分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用進展

劉婉彤，童梅，林福玉，高向東，劉金毅

1.中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.北京三元基因藥業(yè)股份有限公司，北京市長效干擾素工程技術(shù)研究中心，北京 102600

1 分子診斷技術(shù)

依據(jù)患者的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)等信息的個體化治療，可以提高患者的依從性，增強藥物療效，減少治療成本。分子診斷技術(shù)是用分子生物學(xué)方法針對人體及各種病原體的遺傳物質(zhì)的表達及結(jié)構(gòu)進行檢測，從而達到預(yù)測及診斷疾病的目的[1]，為個體化醫(yī)療提供數(shù)據(jù)支持。20世紀60年代，液相分子雜交法的建立意味著分子診斷時代的開啟。近年來分子診斷技術(shù)發(fā)展迅速，可大致分為以下4類技術(shù)。

1.1 基于核酸分子雜交技術(shù)的分子診斷技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是指不同來源的2條核酸單鏈，在一定條件下以堿基互補配對的原則特異性形成雙鏈，包括Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交、熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）等技術(shù)。其中FISH是應(yīng)用有熒光標(biāo)記的探針與靶片段形成雜交體，通過熒光檢測體系獲得待測DNA的相關(guān)數(shù)據(jù)，具備特異性強、檢測速度快的特點，在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會于1993年發(fā)布了應(yīng)用FISH進行產(chǎn)前診斷的相關(guān)說明[2]，F(xiàn)ISH技術(shù)在我國也應(yīng)用于臨床多年。FISH技術(shù)在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域作為核型分析技術(shù)的補充已成為專家共識[3]。

1.2 基于PCR技術(shù)的分子診斷技術(shù)

20世紀80年代，Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），即體外擴增目的核酸片段的技術(shù)。核酸擴增技術(shù)目前在臨床中應(yīng)用廣泛，至今已經(jīng)發(fā)展出多種PCR技術(shù)，包括熒光實時定量PCR（quantitativereal-timePCR，qPCR）、數(shù) 字 PCR（digital PCR，dPCR）等。qPCR技術(shù)由于操作過程在封閉體系中進行，降低了污染概率，并且可以通過對熒光信號監(jiān)測從而進行定量檢測，因此臨床應(yīng)用最為廣泛，已成為PCR中的主導(dǎo)技術(shù)[4]。dPCR也稱為單分子PCR，其原理是將單個核酸分子放在獨立的反應(yīng)單元中進行PCR擴增后，檢測反應(yīng)室終點熒光并進行分子計數(shù)統(tǒng)計實現(xiàn)定量分析。由于具備高靈敏度、高精確度的特點，不易被PCR反應(yīng)抑制劑干擾，無需標(biāo)準(zhǔn)品可實現(xiàn)真正意義的絕對定量，而成為研究熱點[5]。

1.3 基于基因芯片技術(shù)的分子診斷技術(shù)

基因芯片技術(shù)的原理是將大量已知序列的核酸探針固定在基片表面，再將其與靶核苷酸雜交，通過對探針的檢測獲得待測樣品的序列信息。依據(jù)探針的種類可將基因芯片分成2類，即cDNA微陣列芯片和寡核苷酸微陣列芯片[6]。前者的探針是細胞中特定的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成的相應(yīng)的cDNA，而后者的探針為原位合成的寡核苷酸片段。由于基因芯片技術(shù)具有自動化程度高、操作簡單、通量高等特點，在基因分型、基因表達、單核苷酸多態(tài)性檢測等方面均有廣泛應(yīng)用。

1.4 基于基因測序技術(shù)的分子診斷技術(shù)

基因測序技術(shù)始于1977年由Sanger發(fā)明的DNA雙脫氧鏈末端終止測序法，由于它的準(zhǔn)確率極高，因而被認為是基因測序的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但也同時因成本高、通量低而限制了其在臨床方面的應(yīng)用。進入21世紀后，基因測序技術(shù)快速發(fā)展，第二代及第三代測序技術(shù)相繼發(fā)明。第二代測序技術(shù)也稱高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)，相對于一代測序，它可以實現(xiàn)大規(guī)模平行測序，基本原理是將基因組分割成短片段，對短片段測序再進行拼接，具備檢測用時短、靈敏度高、通量高、經(jīng)濟等諸多優(yōu)勢，極大地推動了分子診斷在臨床檢測方面的應(yīng)用，也推進了基因組學(xué)的發(fā)展。HTS技術(shù)是目前臨床應(yīng)用最廣的測序技術(shù)。第三代測序技術(shù)主要是以單分子測序及納米孔測序為代表，如Oxford Nanopore公司開發(fā)的MinION納米孔測序技術(shù)，PacBio公司開發(fā)的SMRT測序技術(shù)等[7]。它無須核酸擴增，讀長明顯優(yōu)于HTS技術(shù)，可在基因組水平輔助個體化醫(yī)療，是未來發(fā)展的主要技術(shù)方向。

分子診斷方法在臨床各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，為疾病的預(yù)防、診斷、治療等提供了科學(xué)有效的檢測數(shù)據(jù)，其技術(shù)的革新同時大大推動了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

2 分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用

分子診斷技術(shù)在臨床上主要用于腫瘤、感染性疾病、遺傳性疾病等疾病的預(yù)防、診斷、治療方面，如表1所示。

表1 分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用

表1 分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用（續(xù)）

2.1 分子診斷技術(shù)在腫瘤中的臨床應(yīng)用

腫瘤的發(fā)生是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，惡性腫瘤的個體化與精準(zhǔn)醫(yī)療意義重大，分子診斷技術(shù)不僅有助于癌癥的預(yù)防與早期診斷，更在癌癥分子分型、預(yù)測預(yù)后、治療方案篩選等方面起作用。

FISH技術(shù)用于檢測染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的改變，而染色體的狀態(tài)與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。應(yīng)用FISH技術(shù)對特定染色體進行檢測可以預(yù)估癌癥的預(yù)后，Mian等[8]對81位尿路上皮癌（UC）患者長期隨訪，使用多色熒光原位雜交（multicolor-FISH，mFISH）技術(shù)對患者的9p21（p16）位點及3、7和17號染色體進行檢測，篩選膀胱癌復(fù)發(fā)高風(fēng)險人群并預(yù)估疾病發(fā)展。FISH技術(shù)也應(yīng)用于腫瘤診斷過程中。由于惡性黑色素瘤（MM）與痣的外觀相似，因而難以診斷，Uguen等[9]使用FISH和p16-Ki67-HMB45聯(lián)合免疫組化的方法建立了黑素細胞性腫瘤分類的輔助診斷方法。乳腺癌居于我國女性癌癥發(fā)病率首位，而HER-2基因?qū)θ橄侔┑闹委熂邦A(yù)后有重要價值，F(xiàn)ISH技術(shù)一直被視為檢測HER-2擴增的金標(biāo)準(zhǔn)，但近年來也不斷有新的核酸雜交方法應(yīng)用于HER-2基因的檢測中。Edelweiss等分別使用FISH技術(shù)、亮視野雙重原位雜交（bright-field dual in situ hybridization，DISH）及免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）方法對復(fù)發(fā)性及轉(zhuǎn)移性乳腺組織細胞塊的HER-2基因狀態(tài)進行檢測，3種方法檢測結(jié)果一致，但DISH可以同時對腫瘤組織形態(tài)及基因拷貝數(shù)進行評估，DISH與IHC聯(lián)用代替FISH進行檢測，結(jié)果更可靠，并且克服了FISH檢測的繁瑣、切片不能長時間保存等缺點[10]。

核酸擴增技術(shù)，尤其是熒光定量PCR技術(shù)以其獨有優(yōu)勢在腫瘤治療中應(yīng)用廣泛。頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是常見的癌癥之一，多項研究表明人乳頭瘤病毒（HPV）感染是其致病因素之一。Polanska等[11]收集了74例原發(fā)性HNSCC組織樣本，應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）對15種HNSCC相關(guān)分子標(biāo)志物進行分析，同時應(yīng)用PCR技術(shù)對HPV進行檢測，研究證實HPV陰性與HPV陽性的HNSCC患者中常見生物標(biāo)記物MT2A、MMP9、FLT1、VEGFA和POU5F的表達有一定差異，這對預(yù)估HNSCC患者的疾病發(fā)展及生存率有重要意義。

腫瘤的液體活檢由于具備方便、快捷、非侵入性等優(yōu)勢，利于動態(tài)監(jiān)測惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通常用于檢測和分析的生物標(biāo)志物有循環(huán)腫瘤 DNA（circulatingtumor DNA，ctDNA）、microRNA（miRNA）、循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）等。通過 ctDNA 及 CTCs進行基因突變的檢測已廣泛用于臨床，但由于這些分子標(biāo)志物含量普遍較低，因而要求檢測方法具備更高的靈敏度。dPCR檢測靈敏度可達0.0001%～0.001%[12]，在腫瘤液體活檢領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。Boonstra等[13]建立了一種應(yīng)用液滴數(shù)字PCR（ddPCR）分別檢測胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）患者腫瘤組織及ctDNA的KIT外顯子11、9突變的方法，尤其是基于ctDNA的檢測方法的建立，對GIST早期治療及疾病監(jiān)測更有意義。Hirano等[14]也建立了在源自腦脊液的ctDNA中檢測IDH1基因突變的ddPCR方法，從而確定神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分類。

基因芯片可以高通量獲取基因表達譜，在腫瘤的臨床治療中用于研究分子機制及生物標(biāo)記物以輔助個體化治療。應(yīng)用微陣列比較基因組雜交芯片（array-compare genomic hybridization，aCGH）技術(shù)檢測基因拷貝數(shù)變化（copy number variation，CNV），可以探尋癌癥發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)分子機制。Seabra等應(yīng)用aCGH技術(shù)獲取了22位腸型胃腺癌患者的全基因組DNA拷貝數(shù)，分析CNV對癌癥發(fā)展的影響，旨在找到關(guān)鍵基因，為胃癌治療尋找潛在靶點[15]。Jin等也應(yīng)用aCGH技術(shù)研究與朝鮮族胃癌發(fā)病相關(guān)的CNV，發(fā)現(xiàn)7p22.1、13q34和17p13.3的CNV可能是朝鮮族胃癌患者獨有的[16]。aCGH技術(shù)還可以和其他分子診斷技術(shù)聯(lián)合使用預(yù)估腫瘤的預(yù)后。惡性周圍神經(jīng)鞘瘤（MPNST）是罕見且預(yù)后極差的軟組織肉瘤，Zhou等綜合應(yīng)用aCGH、FISH、IHC技術(shù)對成纖維細胞生長因子受體（FGFR）家族的FGFR1～4基因及蛋白表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)不同的FGFR對MPNST的預(yù)后影響不盡相同，有利于今后開發(fā)治療MPNST的靶向藥物[17]。

特定基因的突變會增加腫瘤發(fā)生的幾率，通過基因測序技術(shù)對癌癥高風(fēng)險人群進行基因檢測，可以及早采取措施干預(yù)疾病的發(fā)生或減緩疾病進程。BRCA1/2基因突變的女性罹患卵巢癌、輸卵管癌、腹膜癌和乳腺癌的風(fēng)險大大增加，一項研究招募了來自43個多國中心的8000余名女性，應(yīng)用DNA直接測序技術(shù)對樣本進行基因測序，篩選出5783名BRCA1或BRCA2突變的女性進行前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)防性卵巢切除術(shù)確實可以使BRCA1或BRCA2攜帶者的癌癥發(fā)生率及死亡率大幅度降低[18]。

與此同時，由于HTS技術(shù)高靈敏度的特性，在腫瘤液體活檢中也應(yīng)用廣泛。肺癌是我國男性中發(fā)病率最高的癌癥，其中主要的發(fā)病類型為非小細胞肺癌（NSCLC），而在NSCLC靶向治療中，基因突變的檢測必不可少。Dono等收集了42例患者血漿樣本，用HTS技術(shù)對血漿ctDNA中EGFR基因20外顯子T790M的突變進行檢測，以評估已經(jīng)對第一、二代EGFR-TKI治療產(chǎn)生耐藥性的患者能否繼續(xù)接受第三代EGFR-TKI藥物奧西替尼的治療，該研究發(fā)現(xiàn)由于HTS極高的靈敏度及檢出率，使得液體活檢更有效地代替了組織檢測，提高了患者依從性[19]。胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是一種預(yù)后較差的腫瘤，KRAS基因突變與其預(yù)后密切相關(guān)，有研究用下一代測序技術(shù)針對17名PDAC患者ctDNA中的KRAS基因進行分析，證實了KRAS突變與PDAC不良預(yù)后的相關(guān)性，測序技術(shù)對ctDNA的分析使得對腫瘤疾病的有效動態(tài)監(jiān)測成為現(xiàn)實，可以更好地預(yù)測患者疾病進展情況[20]。

此外，新一代測序技術(shù)也應(yīng)用于腫瘤治療中。Krieg等應(yīng)用高維單細胞大規(guī)模流式細胞儀進行單細胞RNA測序（RNA-seq），以預(yù)測抗PD-1免疫療法對黑色素瘤的治療效果。獲取黑色素瘤患者外周血單核細胞，對免疫細胞亞群進行研究，發(fā)現(xiàn)治療前CD14+CD16-HLA-DRhi單核細胞是抗PD-1免疫治療效果的預(yù)測指標(biāo)[21]。

2.2 分子診斷技術(shù)在遺傳病中的臨床應(yīng)用

《中國出生缺陷預(yù)防報告》的數(shù)據(jù)顯示，我國每年約有100萬新生兒患有出生缺陷，而遺傳是造成先天缺陷的因素之一。遺傳病是因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變或致病基因控制導(dǎo)致的疾病，一般分為染色體綜合征、單基因遺傳病及多基因遺傳病。近年來，分子診斷技術(shù)在遺傳病診斷、新生兒篩查等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

染色體綜合征主要是由于染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常而導(dǎo)致，常常涉及多個器官組織的功能異常，甚至直接發(fā)展成死胎。以往產(chǎn)前染色體病診斷手段主要以羊水的核型分析為主，分辨率低，檢測周期長，且成功率并不高。相比之下，F(xiàn)ISH技術(shù)能同時檢測多條染色體，用時短，在產(chǎn)前診斷中得到了廣泛應(yīng)用。FISH技術(shù)常與其他診斷技術(shù)聯(lián)合使用以提高檢測靈敏度及準(zhǔn)確性。在林少賓等的研究中，聯(lián)用FISH技術(shù)、單核苷酸多態(tài)性芯片（SNP-array）技術(shù)與G顯帶核型分析，探究胎兒神經(jīng)纖維瘤Ⅰ型（NF1）的基因型與疾病之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)胎兒染色體17q11.2區(qū)域存在缺失是NF1發(fā)生的原因，研究還對患兒父母的外周血進行了FISH檢測，確定胎兒所攜帶的基因缺失是新突變[22]。蔡美英等將BACs-on-Beads技術(shù)與FISH技術(shù)聯(lián)用，作為一種新的檢測22q11微缺失的方法[23]。

除了傳統(tǒng)的FISH技術(shù)外，新型技術(shù)也在逐步應(yīng)用于臨床。mFISH是一種通過使用多種不同的配體或熒光色體進行DNA特定標(biāo)記的技術(shù)。Murakami等應(yīng)用mFISH方法針對Pallister-Killian綜合征（PKS）進行了產(chǎn)前診斷。PKS是由于組織特異性嵌合等臂12p染色體所導(dǎo)致的遺傳病，研究者通過羊膜穿刺法獲取臍帶淋巴細胞標(biāo)本，用mFISH進行染色體分析并診斷[24]。Pietrzyk等采用微流體FISH（microfluidics-FISH）技術(shù)進行染色體非整倍性檢測，與傳統(tǒng)FISH相比，這種方法檢測快速，更加高效[25]。

在產(chǎn)前診斷中，PCR技術(shù)因能對靶片段指數(shù)擴增并呈高度特異性雜交，應(yīng)用最為廣泛。染色體多態(tài)性位點的短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）作為遺傳標(biāo)記，經(jīng)PCR擴增獲得DNA二維圖譜，根據(jù)圖譜上正常人與患者峰值的差異可以進行診斷。迄今已有大量研究采用STR與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（QFPCR）聯(lián)用的方法進行胎兒非整倍體的產(chǎn)前診斷。秦勝芳等收集6066份羊水，通過對 13、18、21、X和Y染色體上的STR進行QFPCR檢測，檢出135例染色體數(shù)目異常，與核型分析結(jié)果一致[26]。Kozaric等比較了QFPCR與核型分析的優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)在針對常見染色體非整倍性的檢測中，QFPCR方法更加快速且可靠，但在其他染色體異常的檢測中，2種診斷手段應(yīng)結(jié)合使用[27]。

傳統(tǒng)的侵入性診斷有母系污染的可能，對于診斷有一定影響，此外也有造成流產(chǎn)的風(fēng)險。為了解決這些問題，無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（non-invasive prenatal testing，NIPT）得到迅速發(fā)展，ddPCR因其高敏感度在NIPT領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。一項針對21三體綜合征的前瞻性研究中，對213名孕婦同時進行侵入性診斷及NIPT，在DNA含量低至5%時，ddPCR仍能準(zhǔn)確檢測出異常，成功開發(fā)了一種基于ddPCR的NIPT手段[28]。Chang等利用ddPCR及基于芯片的dPCR技術(shù)開發(fā)了一種診斷單基因疾病的NIPT方法，該方法通過母體外周血中的游離DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）即可預(yù)測胎兒基因型[29]。

多重連接依賴探針擴增（multiples ligationdependent probe amplification，MLPA）是一種高靈敏的相對定量技術(shù)，通過探針和靶DNA的雜交，擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳分析，主要用于檢測基因片段的缺失和重復(fù)或檢測染色體數(shù)目。它具備信息量大、操作簡便、重復(fù)性好的優(yōu)點。高通量連接探針擴增技術(shù)（HLPA）是MLPA技術(shù)的改良，Xu等應(yīng)用HLPA對1182名孕婦進行了唐氏綜合征的篩查，開發(fā)了一種成本低、效率高的非整倍性檢測新方法[30]。

基因芯片作為一種新興技術(shù)，正逐步取代核型分析在產(chǎn)前診斷的地位。aCGH技術(shù)能在全基因組水平快速檢出染色體CNV，同時檢測出變異來源。Chong等應(yīng)用aCGH技術(shù)對1000余例超聲檢查異常的胎兒進行產(chǎn)前診斷，由于aCGH芯片技術(shù)的高分辨率，其與超聲檢查聯(lián)合應(yīng)用將提高檢測的準(zhǔn)確性[31]。SNP-array技術(shù)主要用于SNP位點的基因分型及全基因組關(guān)聯(lián)分析，與aCGH相比，SNP-array的分辨率更高。Schwartz等應(yīng)用SNP芯片技術(shù)對349份母體cfDNA進行檢測，以篩查1p、4p、5p、15q及22q的微缺失，研究結(jié)果表明SNP-array技術(shù)可以為產(chǎn)前診斷及時提供有效信息，提高檢測效率[32]。郭依琳等同樣通過SNP-array對904例超聲檢測異常的胎兒進行了檢測，SNP-array對于染色體異常的檢出率遠高于傳統(tǒng)的核型分析，的確有著更高的分辨率和準(zhǔn)確率[33]。

高通量測序技術(shù)可一次性對幾十萬到幾百萬的DNA分子進行序列測定，是當(dāng)前最熱門的技術(shù)之一。對于染色體非整倍體疾病的檢測，可以通過HTS對母體cfDNA進行測序，利用生物信息工具分析外周血中不同染色體的差異，從而對胎兒染色體出現(xiàn)的非整倍體變化進行精準(zhǔn)識別。Bianchi等應(yīng)用HTS進行了大規(guī)模平行測序，對美國21個中心的1914名妊娠女性血液樣本進行三體21和18的檢測，與傳統(tǒng)篩查方法相比，HTS技術(shù)假陽性率降低顯著，準(zhǔn)確率高[34]。

染色體微缺失微重復(fù)綜合征是由于染色體片段的部分缺失或重復(fù)所致，如貓叫綜合征、Di-George綜合征等。此類疾病以往常用基因芯片技術(shù)進行檢測，而HTS可以一次分析23對染色體的染色體非整倍體以及CNV，為該類疾病提供了新的診斷方法。Desheng等[35]分別用SNP-array以及大規(guī)模平行CNV測序評估患者樣品中的CNV，結(jié)果表明對于致病性的CNV，兩者都能準(zhǔn)確檢出，而在一些未知CNV的檢測上，HTS的檢出率要比SNP-array高。

單基因遺傳病的臨床癥狀表現(xiàn)多樣，治療率并不高，最有效的方法還是通過產(chǎn)前診斷及時檢測從而避免。HTS基于大規(guī)模測序和數(shù)據(jù)分析，有效解決了單基因遺傳病突變率高、常規(guī)分析的片段要求嚴格及全基因分析工作量大等問題。譚梅等應(yīng)用HTS技術(shù)對206名新生兒進行地中海貧血的致病基因檢測，HTS不僅可以有效檢測地中海貧血的基因類型，而且可以尋找新的基因突變，對地中海貧血進行早期診斷[36]。Wei等使用HTS檢測Hermansky-Pudlak（HPS）綜合征，這是一種常染色體隱性遺傳病，可導(dǎo)致出血時間延長、白化病、溶酶體膠質(zhì)樣沉積等病狀。Wei篩選了100例色素沉著不足的基因，在10例HPS病例中確定了14種新突變，證明了基于HTS的HPS診斷的可行性和實用性[37]。

2.3 分子診斷技術(shù)在感染疾病中的臨床應(yīng)用

感染性疾病是因人體感染細菌、病毒、真菌等病原微生物而引起的疾病。WHO統(tǒng)計顯示，每年有1700萬人死于感染性疾病。傳統(tǒng)的病原診斷耗時長、精準(zhǔn)性低，而分子診斷更加快速、準(zhǔn)確，使得疾病能得到及早治療、控制病毒蔓延，是病原體檢查的主要發(fā)展趨勢。

在感染性疾病的診斷中，F(xiàn)ISH技術(shù)通過特異性探針對病原體快速診斷并鑒定，在檢測病毒基因組在被感染細胞中的位置及病理切片中的微生物等方面都有所應(yīng)用。Kaufer介紹了一種用FISH檢測皰疹病毒基因組的方法。一些皰疹病毒如人類皰疹病毒6（HHV-6）和馬立克病病毒（MDV），已被證明可以將其遺傳物質(zhì)整合到宿主染色體中，Kaufer應(yīng)用FISH技術(shù)可以在MDV感染細胞的中期染色體中檢測到整合的皰疹病毒基因組，從而對病毒感染過程進行可視化分析[38]。呂治等對33例細菌性陰道?。˙V）患者和28例正常對照組分別進行FISH檢測和革蘭染色檢測，F(xiàn)ISH評分診斷方法在敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值等方面均優(yōu)于革蘭染色評分診斷方法[39]。FISH技術(shù)在監(jiān)測感染性單核細胞增多癥（IM）患者EB病毒（EBV）載量方面具有優(yōu)勢。Cao等針對EBV進行檢測，比較了分子診斷方法（FISH和EBV實時PCR）與血清學(xué)檢測，結(jié)果表明分子診斷方法的靈敏度更高，且FISH方法與PCR檢測相比，能反映患者體內(nèi)循環(huán)的絕對病毒負荷，更適于EBV拷貝數(shù)的檢測[40]。

PCR技術(shù)既可以檢測疾病中的毒力因子、致病因子或變異因子，也可以測定病原體的DNA和RNA，在檢測出病因的同時，還可以對病原體進行基因分型和耐藥性檢測，因此應(yīng)用廣泛。常規(guī)PCR檢測的病原單一，對于臨床上各種混合感染的檢測較為困難。而多重PCR（mPCR）技術(shù)可以解決這一問題。張海鄰等利用mPCR技術(shù)對兒童下呼吸道感染的病原體進行快速檢測，這對于后期的指導(dǎo)用藥有很高的臨床價值[41]。Hu等則建立了一種基于EvaGreen MCA的mPCR技術(shù)，這是一種用于檢測呼吸道細菌病原體的高靈敏、高通量和低成本的特異性方法[42]。

基因芯片具備高度集成核酸探針的特性，可以高通量檢測病原體。Martínez等應(yīng)用DNA芯片檢測了胃腸道病毒，研究者針對已經(jīng)報道的胃腸炎有關(guān)或在胃腸道中發(fā)現(xiàn)的所有病毒制備了微陣列芯片，并對76例胃腸炎兒童臨床樣本進行檢測，檢測率達92%，同時檢測出了共感染。與RTPCR分析相比，微陣列的另一個優(yōu)勢是能夠識別罕見病毒[43]。Liu等開發(fā)了一種應(yīng)用基因芯片技術(shù)，檢測與中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相關(guān)的人皰疹病毒和腸病毒。作者以人皰疹病毒的DNA聚合酶基因和腸病毒的5'-UTR為靶基因設(shè)計引物和探針，在臨床樣本檢測中，微陣列對所有病毒的檢測特異性都在96%以上，靈敏度稍有偏差[44]。此外，基因芯片在檢測抗生素抗性（ABR）基因中也有應(yīng)用。Wolff開發(fā)了一種基于微陣列檢測ABR的方法，研究者基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TDT）反應(yīng)設(shè)計了微陣列芯片，結(jié)果表明此方法與商業(yè)化檢測相比，特異性與靈敏度沒有顯著差異，但成本顯著降低[45]。

高通量測序因其準(zhǔn)確性高、周期短、通量大，而作為發(fā)現(xiàn)病原體的有力工具被廣泛使用?？梢詰?yīng)用高通量測序?qū)δ退幓蜻M行分析。丁月平等應(yīng)用全基因組測序技術(shù)（WGS）對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）進行測序及耐藥基因篩選，共發(fā)現(xiàn)48種耐藥基因，這為CRKP的治療與防控提供了科學(xué)依據(jù)[46]。

2020年肆虐的新型冠狀病毒病（COVID-19）將感染性疾病推到了大眾視野面前，在COVID-19的檢測中，廣泛應(yīng)用了HTS技術(shù)。張永振與Holmes教授應(yīng)用HTS對一名新冠肺炎患者的支氣管肺泡灌洗液樣品進行檢測，首次獲得了新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）完整基因組并上傳到GenBank（MN908947），這對COVID-19的防治和研究意義重大[47]。Kim等收集了韓國的COVID-19患者的鼻咽樣本，分離病毒后接種到Vero細胞中，提取病毒RNA合成cDNA，構(gòu)建NGS文庫，分析結(jié)果表明該病毒序列與先前報道的SARSCoV-2序列包含在同一簇中，并且與SARS-CoV-2序列有高度同源性（＞99.5%）[48]。宏基因組學(xué)下一代測序（mNGS）方法能快速鑒定病原體，是信息時代病毒診斷的趨勢，針對從不同患者來源獲取的樣本進行測序，還可以追溯SARS-CoV-2的起源并對病毒變異進行研究。Chen等[49]通過mNGS技術(shù)對COVID-19進行了鑒定，研究者對2名患者進行常規(guī)呼吸道病原體檢測，結(jié)果均為陰性，應(yīng)用SARS-CoV特異性RT-PCR分析，僅有一組產(chǎn)生了陽性結(jié)果，應(yīng)用mNGS技術(shù)進行測序后比對才確認該病毒并不是SARS-CoV，而是一種新型冠狀病毒即SARS-CoV-2，并且2名患者的檢測樣本中共有基因組序列是相同的，說明他們感染的是同一種病毒。

此外，也有大量RT-PCR試劑盒被開發(fā)用于COVID-19檢測。武漢大學(xué)中南醫(yī)院強烈推薦應(yīng)用RT-PCR法檢測SARS-CoV-2基因組作為呼吸道病原學(xué)檢測的方法[50]。香港大學(xué)和大興疾病預(yù)防控制中心設(shè)計了2個靶向COVID-19的高度保守的ORF1b和N基因區(qū)域的實時RT-PCR檢測方法，并應(yīng)用了一組陽性和陰性對照評估了測定，還對2例疑似患者進行了檢測，結(jié)果為陽性[51]。武漢市金銀潭醫(yī)院和上海交通大學(xué)在對武漢市99例COVID-19患者進行分析，應(yīng)用實時RT-PCR對病人上呼吸道咽拭子樣本進行檢測[52]。中國疾病預(yù)防控制中心也發(fā)表了關(guān)于COVID-19的早期調(diào)查，同樣是通過分離病毒提取核酸，采用RTPCR技術(shù)檢測病毒RNA[53]。當(dāng)然，由于PCR的高靈敏度，PCR檢測會出現(xiàn)因樣品污染而導(dǎo)致的假陽性現(xiàn)象，或是因樣品質(zhì)量不佳或病毒基因組在探針處變異而導(dǎo)致的假陰性現(xiàn)象。所以目前臨床上也采用血清學(xué)檢測進行輔助診斷，如酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠體金法等。

綜上所述，分子診斷的臨床廣泛應(yīng)用對疾病預(yù)防、診斷、預(yù)估預(yù)后、制定個體化醫(yī)療方案等起著促進作用。隨著我國人口老齡化的進程，癌癥、慢性病等發(fā)病率會持續(xù)升高，同時國民健康意識也在逐漸提升。分子診斷技術(shù)將呈現(xiàn)自動化趨勢，以減少人工消耗，降低成本，檢測結(jié)果自動化判讀也會減低人工誤差。同時，單分子技術(shù)的突破也使得檢測高靈敏度成為分子診斷技術(shù)未來發(fā)展趨勢，提升檢測效率。另外，無創(chuàng)檢測及微創(chuàng)檢測等檢測手段會提高患者依從性，利于分子診斷技術(shù)在臨床中的進一步推廣和應(yīng)用。未來幾年，分子診斷技術(shù)將更加廣泛地應(yīng)用到體檢、重大疾病早期診斷、預(yù)防及治療中。