose synthases in plants[J]. Frontiers in Plant Science，10：95.

Strand A，F(xiàn)oyer C H，Gustafsson P，Gardestrom P，Hurry V. 2003. Altering flux through the sucrose biosynthesis pathway in transgenic Arabidopsis thaliana modifies photosynthetic acclimation at low temperatures and the develo-pment of freezing tolerance[J]. Plant，Cell and Environment，26：523-536.

Thirugnanasambandam P P，Mason P J，Hoang，N V，F(xiàn)urtado A，Botha F C，Henry R J. 2019. Analysis of the diversity and tissue specificity of sucrose synthase genes in the long read transcriptome of sugarcane[J]. BMC Plant Bio-logy，19：160.

Tong X L，Wang Z Y，Ma B Q，Zhang C X，Zhu L C，Ma F W，Li M J. 2018. Structure and expression analysis of the sucrose synthase gene family in apple[J]. Journal of Integrative Agriculture，17（4）：847-856.

Wan C Y，Wilkins T A. 1994. A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton（Gossypium hirsutum L.）[J]. Analytical Biochemistry，223（1）：7-12.

Wang Z，Wei P，Wu M Z，Xu Y L，Li F，Luo Z P，Zhang J F，Chen A，Xie X D，Cao P J，Lin F C，Yang J. 2015. Analysis of the sucrose synthase gene family in tobacco：Structure，phylogeny，and expression patterns[J]. Planta，242（1）：153-166.

Wei K F，Wang Y M，Xie D X. 2014. Identification and expression profile analysis of the protein kinase gene superfamily in maize development[J]. Molecular Breeding，33（1）：155-172.

Wei Y Y，Xu F，Shao X F. 2017. Changes in soluble sugar metabolism in loquat fruit during different cold storage[J]. Journal of Food Science and Technology-Mysore，54（5）：1043-1051.

Yang J，Zhang J，Wang Z，Zhu Q. 2001. Activities of starch hydrolytic enzymes and sucrose-phosphate synthase in the stems of rice subjected to water stress during grain filling[J]. Journal of Experimental Botany，52（36）：2169-2179.

Yang T R，Hu J G，Yu Y T，Li G K，Guo X B，Li T，Liu R H. 2019. Comparison of phenolics，flavonoids，and cellular antioxidant activities in ear sections of sweet corn（Zea mays L. saccharata Sturt）[J]. Journal of Food Processing and Preservation，43（1）：e13855.

Zhang C H，Yu M L，Ma R J，Shen Z J，Zhang B B，Korir N K. 2015. Structure，expression profile，and evolution of the sucrose synthase gene family in peach（Prunus persica）[J]. Acta Physiologiae Plantarum，37（4）：81.

Zhu X D，Wang M Q，Li X P，Jiu S T，Wang C，F(xiàn)ang J G. 2017. Genome-wide analysis of the sucrose synthase gene family in grape（Vitis vinifera）：Structure，evolution，and expression profiles[J]. Genes，8（4）：111.

（責(zé)任編輯 陳 燕）